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紫河车的凝胶电泳鉴别研究
李 峰 1 ,孙 娟 2 ,康廷国 1 ,裴世柱 1 ,王宇航 1* ,王 浩 1
( 1. 辽宁中医学院 中药系 ,辽宁 沈阳 110032; 2. 解放军第 406医院 ,辽宁 大连 116041)
紫河车 Placenta Hominis为健康人的胎盘干燥
品 [1 ] ,具有温肾补精、益气养血的功效。因其来源有限 ,
药效显著 ,常有伪品充斥市场。已有的鉴别多从真伪角
度出发 [2～ 4 ] ,而对临床常用 3种药材规格 (新鲜品、干
燥品、炮制品 )及是否混有脐带、胎膜等非药用部位的
鉴别未见报道。为此 ,本实验将这 3种不同加工方法的
紫河车药材及新鲜胎盘的不同部位进行了聚丙稀酰胺
凝胶电泳鉴别 ,为临床准确用药提供依据。
1 材料、仪器与试剂
1. 1 新鲜品:健康人的新鲜胎盘 (沈阳 157医院产
科提供 ) ,反复冲洗至去净血 ,冷冻备用。干燥品:新
鲜胎盘按《中华人民共和国药典》方法加工干燥。炮
制品:市购。
1. 2 仪器与试剂: DYY-Ⅲ -5型稳压稳流电泳仪
(北京六一仪器厂 ) ; DYY-Ⅲ -27A型电泳槽 (北京六
一仪器厂 ,管长为 8. 5 cm ) ; DYY-Ⅲ -27B型电泳槽
(北京六一仪器厂 ,管长为 17. 5 cm) ; 800-离心沉淀
器 (上海兴记机器厂 ) ;所用试剂均为分析纯。
2 方法和结果
2. 1 紫河车 3种加工品的非解离系统聚丙烯酰胺
凝胶电泳 ( PAGE)法
2. 1. 1 溶液配制与凝胶制备:按文献 [ 5]方法。
2. 1. 2 样品制备: 分别取上述 3种样品各 0. 5 g ,加
稀释 4倍的浓缩胶缓冲液 25 mL,用研钵研细 ,离心
( 4 000 r /min) 15 min,取上清液备用。
2. 1. 3 加样与电泳: 分取 3种样品处理液各 100
μL上样 (使用 DYY-Ⅲ -27B型电泳槽 ) ,电泳开始时
电流调至 10 m A,大约 0. 5 h后 ,待样品液进入分离
胶 ,调节电流至 25 mA,并保持电流不变 ,电泳至指
示剂距离管口末端约 0. 5 cm处 (电泳约 5 h左右 ) ,
停止电泳。
2. 1. 4 固定、染色、洗脱:将电泳后的凝胶于固定液
中固定 30 min,再浸于染色液中染色过夜 ,最后用
洗脱液洗脱至背景清晰。
2. 1. 5 电泳图谱测绘: 按泳动率= (蛋白质谱带移
动的距离 /指示剂移动的距离 )× (染色前凝胶长度 /
脱色后凝胶长度 )计算出各样品中主要谱带泳动率 ,
由各谱带泳动快慢将电泳图谱分为 A( Rf < 0. 35) ,
B( 0. 35≤ Rf < 0. 65) , C( Rf≥ 0. 65) 3个区间 ,各样
品中电泳谱带数目及泳动值见表 1。
根据各样品谱带的 Rf值、形态和着色程度绘制电
泳图谱 ,以完全涂黑、框内斜线、框内打点、横线下虚线
·570· 中草药 Chinese T raditional and Herbal Drug s 第 34卷第 6期 2003年 6月
收稿日期: 2002-08-27作者简介:李 峰 ( 1963- ) ,女 ,副教授 ,现在辽宁中医学院在职攻读生药学博士学位 ,研究方向为中药材鉴别与质量评价。
* 本院中药系 2001届毕业生
4种符号分别代表凝胶谱带的Ⅰ ～ Ⅳ级 ,见图 1-A。
2. 2 紫河车 3种加工品的解离系统聚丙烯酰胺凝
胶电泳 ( SDS-PAGE)法
2. 2. 1 溶液配制与凝胶制备:按文献 [6 ]方法。
2. 2. 2 样品制备:按 2. 1. 2方法将离心后的上清液
加样品水解液按 1∶ 3混合 ,过夜 ,备用。
2. 2. 3 加样与电泳:同 2. 1. 3方法 ,但由于无浓缩
胶 ,故电泳时电流应始终保持为 25 m A,直到电泳
结束。
2. 2. 4 固定、染色、洗脱:同 2. 1. 4方法。
2. 2. 5 电泳图谱测绘:同 2. 1. 5方法 ,电泳谱带数
目和谱带泳动值见表 2,结果见图 1-B。
2. 3 紫河车新鲜品不同部位的 SDS-PAGE法
2. 3. 1 溶液配制与凝胶制备:同 2. 2. 1方法。
2. 3. 2 样品制备: 将鲜胎盘分取脐带、脐带和胎盘、
胎盘、胎膜 4部各 1 g匀浆 ,离心 ( 4 000 r /min) 15
min,取上清液 ,分别按 2. 2. 2方法制成样品液备用。
2. 3. 3 加样与电泳:同 2. 2. 3方法 (使用 DYY-Ⅲ -
27A型电泳槽 )。
2. 3. 4 固定、染色、洗脱:同 2. 1. 4方法。
2. 3. 5 电泳图谱测绘:同 2. 1. 5方法 ,见表 3,图 2。
由表 1及图 1-A可见 ,新鲜品共有 13条谱带 ,
表 1 紫河车 3种加工品的 PAGE结果 (* 为特征谱带 )
Table 1 Results of three k inds of processedPlacenta Homin is by PAGE (* characteristic charts)
样品 电泳谱带分布 各极电泳谱带 总量 A区 B区 C区 Ⅰ 级 Ⅱ级 Ⅲ级 Ⅳ级 主要谱带泳动率值
新鲜品 13 2 7 4 1 4 4 4 0. 1, 0. 21, 0. 41, 0. 43, 0. 45* , 0. 4
0. 55* , 0. 61* , 0. 65, 0. 8, 0. 82
0. 85* , 0. 89
干燥品 9 3 4 2 1 5 1 2 0. 17, 0. 23, 0. 34* , 0. 41* , 0. 45*
0. 62, 0. 69, 0. 90, 0. 94*
炮制品 - - - - - - - -
表 2 紫河车 3种加工品的 SDS-PAGE结果 (* 为特征谱带 )
Table 2 Results of three kinds of processedPlacenta Hominis by SDS-PAGE (* characteristic charts)
样品 电泳谱带分布 各极电泳谱带 总量 A区 B区 C区 Ⅰ 级 Ⅱ级 Ⅲ级 Ⅳ级 谱带泳动率值
新鲜品 6 4 2 - 1 1 1 3 0. 09, 0. 17, 0. 31* , 0. 42* , 0. 60, 0. 89
干燥品 7 5 2 - 1 1 1 3 0. 07, 0. 09* , 0. 17, 0. 30* , 0. 40* , 0. 64, 0. 71
炮制品 5 3 2 - - - 3 2 0. 10, 0. 39, 0. 48, 0. 65, 0. 74
表 3 紫河车新鲜品不同部分的 SDS-PAGE结果 (* 为特征谱带 )
Table 3 Results of dif ferent positions of Placenta Hominis by SDS-PAGE (* characteristic charts)
样品 电泳谱带分布 各极电泳谱带总量 A区 B区 C区 Ⅰ 级 Ⅱ级 Ⅲ级 Ⅳ级 谱带泳动值
脐带 9 2 5 2 1 3 3 2 0. 21* , 0. 28, 0. 38* , 0. 46, 0. 49* , 0. 54,
0. 58, 0. 65* , 0. 81
脐带+ 胎盘 12 1 5 6 1 2 6 3 0. 33, 0. 36, 0. 47, 0. 54* , 0. 62* , 0. 64,
0. 68, 0. 73, 0. 82, 0. 92, 0. 96
胎盘 9 1 3 5 1 2 1 5 0. 19, 0. 45* , 0. 53* , 0. 6* , 0. 71, 0. 81,
0. 91, 0. 95, 0. 98
胎膜 1 - 1 - - 1 - - 0. 54
分为 4级。 其中以 A区的 Rf= 0. 2, B区的 Rf=
0. 45, 0. 55, 0. 61和 C区的 Rf= 0. 85为特征谱带。
干燥品共有 9条谱带 ,分为 4级。 其中以 A区的
Rf= 0. 34, B区的 Rf= 0. 41, 0. 45和 C区的 Rf=
0. 94为特征谱带。 炮制品无明显谱带产生。
由表 2及图 1-B可见 ,新鲜品共有 6条谱带 ,分
为 4级。其中以 A区的 Rf= 0. 31, B区的 Rf= 0. 42
为特征谱带。干燥品共有 7条谱带 ,分为 4级。其中
以 A区的 Rf= 0. 09, B区的 Rf= 0. 30, 0. 40为特征
谱带。炮制品的 5条谱带均为不明显Ⅲ 、Ⅳ级谱带。
表 3及图 2可见 ,脐带部分共有 9条谱带 ,分为
4级。 其中以 A区的 Rf= 0. 21, B区的 Rf= 0. 38,
0. 49和 0. 65为特征谱带。 脐带和胎盘部分共有 12
条谱带 ,分为 4级。其中以 B区的 Rf= 0. 54, 0. 62
·571·中草药 Chinese T raditional and Herbal Drug s 第 34卷第 6期 2003年 6月
1-新鲜品 2-干燥品 3-炮制品 * 为特征谱带
1-f resh Placen ta Hom inis 2-d ried Placenta Hominis 3-prod-
ucts of p repared Placenta Homin is * ch aracteris tic ch arts
图 1 紫河车 3种加工品的 PAGE图谱 (A)
和 SDS-PAGE图谱 (B)
Fig. 1 PAGE ( A) and SDS-PAGE (B) of three kinds
of processedPlacenta Homin is
1-脐带 2-脐带和胎盘 3-胎盘 4-胎膜
1-umbi lical cord 2-umbilical cord and Placenta Homin is 3-
Placen ta Hominis 4-foetal m emb rane * -characteris ti c chart s
图 2 紫河车新鲜品不同部位的 SDS-PAGE图谱
Fig. 2 SDS-PAGE of dif ferent parts of f resh
Placenta Hominis
为特征谱带。胎盘部分共有 9条谱带 ,分为 4级。其
中以 B区的 Rf= 0. 45, 0. 53和 0. 60为特征谱带。
胎膜仅在 Rf= 0. 54处有一Ⅱ级带。
3 讨论
3. 1 电泳作为分离 (分析 )蛋白质及带电物质的一
种有效手段 ,已应用于中药的鉴别中 [7 ] ,但由于某些
药材 ,尤其动物类药材 ,其蛋白质成分多为不溶于水
的大分子 ,故采用普通的聚丙烯酰胺凝胶电泳法 ,难
将其蛋白质成分进行有效的分离与鉴别 ,如在 2. 1
方法中紫河车炮制品即无明显的电泳级谱带。为此 ,
实验采用解离系统的聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (即
SDS-PAGE法 ) ,因为在该系统中 SDS(十二烷基硫
酸纳 )具有解离蛋白质分子的作用 ,它可将一些分子
量较大 ,不溶于水的蛋白质分子解离成易溶于水的
小分子蛋白质 ,如在 2. 2方法中紫河车炮制品便出
现了较明显的Ⅲ 、Ⅳ级谱带 ,故采用连续系统 SDS-
PAGE法对本品的鉴别较为适宜。
3. 2 与其他鉴别方法相比 ,电泳方法具有专属性更强
的特点 ,不仅可以进行真伪鉴别 [4 ] ,而且本实验方法可
以鉴别紫河车的非药用部分 ,因此更具有实用价值。
3. 3 由图 1-B比较紫河车的 3种不同加工品的电
泳图谱可见 ,其新鲜品与干燥品 ,无论在蛋白质谱带
数目与位置匀有一定的对应 ,说明这种加工法
( 50℃～ 60℃干燥 ) ,基本上保持新鲜品蛋白质成
分 ;相反 ,炮制品的电泳级谱带明显减少 ,说明炮制
过程对其蛋白质的损失较大 ,从其温肾补精 ,益气养
血的角度 ,应以新鲜品和干燥品为宜。
3. 4 从不同部位的电泳图谱分析 ,胎膜部分由于其
谱带数量较少 ,可推测其蛋白质种类及含量均较少
(其主要结构大多是纤维 ) ,因此《中华人民共和国药
典》中紫河车除去胎膜的加工方法是有道理的。至于
《中华人民共和国药典》中除去脐带的加工 ,虽然脐
带也含有较多的蛋白质 ,但从谱带位置及谱带着色
程度分析与胎盘有较大差异 ,且从脐带和胎盘与胎
盘在此电泳条件下 ,多数谱带位于 C区 ,泳动率 Rf
值较接近 ,说明此电泳条件对它们的分离不够完全
(可通过延长电泳时间加以解决 ) ,因此 ,从鉴别角度
上看 ,如将脐带部分加入 ,可能导致蛋白质鉴别的困
难 ,故以除去脐带为宜。
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