全 文 ：中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月
·制剂与质量·
新月菱形藻胞外多糖的成分及其硫酸酯的制备
郑雏发1，陈才法1，鲍康德2，王义琴3，储成才3
(1．徐州师范大学江苏省药用植物生物技术重点实验室，江苏徐州221116；2．安徽师范大学生物系
安徽芜湖241000；3．中国科学院遗传与发育生物学研究所，北京100101)
摘要：目的 阐明新月菱形藻胞外多糖(exopolysaccharidesofNitzschialosterium，EPN)的成分、单糖组成及其
硫酸酯化条件。方法新月菱形藻胞外多糖以醇沉法从该藻的培养液中制备}DEAE—Sephedex25柱分离，HPI。C
法测定其质量分数，HPLC测定其相对分子质量；以氯磺酸吡啶法探索新月菱形藻硫酸酯化反应条件。结果新月
菱形藻向胞外分泌3种多糖，相对分子质量分别为EPNl：1．886X105，EPN2：1．41×105，EPN3：1．134×105。3种多
糖的单糖组成均为甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖和岩藻糖。甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖和岩藻糖的
摩尔比在EPNl为4．3：1：5．1：8．9：5．6，EPN2为4．2{7．3：3．7：12．8l 3．4，EPN3为3．5；2．1；4．3。
4．9：4．7。3种多糖的硫酸酯化条件基本一致，提高氯磺酸比例和延长反应时间均有利于增加酯化产物的硫酸根、
提高取代度和酸酯化反应的产率。结论新月菱形藻胞外多糖为酸性多糖，其硫酸酯化产物多糖硫酸酯可能具有
潜在的药理活性。
关键词：新月菱形藻胞外多糖；胞外多糖硫酸酯；单糖组成
中图分类号：R284．1}R284．2文献标识码：A 文章编号：0253—2670(2005)12—1790—04
ComponentsofexopolysaccharidesofNitzschialosterium
andpreparationof heirsulfatedproducts
ZHENGWeifal，CHENCai—fal，BAOKang—de2，WANGYi—qin3，CHUChengcai
3
(1．KeyLaboratoryforBiotechnologyonMedicinalPl ntsofJiangsuProvince，XuzhouNormalUniversity，Xuzhou
221116，China；2．DepartmentofBiology，AnhuiNormalUniversity，Wuhu241000，China；3．Institute
ofGeneticsandDevelopmentalBiology，ChineseAcademyofScience．Beijing100101，China)
Abstract：ObjectiveToelucidatethecomponentsofexopolysaccharidesofNitzschialosterium
(EPN)，thecomponentsofmonosaccharideineachEPN。andtheconditionsforpreparingtheirsulfated
products．MethodsTheEPNSwerepreparedfromthenutrientsolutionbyethan01precipitationand
separatedbyDEAESephadex25column．ThepurityandtherelativemolecularweightofeachEPNwere
determinedbyHPLC．Thechlorosulfericacid—pyridinemethodwasusedforinvestigatingconditionsof
EPNsulfation．ResultsTheEPNswereconstitutedby hree口olvsaccharideswiththeirmolecularweight
1．886×10。(EPNl)，1．4l×105(EPN2)，and．134×105(ENP3)，respectively．Themonosaccharidesin
threeEPNsallcomprisedmannose(Man)，rhamnose(Rha)，glucuronicacid(GluA)，glucose(Glu)，and
fucose(Fuc)，whoseratioas4．3：1：5．1：8．9：5．6inEPNl，4．2I 7．3l 3．7l 12．8：3．4inEPN2，
and3．5：2．1：4．3：4．9：4．7lnEPN3．TheconditionsforsulfationofEPNswerenearlyidentical，
namely，increasinttheratioofchlorosulfericacidandelongationofreactiontimefavoredinobtaining
highercontentofsulfate，degreeofsulfationinEPNmolecular，andpercentofsulfatedproducts．
ConclusionTheEPNsareacidicpolysaccharides．Theirsulfatedproducts一一sulfatedpolysaccharides
maybeofpotentialph rmacologicalactivities．
Keywords：exopolysaccharidesofNitzschialosterium(Ehr．)W．Smith(EPN)；sulfated
exop01ysacchardesofN．closterium；compositionof onosaccharide
现代药理学研究表明，海洋藻类来源的酸性多
糖具有显著的免疫调节活性，用于治疗或预防某些
病毒性疾病”“。多糖的硫酸酯对HIV病毒具有显
著的抑制作用“1。因此，以多糖为主要成分的硅藻胞
鉴鐾景瞽：眢菜篙虿瓷863高新技术项目(2004AA628080)。江苏省高新技术产业化项目(ozKJ360008)
作者简介2蓑移誊29(6。25i：i参磊j甓声陵E-人ma’i教h授yy’z博w@士x’z主nu要,e从du事．c天n然产物成分化学及药理学研究。
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月· 791·
外多聚物具有潜在的药学价值，已引起海洋学家的
高度重视[5]。
新月菱形藻Nitzschiadosterium(Ehr．)W．
Smith是海洋微藻中富含多不饱和脂肪酸浮游种类
之一。在系统分类学上属于硅藻门羽门纹藻纲，是海
洋生态系统初级生产力的常见种类，也是许多珍贵
水产动物的饵料生物重要种类。笔者在培养新月菱
形藻时发现该藻在生长的过程中分泌大量的胞外多
聚物，高达1．5g／i。以上。初步分析表明，新月菱形
藻胞外多聚物只含多糖，不含蛋白质和硫化物[6]。本
文报道新月菱形藻胞外多糖的分离、单糖组成以及
多糖硫酸酯的制备。
1材料与仪器
无水吡啶、无水甲酰胺、浓硫酸(上海化学试剂
站中心化工厂)；氯磺酸、无水乙醇、硫酸钾、氯化钡、
明胶、三氟乙酸、l一苯基3甲基一5一吡唑啉酮(1一
phenyl一3一methol5 pyrazolone，PMP)、蒽酮(北京，
Biodee生物技术有限公司)。单糖对照品：葡萄糖
(上海化学试剂公司)，甘露糖和半乳糖(Sigma公
司)、鼠李糖、葡萄糖醛酸和木糖(上海化学试剂二厂
产品)(以上试剂均为分析纯)。色谱纯乙睛(Fisher
公司)，三蒸水(自制)。EDAESephadex25半透膜
(PharmaeJa公司)i新月菱形藻采自连云港海滨，分
离后作为江苏省药用植物生物技术重点实验室保存
藻种，编号为JKLB003。
722S可见分光光度计(上海精密科学仪器有限
公司)；Waters600高效液相色谱系统，2487紫外检
测器，WatersEmpower色谱工作站，空气压缩机
(南京塞格)。
2新月菱形藻的培养及胞外总多糖的制备
新月菱形藻以ZBNC专用培养基03通气培养，
环境温度为(25士1)C，光照强度为81．04pEm2／s，
光暗周期为10h／14h。取细胞浓度为3×105／mL
的新月菱形藻藻种，按1：5的比例接种于60L培
养缸中(工作体积40L)。以空气压缩机通气搅拌，
压缩空气以400mL／min的速度通过气体分散沙芯
向培养基供气。10d后，将培养液温度提高至30
℃，保持1h，调pH值为8．4，使藻细胞自然沉降，收
集上清液，60℃真空浓缩后，以半透膜对蒸馏水透
析24h。透析液经真空浓缩后，加入3倍体积乙醇沉
淀。沉淀物冻干后得75．96g新月菱形藻胞外多糖。
3新月菱形藻胞外多糖的分离、质量分数及其相对
分子质量的测定
取5g新月菱形藻胞外多糖溶解于蒸馏水中，
上DEAESephadex25色谱柱(100cm×8em)。
(25土1)℃NaCl溶液梯度洗脱，体积流量lmL／
ain。洗脱梯度分别为0．0、0．5、1．0、1．5mol／L。每
20mL收集一次于试管中。硫酸一蒽酮比色法检测”]
(对于吸光度值大于1的洗脱物稀释后测定)。采用
HPLC法检测多糖质量分数o]。样品配称2％浓度，
进样10“L于gBondgelLinear柱，流动相为0．02
mol／L醋酸钠水溶液，体积流量0．5mL／min，柱温
25c。记录出峰的保留时间。
DEAESephadex25色谱柱将新月菱形藻胞外
多糖分成3个组分，即EPNl、EPN2和EPN3。其
中，EPNl的洗脱体积为800mL，峰收集体积为400
mL蒸馏水；EPN2洗脱体积为l840mL，峰收集体
积840“。(0．5mol／LNaCl400mL，1mol／L
NaCl440n：tL)；EPN3的洗脱体积为2460mL，峰
收集体积640mL(1mol／I，NaCI80mL，1．5mol／
LNaCI560mI，)。3个EPN组分洗脱物经真空浓
缩、蒸馏水透析和冷冻干燥，分别得到EPNl
250．45mg(12．5％)、EPN21 088． 9mg(55．1％)
和EPN3647．93nag(32．39％)，见图1。EPNl、
EPN2和EPN3经HPLC分析，HPI．C色谱中出现
单～的对称峰，说明这3个多糖质量分数较高。
0
葵
精
§
生
一
o
o 20 40 60 80 lUU 12U14U
管号(×20mE)
A—EPNB—NaCIgradient1 EPNl2EPN23EPN3
图1新月菱形藻胞外多糖的DEAESephadex25
柱色谱洗脱色谱
Fig．1ChromatogramofEPNbyDEAESephadex25
columnchromatography
采用HPLC法测定多糖质量分数时的液相条
件分别将DextranT一2000、T一110、T一80、T一40、T一20
进样，记录各标准多糖的保留时间。标准多糖的相对
分子质量(Mr)对保留时间(t)作工作曲线，根据
ORIGIN软件求出相对分子质量对保留时问的一元
线性回归曲线。根据标准曲线，求出相对分子质量对
应保留时间的一元线性回归方程：Mr一232．27—
7．11t，r一0．9992，在1×104～2×105呈线性关
系。求出3个EPN的相对分子质量分别为EPNl：
，代什㈡～必
万方数据
·1792· 中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月
1．886×105，EPN2：1．41X105，EPN3：1．134×105。
4新月菱形藻胞外多糖的单糖组成
采用HPI．C柱前衍生法检测单糖组成o]。将待
测样品置于1mL试管中，室温减压真空干燥；向干
燥好的试管中依次加入20L0．5mol／LPMP甲
醇溶液和20pL0．3mol／L氢氧化钠溶液，混匀后
置于70℃水浴中加热反应30rain，取出室温放置
10rain；再加入25pL0．3mol／L盐酸溶液中和，混
匀后用0．5mL乙酸异戊酯萃取，涡旋3min，离心
15rain，小心弃去有机层，再萃取1次，得到下层，加
水150止混匀并离心15rain，用于HPLC分析。色
谱条件：Inertsil0DS(250mm×4．6mm，5pm)色
谱柱；柱温25℃；体积流量1．0mL／min；流动相为
溶剂AE15％乙腈+50mmol／L磷酸缓冲液(pH
6．9)]，溶剂B[40％乙腈+50mmol／L磷酸缓冲液
(pH6．9)]。梯度模式；时间梯度为0min一9min一
25rain，相应梯度为0％B一10％B一55％B。检测
波长250nm，进样体积20pL。
6个单糖对照品PMP衍生物的HPLC图谱显
示6个基线分离的色谱峰，按保留时间先后的顺序
分别为甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、岩藻糖
和木糖，见图2。3个EPN水解产物PMP衍生后，
在与单糖对照品相同的色谱条件下经HPLC检测，
出现5个峰。与单糖对照品的HPLC色谱峰比较，
确定这5个峰分别为甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、
葡萄糖、岩藻糖。其中，EPNl主要由甘露糖、葡萄
糖醛酸、葡萄糖和岩藻糖组成，鼠李糖仅占很小的比
侧。根据HPLC色谱的峰面积算出5种单糖的摩尔
比为4．3：l：5．1：8．9：5．6(按保留时间顺序)；
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
r，rain
l一甘露糖2一鼠李糖3葡萄糖醛酸
4葡萄糖5岩藻糖6木糖
1mannose2rhamnose3-glucuronicacid
4 glucose5-fucose6-xylose
图2单糖对照品PMP衍生物的HPLC色谱
Fig．2HPLCchromatogramof卜phenyl一3一methyl一
5-pyrazolone(PMP)一labeledmonosaccharide
referencesubstances
EPN2的5种单糖中以葡萄糖的量最高，其次为鼠
李糖，各单糖的摩尔比为4．2：7．3：3．7t 12·8：
3．4(按保留时间顺序)。EPN3含有较高比例的葡萄
糖醛酸，各单糖的摩尔比为3．5{2．1：4．3{4．9t
4．7(按保留时间顺序)，见图3。
心心
80 100 120 80 100 120
1一甘露糖2一鼠李糖3一葡萄糖醛酸4一葡萄糖5一岩藻糖
1 mallilose2-rhamnose3一glucuronicacid
4 glucose5 fucose
图3 EPNl(A)、EPN2(B)和EPN3(c)的PMP
衍生物HPLC固
Fig．3HPLCchromatogramsofPMPforEPNl(A)，
EPN2(B)，andEPN3(C)
5新月菱形藻胞外多糖的硫酸酯化
EPN硫酸酯化反应采用氯磺酸一吡啶法。1“⋯。
5．1酯化试剂的制备：将带有冷凝管和搅拌装置的
三颈瓶置冰浴中，将吡啶与氯磺酸按1：1和2t 1
的比例加入，反应温度控制在4℃。反应产物冷却后
置低温冰箱备用。
5．2 EPN硫酸酯化多糖的制备：将EPN54mg加
入4．5mL甲酰胺中搅拌30min，于室温下分别加
入吡啶与氯磺酸两种配比的酯化试剂，分别反应1
h和2h。反应结束用0．1mol／LNaOH溶液中和，
再加入等体积无水乙醇析出沉淀，将沉淀溶于水后
透析72h，冷冻干燥后得新月菱形藻胞外多糖硫
酸酯。
5．3硫酸根的测定：采用BaSO。浊度法“⋯。精确称
量硫酸酯化后的EPN3mg，放入盛有3mL1 tool／
LHCl的试管中溶解，密封后于100℃水浴中水解
6h。冷却后开启试管，内容物低温减压干燥，lmL
蒸馏水溶解并做2个平行样A、B(各0．4mL)。向A
样中加蒸馏水至1．6ml。，再加入8％三氟乙酸水溶
液1．4mL和5mg／mL氯化钡一明胶溶液1．0mL，
混合后静置20rain，在360nm处测定吸光度值。B
样中以5mg／mL明胶溶液1．0mL代替氯化钡一明
胶溶液，加入后同法处理。求A、B两样品吸光度之
差值。将蒸馏水空白对照和含2．3、4．6、9．2、18·4、
36．8、73．7#mol／L硫酸钾标准品溶液重复上述操
作，以测得空白组吸光度和各对照样品组的吸光度
差值对硫酸根浓度作标准雌线，根据ORIGIN软件
求出硫酸根浓度(X)对吸光度(y)的一元线性回归
万方数据
中草药ChineseTraditionalandHerbalDrugs第36卷第12期2005年12月· 793·
方程，即y一0．86+22．9X，r=0．9997，线性范围：
2．31～73．63mmol／l，。进而求出样品中硫酸根的
量。多糖分子中硫酸根的取代度(degreeofsulfate，
DS)以公式DS一[(1．62×S％)／(32—1．02×
s％)]×i00％计算，式中s％为硫酸根的质量分数。
5．4不同条件下EPN硫酸酯化反应比较：结果表
明，同等反应条件下，3种EPN硫酸酯中硫酸根量
时间可稍稍提高硫酸根的量、取代度和反应产物的
得率。如反应时间由1h延长为2h时，硫酸根量可
提高0．6％左右，得率可提高15％左右。增加氯磺酸
比例和延长反应时间可提高硫酸根量，并显著提高
反应产物产率。从表1可以看出，条件3比条件1的
硫酸根量高出0．4％左右，产率高出8％左右。条件
4比条件3硫酸根量高出0．5％，产率高出12％。4
无显著差异。氯磺酸与吡啶等摩尔条件下，延长反应 种反应条件中硫酸根的取代度则没有显著变化。
寰1不同条件下硫酸根的质量分数和EPN的硫酸酯化的产率’
Table1 ContentofsulfateradicalandyieldofsulfatedEPNunderdifferentco ditions
6讨论
新月菱形藻为海洋硅藻中的浮游种类，是水产
养殖中重要的饵料生物种类之一。该藻在ZBNC培
养基中生长速度极快，8d即可达到指数生长后期，
生物量可达1．9g／L，同时产生大量的由多糖组成
的胞外多聚物“]。研究结果显示，新月菱形藻胞外多
聚物中含有3种多糖，分别是EPNl，相对分子质量
为1．886×105，占总多糖的12．5％；EPN2，相对分
子质量为1．41×105，占总多糖的55．1％}EPN3，相
对分子质量为1．134×105，占总多糖的32．39％。3
种多糖的单糖组成一致，都是由甘露糖、鼠李糖、葡
萄糖醛酸、葡萄糖和岩藻糖组成，但各单糖在每种多
糖中的摩尔比不同。3种多糖都含有较高摩尔比的
葡萄糖、岩藻糖、甘露糖和葡萄糖醛酸。由于新月菱
形藻胞外多聚物中不含硫化物，因此胞外多糖也不
含硫酸根。为了增加EPN的药理活性潜力，实验采
用4种条件对3种EPN进行了硫酸酯化反应。结果
表明，氯磺酸比例越大，反应时间越长，越有利于提
高硫酸根在多糖中的比例和取代度，并且越有利于
提高目标产物的产率。
多糖的硫酸酯化对于提高多糖的抗病毒和抗肿
瘤等方面的药理活性具有重要作用，有时甚至起决定
作用“]。但多糖的药理活性更多的还是取决于糖苷键
的连接方式和空间构型等““。有关新月菱形藻多糖
的药理活性、糖苷键的连接方式将作进一步研究。
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万方数据
新月菱形藻胞外多糖的成分及其硫酸酯的制备
作者： 郑维发， 陈才法， 鲍康德， 王义琴， 储成才， ZHENG Wei-fa， CHEN Cai-fa， BAO
Kang-de， WANG Yi-qin， CHU Cheng-cai
作者单位： 郑维发,陈才法,ZHENG Wei-fa,CHEN Cai-fa(徐州师范大学,江苏省药用植物生物技术重点实
验室,江苏,徐州,221116)， 鲍康德,BAO Kang-de(安徽师范大学,生物系,安徽,芜湖
,241000)， 王义琴,储成才,WANG Yi-qin,CHU Cheng-cai(中国科学院遗传与发育生物学研
究所,北京,100101)
刊名： 中草药
英文刊名： CHINESE TRADITIONAL AND HERBAL DRUGS
年，卷(期)： 2005,36(12)
被引用次数： 1次
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引证文献(1条)
1.刘筱潇.孙颖颖.管习超.王长海 3种海洋微藻多糖提取工艺的研究[期刊论文]-海洋通报 2010(5)
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