全 文 ：活性的一个重要方面。
与此同时, 我们在实验中亦曾观察到 ESA、
ESA-1 体内用药无直接促进腹腔 M
分泌 TNF-

的功能, 但在给药剂量为 250 mg / kg 时,均可使腹
腔 M
在 LPS 刺激下分泌 T NF-
的功能得到显
著增强。这种正常腹腔 M
无影响, 而对活化的腹
腔 M
分泌细胞因子的功能具有增强作用的具体
机制有待进一步实验来阐明。
参考文献:
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西红花苷对血管内皮细胞的保护作用研究
绪广林,钱之玉

(中国药科大学 药理教研室,江苏 南京　210009)
摘　要: 目的　研究西红花苷对过氧化氢所致牛内皮细胞 ( BAEC) 损伤的保护作用, 并初步探讨其可能的作用机
制。方法　利用过氧化氢刺激 BAEC ,观察了西红花苷对细胞培养液内 MDA、SOD、LDH 含量或活性的影响,并对
细胞进行流式细胞分析和细胞内钙测定, 观察了该药对细胞凋亡及胞内钙的影响。结果　西红花苷可剂量依赖性
的减少 MDA 生成,提高 SOD 活性, 阻止 LDH 的外漏, 还能抑制过氧化氢所致细胞内钙升高,减少细胞凋亡百分
率。结论　西红花苷对过氧化氢所致 BAEC 损伤有保护作用,其作用机制可能与其拮抗细胞内钙有关,值得在临床
上推广应用治疗心血管疾病。
关键词: 西红花苷-1;牛内皮细胞; 凋亡;细胞内钙
中图分类号: R286. 2　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 05 0439 04
Protective effect of crocin-1 on bovine aortic endothelial cells
XU Guang-lin, QIAN Zhi-yu
( Depar tment of Pharmaco lo gy , Chinese Pharmaceut ical U niver sity , Nanjing Jiangsu 210009, China)
Key words : crocin-1; bovine ao rt ic endothel ial cells; apopto sis; int racellular calcium
　　番红花为鸢尾花科 ( Iridaceae) 番红花属 ( Cro-
cus L. ) 植物番红花 C. sat ivus L. 的干燥柱头,又
名藏红花、西红花。其主要活性成分为胡萝卜苷类化
合物(西红花苷) , 由于它们的结构差异较小,化学方
面的研究如提取、分离、鉴定等很多 [ 1]。同时因为该
类化合物有芳香味并呈现亮丽的黄色且较难消退
(保存适当) , 常在食品和化妆品行业用作染料[ 2]。众
所周知,西红花苷类化合物一个显著特点就是其抗
氧化作用 [ 3] , 并具有抗高血压、动脉粥样硬化、脑水
肿、脊髓损伤、乳头瘤、关节炎作用,还能提高哺乳动
物血流氧分压。近年来还发现其有抗肿瘤[ 4]和乙醇
所致记忆和学习障碍的作用 [ 5]。但红花昂贵的价格
限制了它的广泛使用,后来从一种来源广泛的植物
里面也成功地提取了该类物质[ 6]。不过以上研究一
般只限于整体动物研究, 缺乏其作用机制的探讨。细
胞、分子或基因水平的报道也很少见。本实验利用自
制的原料单体对过氧化氢所致内皮细胞过氧化脂质
生成、酶活性改变及凋亡进行了研究,并探讨其作用
机制,以期为临床应用提供可靠的理论依据。
1　材料与方法
1. 1　药品与试剂:西红花苷(西红花酸龙胆二糖基,
crocin-1)由本实验室自制(纯度> 98%, HPLC 法) ,
·439·中草药　Chinese T raditional and Herbal Drug s　2002 年第 33卷第 5期

收稿日期: 2001-10-18基金项目:江苏省基础研究计划(自然科学基金) BJ198124作者简介:绪广林( 1973-) ,男,江苏金湖人, 1995年毕业于中国药科大学中药制药专业。毕业后一直从事中药新产品开发及中药活性成分筛选等方面的工作。现为中国药科大学药理学在读博士,研究方向为生化药理,并主要致力于中药心血管系统方面的研究与开发。
* 通讯作者　Tel: 025-3271322　E-mail: xudunlop@ 263. n et
用 PBS 溶解后避光冷藏保存备用。Fluo-3/ AM 购
自 Bio-r ad 公司,二甲亚砜溶解, - 20℃ 保存, 临用
前稀释成所需浓度。RPM I 1640 培养基、胰蛋白酶
( 1∶250)均为 Gibco 公司产品。小牛血清购自杭州
四季青生物工程有限公司,其他试剂均为分析纯。
MDA、SOD、LDH 试剂盒均购自南京建成生物工程
研究所。
1. 2　牛内皮细胞 ( bovine aort ic endothelial cells,
BAEC ) 培养 [ 7] : 在无菌条件下, 取出胸主动脉段约
15 cm ,置于 Hanks液中冲洗 2～3次去除残血。将
外膜的脂肪和结缔组织分离干净, 并用磷酸缓冲液
反复冲洗,直至无血液残留。将主动脉内膜面翻转朝
外,覆盖在含有 0. 25% 胰蛋白酶消化液的平皿内,
使内膜与酶液充分接触并轻轻研磨约 10 min, 然后
轻轻刮取内皮细胞, 收集胰蛋白酶消化液到含培养
液的离心管中, 1 000 r / min 离心 5 m in, 弃去上清
液,加入含有 10% 小牛血清的 RPMI 1640培养液,
制成细胞悬液, 按 3×104～4×104/ mL 密度接种于
培养瓶中,置 37 ℃、5% CO 2条件下静置培养。4～6
h 后部分内皮细胞已经贴壁。24 h 后用 PBS 清洗杂
质及未贴壁细胞,换入新培养液。以后每 2～3 d换一
次, 直到细胞融合后进行传代培养。光镜下可见细胞
呈“鹅软石”状,经胞浆内第Ⅷ因子相关抗原鉴定为内
皮细胞。实验用第 4～10 代细胞。
1. 3　H2O 2及 crocin-1处理:传代 BAEC 铺于 96孔
( 10
5
cells/孔) , 待其生长至单层融合后, 倾去上清
液,以含 0. 5% 血清的培养基培养 24 h 使其同步
化。H2O 2 ( 100, 200, 400
mo l/ L ) 刺激组在无血清培
养基中加入相应的 H2O 2刺激 24 h。给药组在 H2O 2
刺激前,细胞与一定浓度的 crocin-1 预孵 24 h。另
设 10% 培养液对照组。
1. 4　脂质过氧化物 MDA 测定:于 24孔培养板中
加入培养的 BAEC, 经 cro cin-1、H2O 2处理, 并设
10% 培养液对照组。倾去上清液, 收集板上细胞并
经 PBS 充分洗涤, 置低温冰柜 ( - 70 ℃) 反复冻
融, 取上清液按试剂盒所述方法测定各组 MDA
含量。
1. 5　LDH 和 SOD 测定: 细胞接种 24 孔培养板,
分组及处理方法同 1. 3。取各组培养液按试剂盒操
作测定 LDH 和 SOD 活性。
1. 6　[ Ca2+ ] i测定: 将培养瓶中的细胞接种于含盖
玻片的 24 孔培养板中。测钙前,将小玻片取出置于
自制浴槽中, 加入 Fluo-3/ AM 使其终浓度为 5

mol/ L ,于 37 ℃ 避光温孵 40 min。然后用 Hanks
液洗涤 3 次, 加入不同测试液在荧光倒置显微镜下
观察。选择单个待测细胞,用氩离子激光预扫描, 参
数设置:激发波长 488 nm, 发射波长 530 nm; 扫描
方式: 时间扫描;激光功率: 30 mW; 物镜倍数: 20;
时间间隔: 2 s; 先扫描记录一段正常波动曲线,再加
入测试液, 记录细胞内荧光强度 ( F I ) 的变化,并由
计算机进行处理。实验测定用染色条件和扫描参数
在整个实验过程中保持不变。细胞内游离钙浓度变
化用给药前后荧光强度变化计算:
[ Ca2+ ] i变化百分率= (Fdrug - F 0) /F 0×100%
式中 Fdrug表示给药后的荧光强度, F0 表示给药前的荧
光强度。
1. 7　流式细胞分析: 将 BAEC 制成单个细胞悬液,
取 106个细胞离心后弃上清液, 加入预冷 70% 乙醇
固定, - 20 ℃ 保存过夜。测定时离心除去乙醇, 冷
PBS 洗涤 2 次, 5 mg/ L 碘化丙碇染色,室温避光放
置 15 min, 尼龙网过滤后上流式细胞仪检测, 用
mult icycles DNA 和细胞周期分析软件进行结果
处理。
2　结果
2. 1　cro cin-1 对脂质过氧化物 MDA 含量的影响:
H 2O 2与 BAEC 共同孵育后, 显著加剧细胞膜的脂质
过氧化反应, MDA 含量剂量依赖性地增加,给予不
同浓度的 crocin-1 对 200
mol/ L 过氧化氢所致
MDA 增加有良好的抑制作用, 并呈剂量依赖性, 见
表 1。
表 1　crocin-1 对过氧化氢所致 MDA
含量的影响 ( x±s, n= 6)
组别 H2O 2(
mol / L) crocin-1 (
mol/ L) MDA (nmol/ mL)
1 0 0 0. 819±0. 057
2 100 0 0. 977±0. 084* *
3 200 0 1. 210±0. 059* *
4 400 0 1. 316±0. 092* *
5 200 0. 1 1. 111±0. 062
6 200 1 0. 989±0. 076#
7 200 10 0. 832±0. 072# #
　　与第 1组比较: * * P < 0. 01
　　与第 3组比较: # P < 0. 05　# # P < 0. 01
2. 2　cro cin-1对内皮细胞 SOD活性的影响: BAEC
加入 H 2O 2后,其 SOD活性随剂量升高而降低,加入
不同浓度 crocin-1 可剂量依赖性地抑制 SOD 活性
的降低, 表明该药还能通过提高内在的抗氧化酶活
性,保护细胞膜免受自由基的攻击(表 2)。
2. 3　cro cin-1对 LDH 含量的影响:不同浓度 H 2O 2
与 BAEC 共同孵育后, 可显著增加 LDH 从 BAEC
中漏出,而加入不同浓度的 cro cin-1 后, LDH 活性
·440· 中草药　Chinese T raditional and Herbal Drug s　2002 年第 33卷第 5期
降低,表明其从细胞膜中漏出减少,提示该药可减轻
过氧化氢对细胞膜的损伤而导致的 LDH 大量外泄
(表 3)。
表 2　crocin-1 对过氧化氢所致 SOD
活性降低的影响 ( x±s, n= 6)
组别 H2O 2(
mol/ L) crocin-1 (
mol/ L ) SOD ( U/ mL)
1 0 0 31. 202±2. 620
2 100 0 10. 065±0. 592* *
3 200 0 7. 860±1. 256* *
4 400 0 6. 550±1. 216* *
5 200 0. 1 7. 806±1. 621
6 200 1 9. 364±1. 894
7 200 10 10. 636±1. 644# #
　　与第 1组比较: * * P < 0. 01
　　与第 3组比较: # # P < 0. 01
表 3　crocin-1 对过氧化氢所致 LDH
外漏的影响 ( x±s, n= 6)
组别 H2O 2(
mol/ L) crocin-1 (
mol/ L) SOD ( U/ m L)
1 0 0 569. 366± 56. 131
2 100 0 708. 117± 72. 441* *
3 200 0 759. 467± 24. 617* *
4 400 0 1 450. 280±223. 342* *
5 200 0. 1 770. 126± 26. 548
6 200 1 700. 651± 35. 149#
7 200 10 654. 455± 34. 541# #
　　与第 1组比较: * * P < 0. 01
　　与第 3组比较: # P< 0. 05　# # P < 0. 01
2. 4　cro cin-1 对 H 2O 2诱导 BAEC [ Ca2+ ] i升高的
影响: 当加入 H 2O 2刺激后,内皮细胞内钙离子浓度
随时间缓慢升高。如在刺激前分别加入 crocin-1
0. 1, 1 和 10
mol/ L ,可使升高幅度分别降低 10%、
20%、32%(图 1)。
A-静息状态　B-H2O 2 200
mol/ L
C～E-crocin-1 0. 1, 1. 0, 10
mol/ L
与静息状态相比: * * P< 0. 01;　与 H2O 2组相比: # # P < 0. 01
图 1　crocin-1 对 H2O2诱导 BAEC [ Ca2+ ] i升高的影响
2. 5　crocin-1 对 H2O 2诱导 BAEC 凋亡的影响:
H2O 2 200
mo l/ L 可致内皮细胞发生明显的凋亡,
其凋亡百分率为 49. 92% , cro cin-1 10
mol/ L 可使
凋亡百分率降至 3. 13%, 而 1
mol/ L cr ocin-1 使
凋亡百分率降至 22. 93%, 更低浓度对凋亡百分率
影响不显著。
3　讨论
钙作为第二信使物质, 参与调节机体各种生理
活动[ 8]。细胞内钙稳态是维持调节细胞功能的必要
条件。生理情况下,细胞内游离钙浓度较细胞外低一
万倍。这种浓度差的维持,有赖于质膜、内质网及线
粒体钙转运系统。当某种因素使胞内钙大幅度增加
甚至超载时,就会导致各种病理性变化。过氧化氢作
为活性氧家族中的一员[ 9] ,可直接作用于膜脂质, 形
成脂质过氧化物,从而 MDA 生成增加,质膜通透性
增加, 外钙内流增多, LDH 漏出也增多, 同时 SOD
活性下降;过氧化氢还能通过抑制 Na+ / K + -AT P
酶活性,导致细胞内 Na+ 堆积, 升高的 Na+ 可迫使
Na
+ -Ca
+ 交换器反向运转, 胞内钙不能排出, 导致钙
超载,并且过氧化氢可直接损伤内质网及线粒体钙
转移系统,使其丧失缓冲调节细胞内钙的能力。我们
的实验说明, 200
mol/ L H2O 2可使细胞内钙显著升
高。异常升高的钙可能通过启动黄嘌呤/黄嘌呤氧化
酶系统或花生四烯酸系统产生氧自由基及其他细胞
毒物质,并可加剧线粒体功能障碍,使氧化磷酸化紊
乱,导致内皮细胞损伤甚至激活凋亡调控基因,促发
凋亡。
Crocin-1能够与膜脂质过氧化自由基形成复合
物 CroRCOO·或 CroR·, 而这两者相对于 RCOO·
和 R·来说较稳定也不太容易进攻其他物质, 因而
其危害大大减低。另外, H2O 2进入细胞后还能通过
如下反应: H2O 2+ Fe2+→·OH+ Fe3+ + OH -形成羟
自由基,后者可与膜磷脂或嘌呤嘧啶碱基反应,生成
各种产物引起细胞功能改变。它也能与·OH 形成复
合物 ROH·, 从而减少它的损害。本实验表明西红
花苷能显著减少 MDA 生成,减少 LDH 漏出,提高
SOD 活性。另外,它也能抑制细胞内钙的升高,从而
使细胞内维持相对较低的水平,阻止了钙超载对凋
亡调控基因的促发,使内皮细胞损伤减少甚至不发
生病理性改变。本实验显示西红花苷可剂量依赖性
地抑制过氧化氢诱导的 BAEC 凋亡。以上分析提示
西红花苷可通过降低细胞内钙而发挥对内皮细胞的
保护作用。
有文献报道西红花苷对实验性动脉粥样硬化有
显著的抑制作用 [ 10] , 因为它能显著减少动脉壁脂质
的沉积及血液中脂质的含量, 从而对脂质引起的内
皮损伤也有保护作用。由此看来,该药对血管内皮细
胞的保护作用是多方面的, 而内皮细胞的损伤是动
脉粥样硬化和高血压等心血管疾病的起始阶段, 因
而该药应用于临床治疗上述疾病可能是有效的。
·441·中草药　Chinese T raditional and Herbal Drug s　2002 年第 33卷第 5期
本实验证实了西红花苷对过氧化氢所致内皮细
胞凋亡有保护作用, 但其对基因表达或调控的影响
还有待进一步研究。
参考文献:
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一种真菌菌丝体甲醇提取物—A7 的抗肿瘤活性研究
逯海燕1 ,郭顺星1
,林　晨2 ,张雪艳2,付　明2,梁　肖2,于能江1
( 1. 中国医学科学院 中国协和医科大学药用植物研究所, 北京　100094; 2. 中国医学科学院 中国协和医科大学肿瘤研究所,
北京　100021)
摘　要: 目的　研究一种真菌菌丝体甲醇提取物—A7 的抗肿瘤活性。方法　M TT 法观察 A7 对人 BEL-7402 肝癌
细胞、HCT -8 结肠癌细胞、SPC-A-1 肺腺癌细胞、GLC-82 肺腺癌细胞和 EC-109 食管癌细胞的生长抑制作用;以小
鼠移植性肿瘤 S180模型,观察 A7 的体内抗肿瘤作用。结果　A7 对前述癌细胞的半数抑制浓度 ( IC50 ) 分别为 0. 8,
1. 7, 4. 7, 5. 0, 7. 6
g/ mL , 均小于 10
g / mL ; 动物实验表明, 50 mg / kg A7 对 S180实体肉瘤的抑制率达 46. 8%
(P < 0. 001)。结论　A7 在体外和体内都具有一定的抗肿瘤活性。
关键词: 真菌菌丝体;抗肿瘤; MTT 分析; S180实体肉瘤
中图分类号: R286. 91　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 05 0442 03
Studies on antitumor activity of A7 extracted from one fungal mycelium
LU Hai-yan
1
, GUO Shun-x ing
1
, LIN Chen
2
, ZHANG Xue-yan
2
,
FU Ming2 , L IANG Xiao 2, YU Neng-jiang1
( 1. Institute o f Medicinal P lant Development, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking U nion Medical
Co llege, Beijing 100094, China; 2. Instit ut e of Cancer , Chinese Academy of M edical Sciences &
Peking Union Medical Co llege , Beijing 100021, China)
Key words : fungal mycelia; antitumor act ivity; MT T assay; S180 sarcoma
　　真菌发酵产物具有增强机体免疫力、抗辐射和
抗肿瘤等生物活性,日益受到人们的普遍关注。自然
界中真菌种类繁多,真菌发酵产物是研究、发现新化
合物和开发研制新药的重要天然宝库。Calcarisp ori-
um arbuscula Preuss是我室从四川野生灵芝子实体
中分离纯化获得的一种真菌, 我们对其发酵获得的
菌丝体甲醇提取物进行了体外和体内抗肿瘤活性实
验研究。
1　材料
1. 1　药品:菌丝体, 由本室发酵获得。菌丝体浸膏
A 7 的制备: 将菌丝体干燥后研成粉状,用 75% 甲
醇提取并浓缩得粘稠浸膏, 2. 6 kg 菌丝体得 410 g
·442· 中草药　Chinese T raditional and Herbal Drug s　2002 年第 33卷第 5期

收稿日期: 2001-10-07作者简介:逯海燕( 1975-) ,女,山东维坊人,博士研究生, 1997年毕业于山东医科大学药学系,同年考入协和医科大学攻读硕士研究生和博士研究生,研究方向为抗肿瘤药理。T el : 13681518997　E-mail: haiyan-lu@ hotmail. com
* 通讯作者　E-mail: shu nxing. guo@ bj . col. com . cn　　clin@ publ ic. bta. net . cn