全 文 ：不同品种红花黄酮类成分的 HPLC 含量
测定及其遗传稳定性研究
张　戈, 郭美丽3 , 李　颖, 张汉明, 苏中武Ξ
(第二军医大学药学院, 上海　200433)
　　红花为菊科一年生草本植物红花 Ca rtham us
tinctorius L 1 的干燥花, 是常用的活血化瘀中药之
一, 具有抗凝、防栓、扩张血管之功效[1 ] , 其中黄酮类
成分是红花中的一类主要活性成分, 目前市场上出
售的红花注射液中主要活性成分是总黄酮, 其中的
黄色素含量甚微。Shu2H uey 等研究表明, 黄酮类成
分漆树黄酮、山柰酚、桑色素、槲皮素、杨梅素具有显
著抑制由AD P、凝血酶、花生四烯酸诱导的血小板
聚集作用[2 ] , 陈文梅等研究表明, 红花黄酮成分具有
抑制血小板激活因子介导的血小板活化作用[3 ]。笔
者在对红花黄酮类化学成分研究的基础上[4 ] , 通过
紫外分光光度法测定了在山西、新疆两个生态地区
栽培的不同红花品种中红花总黄酮的含量, 并通过
R P2H PL C 法测定了其中芦丁、山柰酚232O 2芸香糖
苷的含量, 旨在为红花优良品种的选育以及药材和
制剂的质量控制提供科学依据。
1　材料与方法
111　种植材料: 　红花 22 个品种, 1998 年 4 月分
别在新疆乌鲁木齐、山西清徐种植 1 年, 1999 年 4
月在山西种植 1 年。试验地土壤肥力中等, 播前施入
基肥。种植密度分别为 016 m ×0106 m , 0133 m ×
012 m , 出苗后及时间苗和定苗, 花期及时采花, 8 月
收获种子。
112　试剂和仪器　岛津UV - 265FW 型紫外分光
光度仪;W aters 510- 996 高效液相色谱仪; 冰醋酸
(A R )、乙腈 (色谱纯) ; 芦丁、山柰酚232O 2芸香糖苷
对照品均为红花中分离提纯得到, H PL C 法检测其
纯度均高于 9810%。
113　色谱条件: 　色谱柱: R P - C 18 (250 mm ×416
mm , 5 Λm ) ; 检测波长: 26518 nm ; 流动相: 乙腈2水2
冰醋酸 (1915∶8015∶015) (pH = 318) ; 体积流量:
110 mL öm in; 室温: 20 ℃。
114　对照品溶液的配制
11411　精密称取山柰酚232O 2芸香糖苷对照品 5
m g, 加入 50% 甲醇溶解并定容至 10 mL , 供紫外测
定用。
11412　精密称取芦丁和山柰酚232O 2芸香糖苷对照
品各 5 m g, 分别加入甲醇溶解并定容至 5 mL , 供
H PL C 测定用。
115　供试液的配制
11511　精密称取不同产地红花样品各 200 m g, 精
密加入 50% 甲醇 10 mL , 60 ℃超声提取 115 h, 离心
(3 000 röm in) 30 m in, 取上清液, 微孔滤膜 (0145Λm )滤过。精密吸取滤液 012 mL , 50% 甲醇定容至
10 mL , 供紫外测定用。
11512　精密称取不同产地红花样品各 200 m g, 精
密加入 50% 甲醇 10 mL , 60 ℃超声提取 115 h, 离心
( 3 000 röm in ) 30 m in, 取上清液, 微孔滤膜 (0145Λm )滤过, 供H PL C 测定用。
2　结果与分析
211　检测波长的选择: 将芦丁和山柰酚232O 2芸香
糖苷的对照品溶液在UV 2265FW 紫外分光光度计
下进行扫描, 两者在 26518 nm 处均有较强吸收, 故
选择 26518 nm 波长进行含量测定。
212　标准曲线的绘制
21211　总黄酮标准曲线的绘制: 精密吸取紫外测定
对照品溶液 011、012、013、014、015、016、017、018、
019 mL , 分别用 50% 甲醇定容至 10 mL 量瓶中, 在
26518 nm 处测定光。以质量浓度 (ΛgömL ) 为横坐
标, 吸光度为纵坐标, 得线性回归方程: Y =
01064 75+ 01038 945 X , r= 01999 6。线性范围为
5～ 45 ΛgömL 。
21212　芦丁标准曲线的绘制: 分别吸取芦丁对照品
溶液 5、15、25、35、45、55、65、75、85、95 ΛL 置于 1
mL 量瓶中, 甲醇定容至刻度, 混匀, 吸取 20 ΛL 进
样, 按上述色谱条件, 测定峰面积, 以进样量为横坐
·1141·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 12 期 2004 年 12 月
Ξ 收稿日期: 2004203203
基金项目: 国家自然科学基金资助项目 (39700012)
作者简介: 张　戈 (1975- ) , 男, 河南省安阳市人, 博士研究生, 主要从事中药的品质评价和质量控制研究。3 通讯作者　T l: (021) 25070395 8005　E il: L 01@ i
标, 峰 面 积 为 纵 坐 标, 得 线 性 回 归 方 程:
Y = - 34 162182+ 1 280 28715 X , r= 01999 4。说
明芦丁在 011～ 119 Λg 与峰面积呈线性关系。
21213　山柰酚232O 2芸香糖苷的标准曲线绘制: 分
别吸取山柰酚232O 2芸香糖苷对照品溶液 5、20、35、
50、65、80、95、110、125、140 ΛL 置于 1 mL 量瓶中,
加甲醇至刻度, 混匀, 吸取 20 ΛL 进样, 按上述色谱
条件, 测定峰面积, 以进样量为横坐标, 峰面积为纵
坐 标, 得 线 性 回 归 方 程: Y = - 185 451147 +
1 557 499198 X , r= 01996 5。说明山柰酚232O 2芸香
糖苷在 011～ 218 Λg 与峰面积呈线性关系。
213　稳定性试验: 分别取两对照品溶液各 1 mL 混
合, 按H PL C 色谱条件测定, 结果两者在 24 h 内均
稳定, 芦丁: R SD = 0162% ; 山柰酚232O 2芸香糖苷:
R SD = 0180%。另取山柰酚232O 2芸香糖苷对照品
015 mL , 用 50% 甲醇定容至 10 mL 量瓶中, 进行紫
外测定, 结果表明室温放置 6 h 内稳定, R SD =
1108%。
214　精密度试验: 取混合后的对照品溶液 20 ΛL 进
样, 按色谱条件测定, 重复 5 次, 芦丁: R SD =
0194% ; 山柰酚232O 2芸香糖苷: R SD = 1101%。
215　重复性试验
21511　精密称取同批红花样品 5 份, 每份约 200
m g, 按上述紫外测定供试品溶液制备方法及条件进
行紫外测定, 结果R SD = 1156%。
21512　精密称取同种红花样品 5 份, 每份约 200
m g, 按上述H PL C 供试品溶液制备方法及色谱条件
进行测定, 芦丁: R SD = 1142% ; 山柰酚232O 2芸香糖
苷: R SD = 2176%。
216　加样回收率试验
21611　紫外测定法: 精密称取 100 m g 同批红花粉
末 5 份, 加入一定量的山柰酚232O 2芸香糖苷对照
品, 加入 50% 甲醇至 10 mL , 依上述方法提取、离
心、滤过, 精密吸取滤液 012 mL , 50% 甲醇定容至
10 mL , 测定其吸光度, 计算回收率得 9815% ,
R SD = 2126% (n= 5)。
21612　H PL C 法: 精密称取 20 m g 同批红花粉末 5
份, 加入一定量的芦丁和山柰酚232O 2芸香糖苷对照
品, 加入 50% 甲醇至 1 mL , 依上述方法提取、离心、
滤过, 吸取 20 ΛL 进样, 测定峰面积, 计算回收率得
芦丁: 10114% (R SD = 1145% , n = 5) , 山柰酚232O 2
芸香糖苷: 10712% (R SD = 3160% , n= 5)。
217　样品测定: 根据上述所建立的方法, 通过紫外
分光光度法对所搜集栽培的不同红花品种中总黄酮
的含量进行测定, 并通过H PL C 法对芦丁、山柰酚2
32O 2芸香糖苷的含量进行测定 (图 1) , 并对其结果
进行比较, 结果见表 1。
3　结论
311　研究表明: 不同红花品种间总黄酮及芦丁、山
柰酚232O 2芸香糖苷的含量存在显著差异, 总黄酮质
量分数为 1162%～ 7190% , 其中合肥红花、亳州红
花、鱼台红花品种最优, 芦丁质量分数为 01018%～
01140% , 其中亳县红花、延津大红袍、束鹿红花品种
最 优, 山 柰 酚232O 2芸 香 糖 苷 的 质 量 分 数 为
01085%～ 01895% , 其中合肥红花、亳州红花、鱼台
红花品种最优。红花各品种中芦丁含量均小于山柰
酚232O 2芸香糖苷的含量。相关分析结果表明, 红花
总黄酮含量与山柰酚232O 2芸香糖苷的含量呈正相
关 ( r= 0185353 3 )。在新疆、山西同一年份种植时,
不同品种间含量存在显著差别, 而同一品种总黄酮
含量及芦丁、山柰酚232O 2芸香糖苷的含量虽有变化
但小于品种间的差异; 不同年份同一地区种植时, 不
同品种间的含量差异规律及同一品种的含量变化规
律与同一年份、不同地区种植时基本一致。以上分析
12芦丁　22山柰酚232O 2芸香糖苷
12ru tin　22kaempfero l232O 2ru tino side
图 1　芦丁 (A)、山柰酚-3-O -芸香糖苷 (B)和红花样品 (C)
F ig11　HPLC chromatogram s of rutin (A) , kaempferol-3-O -rutinoside (B) , and C. tinctor ius samples (C)
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表 1　不同红花品种中黄酮类成分的含量 (x±s, n= 3)
Table 1　Flavono ids in d ifferen t spec ies of C1tinctor ius samples (x±s, n= 3)
编号 品种 年份
总黄酮ö%
山西 新疆
芦丁ö%
山西 新疆
山柰酚232O 2芸香糖苷ö%
山西 新疆
1 哈密有刺 1998 5126±0101 4148±0101 01049±01001 01052±01003 01299±01007 01165±01004
1999 5108±0101 01056±01003 01297±01007
2 哈密无刺 1998 4102±0102 5169±0101 01044±01001 01103±01004 01170±01006 01243±01009
1999 4148±0101 01058±01002 01220±01002
3 吉木萨尔 1998 5103±0101 5161±0101 01045±01002 01024±01001 01177±01005 01176±01007
无刺 1999 4165±0101 01048±01003 01181±01001
4 塔城无刺 1998 4180±0101 4184±0101 01049±01002 01042±01002 01219±01016 01192±01016
1999 4194±0101 01052±01005 01221±01002
5 若羌无刺 1998 5125±0101 5103±0101 01025±01001 01023±01001 01161±01002 01194±01016
1999 4149±0101 01023±01001 01146±01003
6 若羌有 1998 4134±0101 4190±0101 01024±01001 01094±01003 01174±01006 01185±01004
刺白 1999 4142±0101 01026±01001 01192±01003
7 张掖无刺 1998 4156±0101 4199±0101 01021±01001 01075±01001 01131±01006 01115±01002
1999 4198±0101 01027±01001 01136±01002
8 张掖有刺 1998 4197±0101 4196±0101 01026±01001 01090±01002 01135±01002 01176±01004
1999 4154±0101 01021±01001 01127±01001
9 延津大 1998 5132±0102 4182±0102 01059±01002 01115±01002 01193±01016 01172±01016
红袍 1999 4191±0101 01059±01001 01194±01005
10 无刺红 1998 4155±0101 4131±0102 01033±01001 01078±01004 01161±01006 01137±01009
1999 4176±0101 01038±01001 01170±01002
11 新乡红花 1998 4153±0101 5131±0101 01031±01001 01033±01001 01163±01002 01111±01003
1999 4177±0101 01034±01004 01172±01002
12 荷泽红花 1998 4116±0101 4189±0102 01052±01002 01079±01003 01142±01002 01157±01006
1999 4145±0101 01055±01002 01190±01001
13 芮城红花 1998 6102±0101 1163±0101 01098±01003 01019±01001 01279±01003 01093±01008
1999 5159±0101 01090±01002 01201±01026
14 束鹿红花 1998 4125±0101 5119±0101 01033±01006 01138±01002 01166±01008 01254±01007
1999 4138±0101 01039±01004 01209±01004
15 荷泽无刺 1998 4142±0101 5124±0101 01048±01003 01103±01002 01168±01005 01229±01006
1999 4162±0101 01048±01002 01250±01005
16 淇县红花 1998 4166±0101 5164±0102 01051±01001 01074±01002 01143±01005 01231±01002
1999 4172±0101 01061±01009 01169±01001
17 亳州红花 1998 5199±0101 6154±0101 01107±01004 01106±01001 01361±01003 01563±01011
1999 5144±0101 01112±01004 01338±01001
18 鱼台红花 1998 6195±0101 6122±0101 01041±01001 01108±01002 01858±01037 01448±01005
1999 6190±0101 01053±01001 01802±01018
19 合肥红花 1998 6196±0101 7182±0108 01053±01009 01062±01001 01671±01032 01786±01022
1999 6158±0101 01073±01002 01721±01015
20 吴忠红花 1998 4130±0102 4135±0102 01055±01001 01031±01001 01232±01007 01198±01002
1999 4126±0101 01048±01003 01195±01064
21 余姚红花 1998 4198±0101 4158±0101 01047±01003 01054±01001 01194±01003 01126±01004
1999 4124±0101 01049±01003 01230±01001
22 无刺大 1998 5119±0102 5116±0101 01057±01001 01068±01002 01275±01002 01131±01004
红袍 1999 4193±0101 01067±01003 01278±01003
结果表明, 红花的品种中黄酮类成分的含量主要由
遗传因素决定, 而环境因素的影响居次要地位。
312　在山西种植的芮城红花, 其总黄酮及芦丁、山
柰酚232O 2芸香糖苷含量均显著高于同年在新疆种
植的, 而不同年份同一地区种植时, 其总黄酮及芦
丁、山柰酚232O 2芸香糖苷的含量变化不明显, 说明
环境因素的适宜与否, 对其所含黄酮类成分的含量
影响较大, 有待进一步研究。
313　研究表明, 山柰酚232O 2芸香糖苷具有较好的
药理活性 (另文发表) , 建议作为红花药材质量评价
的指标之一。
314　优良的种质资源是进行中药材优良品种选育
及 GA P 生产的前提, 本研究结果为红花优良品种
的选育及 GA P 生产提供依据。
References:
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RP-HPLC 法测定荆芥穗中胡薄荷酮的含量
张　丽, 单鸣秋, 孔　铭, 丁安伟Ξ
(南京中医药大学, 江苏 南京　210029)
　　荆芥穗为唇形科一年生草本植物荆芥
S ch iz onep eta tenu if olia (Ben th1) B riq1 的干燥地上
部分。荆芥穗性温、味辛; 其生品具有解表散风、透疹
之功效, 主治风寒感冒、咽喉肿痛及多种皮肤病, 为
中医临床常用药物。荆芥穗炒炭后专功止血, 可用于
吐血、便血、崩漏、产后血晕等。《中华人民共和国药
典》2000 年版中尚无荆芥穗药材指标性成分的含量
测定方法, 本实验以R P2H PL C 法对其挥发油中的
主要成分胡薄荷酮的含量进行了测定, 方法回收率
高、分离度好, 结果满意。
1　仪器和试药
PE- 100 高效液相色谱仪,W aters- 2487 紫外
检测器, 岛津L IBROR A EL - 40SM 电子分析天平
(精确度为十万分之一)。
胡薄荷酮对照品由美国A ldrich 公司提供 (供
含量测定用, 批号: 10529PO )。按《中华人民共和国
药典》2000 年版一部附录Î D 高效液相色谱法中
的“不加校正因子的主成分自身对照法”进行对照品
纯度检查, 图谱积分时间大于胡薄荷酮保留时间的
2 倍, 结果表明胡薄荷酮对照品纯度为 98% 以上。改
变流动相比例使保留时间增减 1 倍以上, 色谱中未
出现杂质峰。
甲醇为色谱醇 (淮安精细化工研究所) , 水为亚
沸蒸馏水, 其余试剂均为分析纯。
荆芥穗购于安徽亳州药材市场, 产地为安徽, 共
3 批。经南京中医药大学吴启南教授鉴定为唇形科
植物荆芥 S ch iz onep eta tenu if olia (Ben th1) B riq1
的干燥花穗。
2　方法与结果
211　色谱条件: 色谱柱: 中国科学院大连化学物理
所, K rom asil C 18 (200 mm ×416 mm , 5 Λm ) ; 流动
相: 甲醇2水 (80∶20) ; 体积流量 110 mL öm in; 测定
波长 252 nm ; 柱温为 30 ℃; 进样量: 10 ΛL ; 理论板
数以胡薄荷酮峰计不得低于3 000。
212　内标溶液的制备: 取萘 150 m g, 精密称定, 置
25 mL 量瓶中, 加甲醇溶解并稀释至刻度, 摇匀, 即
得 (含萘 610 m gömL )。色谱图见图 1。
213　供试品溶液的制备
21311　药材供试品溶液的制备: 取药材粗粉 110 g,
精密称定, 置 25 mL 具塞锥形瓶中, 加入 10 mL 甲
醇, 超声处理 (功率 250 W , 频率 50 kH z) 20 m in, 滤
过 ; 滤渣和滤纸再加10 mL 甲醇 , 超声处理 (功率
图 1　内标物萘 (A)、胡薄荷酮 (B)、荆芥穗 (C)、荆芥穗挥发油 (D )的 HPLC 图
F ig11　Chromatogram s of naphthalene (A) , pulegone (B) , Sp ica Sch izonep etca (C) , volatile o il of Sp ica Sch izonep etea (D )
·4141· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 12 期 2004 年 12 月
收稿日期: 2004 02 12