全 文 ：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月· 827·
制提供理论和实验基础；为进一步开展方剂研究提供
策略；为临床治疗多发性骨髓瘤及其他恶性肿瘤开辟
新的道路，具有重要的理论意义和应用前景。
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泽泻有效部位对肾草酸钙结石模型大鼠肾组织骨桥蛋白表达的影响
米其武1，曹正国2，刘继红1，吴继洲3，尹眷萍3，周四维1，叶章群1
(1华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科，湖北武汉430030{2．安徽省立医院泌尿外科
安徽合肥230001；3．华中科技大学J司济医学院药学院，湖北武汉430030)
摘要：目的研究泽泻有效部位对大鼠肾草酸钙结石形成和肾组织骨桥蛋白(OPN)表达的影响，探讨泽泻抑制
尿结石形成的机制。方法采用现代植化和生物活性导向分离的方法分离、提取泽泻的有效部位=将30只大鼠随
机分成3组：对照组、模型组、泽泻组。以乙二醇和1a羟基维生素D。-g制备大鼠肾革酸钙结石模型。检测各组大鼠
血及尿生化、肾ca抖水平、24h尿草酸分泌量和肾组织病理学改变，并采用免疫印迹(Westernblotting)和半定量
逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)分别观察各组大鼠肾组织OPN蛋白及其mRNA的表达水平。结果19泽泻有
效部位(主要以四环三萜类化台物为主)大鼠的血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、肾caH水平、24h尿cah分秘
量、肾组织草酸钙晶体的分布、OPN蛋白及其mRNA的表达水平均显著低于模型组(尸部位能抑制大鼠肾组织OPN的表达，减少肾组织草酸钙结晶的沉积，从而能有效抑制大鼠肾草酸钙结石的形成。
关键词：泽泻；尿石；骨桥蛋白；草酸钙
中圈分类号：R285，5 文献标识码：A 文章编号：02532670(2005)12182705
EffectsofactivefractionofAlismaorientaleonosteopontinexpressioninrenaltissue
ofurolithiasismodelratwithcalciumoxalates one
MIQi—wul，CAOZheng—gu02，LIUJi—hon91，WUJizhou3，YINChun—ping3，
ZHOUSiweil，YEZhang—qun。
(1．DepartmentofUrology，AffiliatedTongjiHospitalofTongiiMedicalCo lege，HuazhongUniversityofScience
andTechnology，Wuhan430030．China；2．DepartmentofUrology，AnhuiProvincialHospital，
Hefei230001，China；3．SchoolofPharmacy，TongjiMedicalCo lege，Huazhong
UniversityofScienceandTechnology，Wuhan430030，China)
警鎏品眢；瞀蒙召蒙毳学基金资助项目(39970891)
作者简介。意薏鼍舅器学丢；；嚣裹嘉}嚯!；爿：专慧、景师75@’在1读63博．co士rn研究生，主要从事泌尿外科尿石症和膀胱肿瘤的研究
L
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万方数据
·1828· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月
Abstract：ObjectiveTostudytheffectsofactivefractionsofAlismaorientaleonurinarycalcium
oxalates oneformationandsteopontin(0PN)expressioninurolithiasismodelratsandtoexploreth
mechanismofA．orientaleonthpreventionoftheformationfr murinarycalculi．MethodsTheactive
fractionsofA．orientalewers peratedndxtractedwithisolationechniquesguidedbymodernphyto—
chemistryandbioactivity．AdultmaleWistarrats(30)wererandomizedintothreegroups，theywerecon
trol，model，andA．orientalegroups．Themod lratswithrenalcalciumoxalates oneformationwerei —
ducedbyigethyleneglycolandla—hydroxyvitaminD3forfourweeks．Thecalciumoxalatedepositinthe
kidneywasobservedbymicroscopy．TheSCrandBUNlevels，renaltissuecalciumcontent，24hurinary
oxalica idexcretion，andphysiologicalchangeinrenaltissuew realsodetected．Westernblottinga d
RT—polymerasechainreaction(RT—PCR)techniqueswerusedtOobservethproteinandmRNAexpres—
sionofOPNinratrenaltissueof verygroups．ResultsSCrandBUNlevel，renaltissuecalciumcontent，
24hurinarycalciumexcretion，crystaldepostion，andthe0PNexpressionintheratsbyigactivefrac—
tlonswhichwereidentifiedast tracyclictr terpenoids，weresignificantlylowerthanthoseinmodelgroup
(PcalciumoxalateinrenaltissueSOastoblocktheformationofre alcalciumoxalates oneinratspotently．
Keywords：AlismaoHentale(Sam．)Juzep．；urinarycalculi；osteopontin(OPN)；calciumoxalate
泽泻AlismaoHentale(Sam．)Juzep．是治疗
泌尿系结石的常用传统中药，以往的研究已证实泽
泻的有效部位醋酸乙酯浸膏能显著抑制大鼠肾草酸
钙结石的形成“】，但目前国内外尚未见泽泻抑制肾
草酸钙结石形成的活性部位及其作用机制的研究报
道。骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是一种富含天冬
氨酸的磷酸化糖蛋白，体外实验表明能显著抑制草
酸钙晶体的成核、聚集和与肾小管上皮细胞的黏附．
认为可能是草酸钙结石的抑制因子o]。本课题组在
前期工作的基础上采用现代植化和生物活性导向分
离的方法进一步从泽泻中分离得到了一种化合物，
体外研究已证明其对草酸钙结晶有抑制作用o]。本
实验分别用免疫印迹(Westernblotting)和半定量
逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)初步观察了泽泻
的活性部位对肾草酸钙结石模型大鼠肾结石形成和
肾OPN及其mRNA表达的影响，为泽泻在抑制肾
草酸钙结石形成的作用机制方面的深入探讨提供了
实验依据。
1材料
泽泻有效部位的提取：泽泻粗粉(产于福建，由
华中科技大学同济医学院药学院吴继洲教授鉴定)
10．5kg，用50％甲醇回流提取，回收甲醇得浸膏约
2kg，加适量水溶解后，用醋酸乙酯萃取并回收醋酸
乙酯得到醋酸乙酯浸膏212g，留45g配样，其余的
用硅藻土柱色谱分离，以醋酸乙酯洗脱，回收溶剂得
到醋酸乙酯洗脱液，经硅胶柱色谱分离，用石油醚洗
脱并反复柱色谱分离后得到提取物2．1g。将该提取
物与25．0mI．无水乙醇和25．0mI。聚山梨酯一80
充分混匀后，用蒸馏水定容至500mL备用(其主要
成分为四环三萜类，相当于含生药20．0g／mL)。
2方法
2．1 动物模型制备和分组处理：Wistar健康雄性
大鼠30只，体重180～220g，随机分为3组，每组
10只。A组(对照组)；B组(肾草酸钙结石模型
组)：参照文献报道方法[43复制大鼠肾结石模型。以
1％乙二醇+1a羟基维生素D。为诱石剂，隔天ig
给予，每只0．5pg；C组(泽泻组)：在给予与B组相
同诱石剂的同时，每天ig泽泻提取物5．0mI。／kg
(相当于生药100．0g／kg，预实验证明此剂量为最
佳剂量)。各组大鼠均给药4周。
2．2一般观察指标及检测方法：实验结束前1d称
体重，比较实验前后大鼠体重的变化，用代谢笼收集
并测定24h尿量、尿液pH值、24h尿草酸的分泌
量(过氧化氢盐酸苯肼法)。戊巴比妥ip麻醉后，
严格无菌操作下行下腔静脉穿刺取血，离心取上层
血清，用OlympusA l000自动分析仪测血清尿素
氮(BUN)、血清肌酐(SCr)水平；同时切取肾组
织，一部分置液氮罐保存备用，另一部分以10％中
性福尔马林固定，作常规HE石蜡切片和
Pizzllato’S染色，光镜下观察肾组织草酸钙结晶形
态分布及肾组织的病理改变。Hitachi180一80型原
子吸收光谱仪进行肾组织Ca”、尿总Ca2+测定。
2．3 Westernblotting检测肾组织OPN蛋白的表
达：匀浆器处理肾组织，用预冷的PBS洗2遍，加入
5倍体积的组织蛋白裂解液，置冰上30min，离心
(12000×g)2min，取上清液，测蛋白浓度。取10
“I．加入等体积2×上样缓冲液，煮沸10min，离心
后取上清液。制备10％非连续SDS—PAGE凝胶，
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月· 829·
每孔加变性后的总蛋白100pg，在100V下电泳。
至溴酚蓝达到凝胶底部，恒流320mA，2h后将蛋
白电转移到PVDF膜。5％脱脂奶粉封闭2h，加入
1；1000稀释兔抗人OPN多克隆抗体(美国
SantaCruz公司)，4℃过夜，加入1t 1 000稀释的
HRP标记羊抗兔二抗，室温孵育1h，最后在暗室中
进行化学发光法显影。设立不加一抗的阴性对照组，
Westernblotting蛋白条带测定吸光度A值。
2．4 RT—PCR检测肾组织OPNmRNA的表达：
肾组织总RNA提取按Trizol试剂盒(美国Gibieo
公司)的说明书进行。紫外分光光度计测定提取的
总RNAA。。。／A：。。值，并经甲醛变性琼脂糖凝胶电
泳鉴定。根据Primer5．0引物设计软件设计的
OPN引物序列，正义引物：5-CATCAGAGccAc—
GAGTTTcA一37，反义引物：5，_TCAGGGCC—
CAAAACACTATC一3’，扩增产物为273bp；RT
PCR二步法按TaKaRaRNAPCR试剂盒(大连宝
生物工程有限公司)的说明书进行。取逆转录产物
10pL进行PCR，50卢LPCR体系的反应条件：94
℃3min；94℃30S；54℃30S；72℃1．5min；
35个循环。同时进行内参照p肌动蛋白(p—actin)
的PCR，正义引物：5’一CCCAGAGcAAGA—
GAGGcTC一37，反义引物：5’一AGcACAGCCTG—
GATAGCAAC一37，扩增产物长度为400bp。取
PCR产物5止在1．5％的琼脂糖凝胶中，75V下
电泳，uVP凝胶成像系统照相扫描，测定灰度值，计
算出每个标本OPN与肛aetin的比值来判断各组
中OPNmRNA表达的相对水平。
2．5统计学分析：数据用；±s表示，总体比较采用
方差分析，组间比较采用q检验，用SPSS11．5统
计软件进行分析。
3结果
3．1一般情况：泽泻大鼠的24h尿量为(25．41±
8．17)mL，明显高于对照组的(16．26士3．18)mI，
和模型组的(13．07土4．34)mL，差异显著(P<
0．01)。泽泻活性部位对大鼠尿pH值无明显影响
(pH值均在6．40左右)。模型组大鼠死亡1只，大
鼠的食量、体重增量均小于其他组，但差异不显著
(P<0．05)。
3．2血清BUN、SCr、24h尿Ca“、24h尿草酸分
泌量和肾组织Ca2+水平：结果见表1。对照组血清
BUN、SCr、24h尿草酸、24b尿ca”、肾组织Ca2+
水平均明显低于其他两组，差异显著；泽泻组血清
BuN、SCr、24h尿ca”、肾组织ca2+水平均明显低
于模型组，差异显著；24h尿草酸分泌量，模型组与
泽泻组间差异不显著。
裹1 3组大鼠血清BUN、SCr、24h屎草酸、24h尿ca2+和肾组织ca2+水平(；士j)
TableI SerumBUN，SCr．24hurinaryoxalica id，andCa“levelin24hurine
andinrenaltissueofratsinthreegroups(；土s)
与对照组比较：⋯P<0，OOl{与模型组比较：△6P⋯P<001们controlgroup{△△P<0-Ol△△△P<0·001口jmodelgroup
3．3肾组织病理学检查：Pizzllato’S染色后，草酸衰2 3组大鼠肾组织OPN蛋白及mRNA
钙晶体在光镜下呈黑褐色。模型组大鼠肾组织草酸 的表达水平(i土s)
钙结晶布满全肾，主要分布在肾乳头和肾皮质，部分
结晶成堆且互相连接成片，高倍镜下晶体主要存在
于肾近曲小管和远曲小管，小管上皮细胞明显肿胀、
变性、坏死，管腔显著扩张；结石经分析表明是草酸
钙结石。泽泻组大鼠肾组织草酸钙晶体明显少于模
型组，仅有少数晶体分布在肾皮质和髓质且晶体大
多散在不成堆，管腔内也仅见散在的草酸钙结晶，扩
张程度也明显比模型组轻。
3．4 OPN蛋白的表达：3组大鼠肾组织OPN蛋白
的Westernblotting蛋白条带的A值见表2。对照
组肾组织OPN蛋白条带的4值均明显低于模型组
Table2 ProteinandmRNAexpressionofOPNinrenal
tissueofratsinthreegroups(z土F)
组别 动物／只OPN蛋白表达(A值)OPNmRNA表达
与对照组比较：一尸与模型组比较：A6p<0．01666P一P<0．01⋯P<0．001wcontrolgroup
66P<0．01△△△P和泽泻组，差异显著；泽泻组OPN的A值也明显低
于模型组，差异显著。
万方数据
·1830· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月
3．5 OPNmRNA的表达：3组大鼠肾组织OPN
mRNA的RT—PCR扩增产物电泳结果见图1，OPN
mRNA的相对表达水平见表2。对照组肾组织OPN
mRNA的表达水平均明显低于模型组和泽泻组，差
异显著；泽泻组OPNmRNA的表达水平也明显低
于模型组，差异显著。
圈1 3组大鼠肾组织OPNmRNA的RT—PCR电泳图
Fig．1ElectrophoregramofRT—PCRofOPNmRNA
inrenaltissueofratsinthreegroups
4讨论
尿石症是威胁人类健康的常见疾病之一，草酸
钙结石占尿结石的80％左右，尿结石被摘除或排
出后的复发率很高。随着体外冲击波碎石和腔内泌
尿外科等发展，尿石症的治疗已取得较大的进步，但
目前尚缺乏治疗及预防尿结石复发的有效药物。泽
泻具有利水渗湿功效，可与多种中草药配伍组成治
疗尿路结石的传统方剂。泽泻用于防治尿石症有悠
久的历史和良好的效果，虽已积累了丰富的fI缶床经
验，然而对其作用机制，特别是对其活性成分深入的
基础研究报道甚少。自Yamaguchi等“3报道泽泻的
水提液体外能抑制草酸钙结晶的生长(晶体生长抑
制指数达到80％以上)；能显著抑制实验性肾结石
大鼠肾草酸钙结石形成以来，许多学者对泽泻的活
性部位及其防治草酸钙尿石症的作用机制进行了研
究。本实验采用现代植化和生物活性导向分离的方
法将泽泻的有效部位醋酸乙酯浸膏进一步分离得到
几种化合物，通过前期的动物和体外实验逐渐筛选
出泽泻的活性部位，并探讨了其对结石模型大鼠肾
结石形成和OPN表达的影响。
本实验采用1％乙二醇和1a一羟基维生素D，·g
诱导大鼠肾草酸钙结石形成。实验结果表明泽泻的
活性部位明显降低肾结石大鼠的血清BUN、SCr、
肾Ca“水平和24h尿Ca“分泌量，减轻肾小管损
伤的程度；而其对大鼠尿草酸的排泄并没有影响。同
时服用泽泻的大鼠24h尿量明显多于对照组和模
型组，表明泽泻较强的利尿作用也有助于大鼠肾结
石的排出。
正常人尿抑制草酸钙结晶的能力主要依赖于尿
液中的某些蛋白质大分子，它们的浓度及其内在的
抑制能力可显著影响草酸钙晶体的生长和聚集。
OPN是一种磷酸化糖蛋白，从正常人尿液中提纯的
OPN在多种浓度下均对草酸钙结晶的生长和聚集
有明显的抑制作用o]，表明OPN可能是正常机体
一种重要的抑制结石形成的内源性大分子物质。免
疫组化和原位杂交证实OPN主要是由正常肾脏远
曲小管和集合管合成分泌⋯。Yasui等=81的研究发
现，正常人肾脏表达OPN较弱，而结石模型组大鼠
OPN的表达明显高于对照组，而结石患者的肾脏和
结石原基质中OPN表达明显增强。本实验也证实
结石模型组大鼠OPN的表达明显高于对照组，而
OPN的过高表达是由大鼠服用乙二醇和1a～羟基
维生素D。后产生的高草酸尿、高钙尿和草酸钙晶体
在肾脏的沉积共同调控所致o]。OPN的这种分泌情
况，是机体的一种防御机制，肾脏表达OPN的强度
在一定程度L反映了尿抑制晶体结晶的能力，即通
过合成更多的OPN来抑制结石形成。大鼠服用泽
泻活性部位后，OPN的表达显著降低。
泽泻主要含挥发油、天门冬素、植物甾醇苷、脂
肪酸、树脂、蛋白质、淀粉、三萜类化合物、倍半萜类
化合物、尿苷、大黄素、泽泻醇c一醋酸醋和环氧泽泻
烯等。本课题组将泽泻的活性部位进行初步的核磁
共振谱分析，发现其主要成分是四环三萜类化合物，
它可能通过减少结石大鼠肾组织OPN的表达来抑
制大鼠肾结石的形成，这为阐明泽泻防治草酸钙尿
石症的物质基础及其作用机制和进一步开发生产治
疗尿石症的新药提供了理论依据，有助于科学评价
泽泻药材及制剂的质量、改进剂型和提高其防治尿
石症的疗效。
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油茶皂苷对缺氧一复氧诱导的内皮细胞损伤及中性粒细胞黏附的影响
黄起壬1，何明1，戴育成2，罗永明3
(1．江西医学院药理教研室，江西南昌 330006；2．江西医学院第二附属医院血液研究所
江西南昌 330006；3．江西中医学院药学系，江西南昌330006)
摘要：目的研究油茶皂苷(sQs)对缺氧一复氧诱导的内皮细胞损伤及中性粒细胞黏附的作用及可能的机制。方
法 建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧一复氧损伤模型，取培养细胞上清液测定LDH活性，分别测定HU
VEC存活率．中性粒细胞黏附率、线粒体丙二醛(MDA)水平及超氧化物歧化酶(s0D)和谷胱甘肽过氧化物酶
(GSH—Px)活性。同法检测中性粒细胞黏附。结果缺氧复氧可导致HUVEC损伤及中性粒细胞黏附的增加，表
现为LDH活性、MDA水平及中性粒细胞黏附率显著升高，而SOD和GSH—Px活性显著下降{sQs呈浓度依赖性
地对抗上述改变。结论SQS对缺氧一复氧诱导的HUVEC损伤有保护作用，其机制可能与其抗脂质过氧化和抑制
白细胞黏附有关。
关键词：油茶皂苷；内皮细胞；中性粒细胞；黏附；缺氧一复氧
中周分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)t2—1831—04
Effectsofsasanquasaponinoninjuryofendothelialcellsinduced
byhypoxia—reoxygenationandneutrophiladhesion
HUANGQi—renl，HEMin91，DAIYuchen92，LUOYong—min93
(1．DepartmentofPharmacology，JiangxiMed calCo lege，Nanehang330005·Chinal2．I stituteofHematology，
theSecondAffiliatedHospitalofJiangxiMedicalCo lege，Nanchang330006，China；3Departmentof
PharmaceuticalScience，JiangxiCollegeofTraditionalChineseMedicine，Nanehang330006，China)
Abstract：ObjectiveToinvestigatetheffectofsasanquasaponin(SQS)oni juryofendothelialcells
inducedbyhypoxia—reoxygenationandneutropbiladhesion，anditspossiblemechanisms．MethodsHu
manumbilicalveinendotheliaIcells(HUVEC)wereexposedtonormoxiaorhypoxia—reoxygenationlnthe
absenceorpresenceofSQS(10．0，1．0，and0．1#mol／I。)．Lactatedehydrogenase(LDH)activitywasde—
terminedinculturedHUVECsupernatants．HUVECsurvivaIr te，neutrophiladhesionrate，malondialde—
hyde(MDA)1evelsup roxided smutase(SoD)andglutathioneperoxidase(GSH—Px)activitieswerem a—
sured．Neutrophiladhes onwasassayedinadditionalHUVECtreatedasabove．ResultsTheresults
showedthathypoxla—reoxygenationresultedinHUVECinjuryandenhancementofn u rophiladhesion，
withtheincreaseinLDHactivity，MDAlevel，andadhesionrateaswell，conversely，withthedecreasein
activityofSODandGSH—Px{SQSantagonizedthesechangesinaconcentration—dependentmann r．Con—
elusionSQSmayprotectHUVECagainstbypoxia—reoxygenationinjuryanditsmechanismappearestobe
relatedoanti1ipoDeroxldlzationandan i—adhesionofwhitebloodcell．
Keywords：sasa“quasaponin；endothelialcells；neutrophils；adhesion；hypoxia—reoxygenation
缺血再灌注损伤是许多心脑血管疾病共同的
病理过程。已有充分证据表明：中性粒细胞的参与是
缺血再灌注损伤的关键因素，而血管内皮则是缺
血一再灌注损伤的关键部位。1]。研究表明，细胞在缺
血或缺氧的情况下，将出现能量代谢障碍，引起细胞
内钙超载和氧自由基的产生，并产生细胞因子，激活
鉴鍪品留：翌蔷善篙臻科学基金资助项目(。。。。∞。，
作者简介：T黄e起l：壬(0(719916)763)6’0男590’江西Fa省x：南(康07市91人)6’3副61教69授3’博E-七m’a研il,究h方uan向gq为r6心7@血1管63药,c理orn学和分子药理学
万方数据
泽泻有效部位对肾草酸钙结石模型大鼠肾组织骨桥蛋白表达
的影响
作者： 米其武， 曹正国， 刘继红， 吴继洲， 尹春萍， 周四维， 叶章群， MI Qi-wu， CAO
Zheng-guo， LIU Ji-hong， WU Ji-zhou， YIN Chun-ping， ZHOU Si-wei， YE Zhang-
qun
作者单位： 米其武,刘继红,周四维,叶章群,MI Qi-wu,LIU Ji-hong,ZHOU Si-wei,YE Zhang-qun(华中科
技大学同济医学院附属同济医院,泌尿外科,湖北,武汉,430030)， 曹正国,CAO Zheng-
guo(安徽省立医院,泌尿外科,安徽,合肥,230001)， 吴继洲,尹春萍,WU Ji-zhou,YIN Chun-
ping(华中科技大学同济医学院,药学院,湖北,武汉,430030)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(12)
被引用次数： 12次

参考文献(9条)
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本文读者也读过(10条)
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引证文献(12条)
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5.陈曦 泽泻的研究现状与进展[期刊论文]-中国民族民间医药 2011(9)
6.才春东.姜宁.王国增.郑景存 枸橼酸钾对大鼠肾草酸钙结石骨桥蛋白表达的影响[期刊论文]-宁夏医科大学学报
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7.樊龙昌.尹春萍.刘继红.王涛.叶章群 泽泻水煎剂对尿草酸钙结石影响的临床与实验研究[期刊论文]-中国药师
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8.肖劲逐.李浩勇.张国庆.王声兴.张阳德 夏枯草提取物对肾草酸钙结石模型大鼠肾组织骨桥蛋白表达的影响[期刊
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9.谢一辉.余无双.邓鹏 泽泻现代研究概况[期刊论文]-亚太传统医药 2008(1)
10.王建平.傅旭春 泽泻的化学成分和药理作用研究进展[期刊论文]-浙江医学 2012(14)
11.肖劲逐.李浩勇.张国庆.王声兴.张阳德 夏枯草提取物对肾草酸钙结石模型大鼠肾组织骨桥蛋白表达的影响[期
刊论文]-中国现代医学杂志 2008(8)
12.臧萍 泽泻的研究现状及展望[期刊论文]-中国中医药现代远程教育 2009(6)


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