全 文 ：·化学成分·
桔梗细胞悬浮培养体系对斑蝥素的生物转化研究
叶　敏 ,戴均贵 ,果德安
(北京大学药学院 中医药现代研究中心 ,北京　 100083)
摘　要: 目的　研究桔梗细胞悬浮培养体系对抗癌天然活性成分斑蝥素的生物转化 ,以获得具有新颖结构的斑蝥
素衍生物。 方法　往桔梗悬浮培养体系中加入斑蝥素并培养 6 d,培养液经萃取后采用色谱方法进行分离纯化 ,产
物的结构根据光谱数据予以鉴定。结果　分离得到了以 2∶ 1比例混合存在的两个转化产物。 经光谱分析 ,两个产
物鉴定为羰基还原为羟基的一对差向异构体 1β -羟基斑蝥素 (Ⅱ a )及 1α-羟基斑蝥素 (Ⅱ b)。 结论　Ⅱ a和Ⅱ b均为
未见报道的新化合物。 桔梗细胞培养体系对斑蝥素具有较强的选择性还原作用 ,此转化反应可用于斑蝥素衍生物
的制备。
关键词: 斑蝥素 ;桔梗 ;细胞悬浮培养 ;生物转化
中图分类号: R284. 1　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 10 0869 03
Biotransformation of cantharidin by cell suspension cultures of Platycodon grandiflorus
YE Min, DAI Jun-gui , GUO De-an
( School of Pha rmaceutical Sciences and Modern Resea rch Cente r fo r T raditional Chinese
M edicine , Peking Univ e rsity , Beijing 100083, China)
Abstract: Object　 To investigate the bio transforma tion of cantharidin by cell suspension cultures of
Platycodon grandi f lorus ( Jacq. ) A. DC. Methods　 Cantharidin w as added into cel l suspension cultures of
P . grandi f lorus and incuba ted for another six days. The culture superna tant was ex t racted w ith EtO Ac
and then subjected to silica g el chromatog raphy. Results　 Tw o products w ere iso lated as a mix ture in a
molar ratio of about 2∶ 1. Their st ructures w ere identi fied on the basis o f spect roscopic da ta as 1β -OHcan-
tharidin (Ⅱ a ) and 1α-OH cantharidin (Ⅱ b ) . The rela tiv e configuration was elucidated according to
NO ESY spect rum. Conclusion　 The tw o products w ere new cantha ridin deriv ativ es.
Key words: cantharidin; Platy codon grandif lorus ( Jacq. ) A. DC. ; cell suspension cul ture; bio t rans-
forma tion
　　斑蝥为芫青科昆虫南方大斑蝥 Mylabris
phalerata Pallas或黄黑小斑蝥 M. cichori i Lin-
naeus的干燥体 ,属传统中药 ,早在《神农本草经》中
就有记载。具有破血消 、攻毒蚀疮等功效 ,中医临
床用于治疗 瘕肿块、积年顽癣等病症 [1 ]。现代研究
表明 ,斑蝥的主要有效成分为斑蝥素 ( cantha ridin)。
该成分具有显著的抗肿瘤活性 ,对原发性肝癌、腹水
型肝癌、 S180实体瘤等均具有显著疗效 ,其机制主要
是通过诱导细胞调亡 [2 ]。与一般抗肿瘤药物不同的
是 ,斑蝥素在抑制肿瘤的同时 ,还可促进骨髓产生白
细胞 [3 ]。因此 ,这类成分的深入研究对于发现新型抗
肿瘤药物具有重要意义。但是 ,临床观察表明斑蝥素
对黏膜组织表现出强烈的毒性和刺激作用 ,尤其是
胃肠道、尿道和肾脏 [4 ]。这些不良反应严重影响了斑
蝥素的临床应用。迄今 ,有机化学家已合成了大量的
斑蝥素衍生物 ,以期发现更为安全有效的药物。此类
研究主要是针对于斑蝥素结构中的桥头碳原子以及
酸酐键的开裂 [5～ 7 ]。遗憾的是 ,此类衍生物的抗肿瘤
活性大多不太理想。
生物转化是利用生物体系产生的酶对外源化合
物进行的酶催化反应。由于通过生物转化往往能得
到化学合成难以获得的新颖结构 ,此技术在天然产
物及其他有机化合物的结构改造研究中已显得越来
越重要 [ 8]。斑蝥素的生物转化目前尚未见到报道。本
·869·中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 10期 2003年 10月
收稿日期: 2002-12-16基金项目:国家杰出青年基金 ( 39925040) ;教育部跨世纪优秀人才基金
* 通讯作者　　 Tel: ( 010) 62091516　　 E-mai l: gda@ bjmu. edu. cn
文采用桔梗细胞悬浮培养体系 ,对斑蝥素这一来源
于动物的天然活性成分进行了生物转化研究。
1　材料与试剂
1. 1　仪器与试剂: Ava tar 360型傅里叶红外光谱仪
测定 ; Bruker DRX- 500型核磁共振仪测定 ; M S为
Finnigan M AT- 90及 Bruker BIFLEX Ⅲ型质谱
仪。柱色谱用硅胶 ( 200～ 300目 )购自青岛海洋化工
厂。石油醚 ( 60℃～ 90℃ ) ,醋酸乙酯 ,丙酮均为分
析纯 ,北京化工厂产品。
1. 2　药品 (底物 ):斑蝥素购自中国药品生物制品检
定所 ,用前以丙酮溶解 ,配成 5 mg /mL的溶液。
1. 3　细胞培养:桔梗细胞悬浮培养体系诱导自桔梗
Platycodon grandi f lorus ( Jacq. ) A. DC. 的幼嫩叶
和茎段。细胞体系的建立及培养参照文献 [9 ]。所用培
养基为 M S培养基 ,另加 0. 5 mg /L N AA (α-萘乙
酸 ) , 0. 5 mg /L 6-BA( 6-苄基腺嘌呤 ) , 0. 2 mg /L 2,
4-D( 2, 4-二氯苯氧乙酸 )及 3%蔗糖。培养基于灭菌
前调 pH值为 5. 8。继代时往 500 mL三角瓶 (盛 200
m L培养基 )中接入约 2. 0 g /L细胞 (干重 ) ,于黑暗
条件下室温振荡培养 ,摇床转速为 110 r /min,每两
周继代一次。
2　实验方法
2. 1　转化反应预试: 往预培养 4 d的桔梗悬浮细胞
( 500 mL)中加入 5 mg /mL斑蝥素丙酮溶液 0. 5
m L,继续培养 6 d后 ,用等体积醋酸乙酯萃取 3次 ,
萃取液合并 , 40℃减压浓缩至干 ,残渣以 1 mL丙酮
溶解 ,作为样品溶液。 取该溶液进行硅胶薄层色谱 ,
T LC条件为石油醚 -丙酮 ( 4∶ 1) ,展开后挥尽展开
剂 ,置碘蒸汽中显色 ,斑蝥素与产物均呈淡黄色斑
点。另设对照组 ,往桔梗悬细胞中加入等量丙酮 ,其
余操作同前。
2. 2　制备生物转化试验:往预培养 4 d的桔梗悬浮
培养细胞中加入 5 mg /mL斑蝥素丙酮溶液 1. 0
m L,共用 4瓶细胞。同 2. 1所述 ,继续培养 6 d后用
醋酸乙酯萃取 ,浓缩所得残渣以丙酮溶解 ,与少量硅
胶拌合 ,晾干。 该样品行硅胶柱色谱 ( 200～ 300目 ,
10 g , 1. 5 cm× 25 cm) ,洗脱剂为石油醚-丙酮 ( 4∶
1) ,分别得到无色细针状结晶Ⅰ ( 3 mg )和Ⅱ ( 8 mg ,
得率 40% )。
3　结果与讨论
在转化预试验中 ,样品液经 TLC分析 ,用碘蒸
汽显色 ,薄层板上在与斑蝥素相应的位置 ( Rf 0. 40)
及其下方 ( Rf 0. 25)处均呈淡黄色斑点 ,而在对照组
样品中则未见相应斑点 ,表明斑蝥素在桔梗悬浮培
养体系中有转化反应发生。
往桔梗悬浮培养体系中投入 20 mg斑蝥素 ,进
行制备转化试验 ,细胞液经提取分离 ,得到 3 mg未
转化的底物斑蝥素Ⅰ ,以及 8 mg产物Ⅱ。其结构根
据光谱数据予以鉴定 (图 1)。
图 1　桔梗细胞悬浮培养体系对斑蝥素的生物转化反应
Fig. 1　 Biotransformation of cantharidin by cell
suspension culture of P . grandiflorus
图 2　化合物Ⅱ b
的 主 要
NOE增益
关系
Fig. 2　 KeyNOE
correla-
tions for
compound
Ⅱ b
TOF-M S显示其 [M+ H ]+
峰为 199. 1 m /z ,表明Ⅱ的相对分
子质量为 198,比斑蝥素大 2。 其
1
H-NMR与 13 C-NM R谱中信号均
以大约 2∶ 1的比例成对出现 ,提
示Ⅱ为摩尔比为 2∶ 1的一对异
构体混合物 ,二者结构非常相似 ,
其中量大者为Ⅱ a,量小者为Ⅱ b。
1
H-NMR谱中 ,Ⅱ a和Ⅱ b均呈现
出二个甲基氢信号 ,表明其结构
已失去了斑蝥素的对称性。 在
13
C-NMR谱中 ,Ⅱ a ,Ⅱ b均仅见一
个酯羰基信号 ,而分别在 δ105. 4
和δ103. 2出现两个饱和叔碳信号。 根据 HSQC
谱 ,其对应的氢信号分别为 δ5. 37( 1H, s)和 δ5. 61
( 1H, s) ,可推断此为同时与两个氧原子相连的碳。
据此 ,可确定Ⅱ a和Ⅱ b为羰基还原为羟基的斑蝥素
衍生物 ,二者结构的差别仅在于羟基的构型不同。根
据 NOESY谱 ,Ⅱ b的 H-1信号 (δ5. 61)与 H-7
(δ4. 36)有 NOE增益 ,表明 H-1处于 β构型 ,即Ⅱ b
为 1α-OH衍生物 ,则Ⅱ a为 1β -OH衍生物 (图 2)。
Ⅱ a中 H-1(δ5. 37)与 8-CH3 (δ1. 09)之间的 NOE增
益亦证明其 H-1处于α构型。据以上推导 ,Ⅱ a的结
构鉴定为 1β-羟基斑蝥素 ( 1β -OH cantha ridin) ,Ⅱ b
为 1α-羟基斑蝥素 ( 1α-OH cantharidin) ,二者均为新
化合物 ,其 1H-NM R, 13 C-NMR信号根据 DEPT,
HSQC及 HMBC谱予以归属 [1 0]。
Ⅱ a: 1H-NM R( 500 M Hz, CDCl3 ,δ): 5. 37( 1H,
s, H-1) , 4. 73( 1H, d, J= 4. 5 Hz, H-7) , 4. 58( 1H, d,
J= 4. 5 Hz, H-4) , 1. 6～ 1. 8 ( 4H, m , H-5, H-6) ,
1. 13( 3H, s, 9-CH3 ) , 1. 09( 3H, s, 8-CH3 ) ;
13
C-NMR
( 125 MHz, CDCl3 ,δ): 179. 9( s, C-3) , 105. 4 ( d, C-
·870· 中草药　 Chinese T raditional and Herba l D rugs　第 34卷第 10期 2003年 10月
1) , 83. 2( d, C-4) , 82. 1( d, C-7) , 54. 1( s, C-7a) , 52. 4
( s, C-3a ) , 24. 2( t , C-6) , 22. 5( t , C-5) , 15. 4( q, C-
8) , 14. 5( q, C-9)。
Ⅱ b: 1H-NMR( 500 MHz, CDCl3 ,δ): 5. 61( 1H,
s, H-1) , 4. 51( 1H, d, J= 5. 0 Hz, H-4) , 4. 36( 1H, d,
J= 5. 0 Hz, H-7) , 1. 6～ 1. 8 ( 4H, m, H-5, H-6) ,
1. 14( 3H, s, 9-CH3 ) , 1. 01( 3H, s, 8-CH3 ) ;
13
C-NMR
( 125 M Hz, CDCl3 ,δ): 179. 9 ( s, C-3) , 103. 2( d, C-
1) , 86. 5( d, C-7) , 84. 5( d, C-4) , 55. 2( s, C-7a) , 52. 2
( s, C-3a ) , 24. 1( t , C-5) , 23. 5( t , C-6) , 13. 1( q, C-
9) , 11. 2 ( q, C-8 ) ; EI-M S (m /z , rel. int. ): 169
( 7. 1) , 153( 4. 5) , 112( 62. 3) , 96( 100. 0) ; TO F-M S
(m /z ): 199. 1[M+ H ]
+ 。
图 3　化合物Ⅲ的
化学结构式
Fig. 3　 Chemical
structure
of com-
poundⅢ
Ⅱ a及Ⅱ b结构中的 1-OH
属半缩醛羟基 ,性质活泼 ,在溶
液状态下易发生翻转 ,故二者以
混合物的形式存在 ,难以分离。
McCluskey曾用 Pd /C加氢还原
的方法 ,以去甲斑蝥素为底物制
备得到类似的加氢产物Ⅲ ,亦为
一混合物 (图 3) [ 3]。抗肿瘤试验
结果表明 ,Ⅲ对于大肠癌细胞株
表现出显著的选择性细胞毒活
性 ,提示加氢反应对于斑蝥素类
似物的抗肿瘤作用具有一定的意义。 本实验中得到
的产物尚有待作抗肿瘤活性测试。
作者曾尝试桔梗、长春花、连翘等多种植物细胞
悬浮培养体系 ,结果表明桔梗体系对斑蝥素的转化
比较完全。 Gao等报道了酵母菌对酮基的加氢还原
反应 [11 ] ,本文则采用桔梗细胞悬浮培养体系得到了
类似结果 ,提示这些生物体系中存在相似的还原酶。
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