全 文 ：要原因。因而有效的降低脑组织中 Ca2+ 含量, 可减
轻脑细胞的不可逆性坏死。SA T P 能明显降低实验
性脑缺血大鼠脑组织 Ca2+ 含量, 表明其对脑组织的
保护作用可能与降低脑组织中 Ca2+ 含量有关。
脑缺血时细胞内 Ca2+ 超载可激活依赖 Ca2+ 蛋
白水解酶, 促使次黄嘌呤 (Hpy) 代谢生成尿酸, 此
过程产生大量氧自由基, 可攻击生物膜中多聚不饱
和脂肪酸引起脂质过氧化反应, 形成脂质过氧化物,
降低膜的流动性, 使膜的通透性增加, 大量水分子内
流, 导致线粒体及细胞肿胀, 抑制电子传递和氧化磷
酸化, 进一步加重能量代谢障碍, 溶酶体酶释放引起
细胞自身消化, 最终导致细胞死亡[3, 4 ]。SA T P 能明
显降低实验性脑缺血大鼠脑组织M DA 含量, 提高
SOD 活性, 提示其可能通过清除氧自由基及提高抗
氧化酶活性对缺血脑组织产生保护作用。
References:
[ 1 ]　Sm ith M L , Bendek G1 M odels fo r studying long2term re2
covery fo llow ing fo rebrain ischem ia in the rat [J ]1 A cta N eu2
rol S ci, 1984, 69 (4) : 38524011
[ 2 ]　T ang G, Zhang J T 1 Research advance on m echan ism w ith
cerebral ischem ic in ju ry and therapeu tic po licy [J ]1 Ch in J
N ew D rug s (中国新药杂志) , 2000, 9 (12) : 80928121
[ 3 ]　Slater T F1 F ree2radical m echan ism in tissue in ju ry [J ]1
B iochem J , 1984, 222 (1) : 11
[ 4 ]　Do rm andy T L 1 F ree radical ox idation and an tiox idan ts [J ]1
L ancet, 1978, 10 (1) : 64726511
山楂果总黄酮的提取分离及体外抗肿瘤活性
张　妍1, 李厚伟2, 孙建平1, 张永春1, 何树庄1, 杨宝峰1Ξ
(11 哈尔滨医科大学 药理教研室, 黑龙江 哈尔滨　150086; 21 哈尔滨医科大学附属第二医院, 黑龙江 哈尔滨　150086)
　　山楂 C ra taeg us p inna lif id a Bge. 系蔷薇科植
物, 含有多种生物活性物质, 如三萜酸、黄酮等。其中
黄酮类成分有降压、调血脂、增加冠脉流量、强心、抗
肿瘤等药理作用[1 ]。由于山楂果实中果胶含量很高,
给提取分离工作带来很大困难, 因此对山楂有效成
分的定量研究多集中于山楂叶和山楂核。本实验采
用 4 种方法提取山楂果中的总黄酮并进行含量测
定, 结果表明以 60% 乙醇为溶剂, 超声提取, 经大
孔吸附树脂分离, 提取效率较高, 且方法简便易行。
山楂提取物的抗肿瘤活性已有报道[2 ] , 但其作用机
制未见报道。本实验采用激光扫描共聚焦显微镜技
术, 通过给药前后细胞内钙和 DNA 含量变化对山
楂果总黄酮体外抗肿瘤作用机制进行初步探讨。
1　材料与方法
111　药品与试剂: 山楂: 购于药材市场, 经哈尔滨医
科大学生药教研室王伟教授鉴定为山楂 C ra taeg us
P inna tif id a Bge. 的果实。芦丁对照品: 购于中国药
品生物制品检定所。52氟脲嘧啶注射液 (52Fu) : 上
海旭东海普药业有限公司生产, 批号 000101, 用前
生理盐水配制。胎牛血清: H yclone 生产。R PM I1640
培养基: Gibco 生产。噻唑蓝 (M T T ) : Sigm a 生产,
用前以无血清R PM I1640 配成 1 m gömL。二甲基亚
砜 (DM SO ) : Sigm a 生产。碘化丙啶 (P I) 染料:
Sigm a 生产, 以生理盐水配成 100 ΛgömL , 4 ℃ 避光
放置。 F luo23öAM : B io2R acl 生产, 配成浓度为
10 Λmo lömL , - 20 ℃ 保存。RNA 酶 (RN aseA ) :
Calb iochem 分装, 用 PBS 液配成 215 m gömL , 在
80～ 100 ℃ 加热 15 m in, 冷至室温后分装, - 20 ℃
保存。正丁醇、甲醇、乙醇、氨水、氯化钙均为国产分
析纯。实验用水为自制超纯水。
112　细胞株: 人喉癌 H ep 22 细胞, 培养于含 10%
胎牛血清的 R PM I1640 培养基中 (内含青、链霉素
各 100 U ömL , 谷氨酰胺 01293% ) , 5% CO 2、37 ℃
温箱中培养, 每 2～ 3 d 传 1 代。细胞株由哈尔滨医
科大学微生物教研室提供。
113　仪器: UV 22201 岛津紫外分光光度计, 日本
产。离心机, 北京医疗仪器修理厂。B io2R ad3550 型
酶标仪, 美国产。 In sigh t p lu s 激光扫描共聚焦显微
镜, 美国M erid ian 产。O lympu s IX50 倒置显微镜,
日本产。RCO 3000TVBB CO 2温箱, 美国产。
114　山楂果总黄酮提取分离方法考察[3 ]
11411　提取方法: ①水煎煮提取: 山楂果肉 30 g,
用蒸馏水煎煮 2 次, 滤过, 浓缩, 得山楂浸膏。②乙
醇回流提取: 取山楂果肉 30 g, 以 60% 乙醇回流提
取 2 次, 每次 115 h。合并提取液, 回收乙醇, 得山楂
浸膏。③甲醇为溶剂, 索氏提取: 取山楂果肉 30 g,
以甲醇为溶剂, 用索氏提取器回流提取 4 h, 回收甲
醇, 得山楂浸膏。④超声提取: 取山楂果肉 30 g, 加
·787·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 7 期 2004 年 7 月
Ξ 收稿日期: 2003208227
作者简介: 张　妍 (1973—) , 女, 哈尔滨市人, 讲师, 硕士, 研究方向为药理学。E2m ail: zhangyan lhw @ 163. com
60% 乙醇, 超声 3 次, 每次 45 m in, 合并提取液, 回
收乙醇, 得山楂浸膏。
11412　大孔吸附树脂柱的制备[4 ]: ①预处理: 取市
售大孔吸附树脂, 用乙醇加热回流洗脱至洗脱液蒸
干后无残留物。②装柱: 以乙醇湿法装柱, 继续用乙
醇在柱上流动清洗, 不时检测流出的乙醇, 至与水混
合不呈白色混浊为止 (取 1 mL 乙醇加 5 mL 水)。
然后以大量的蒸馏水洗去乙醇, 备用。
11413　大孔吸收树脂分离提取总黄酮: 将所得山楂
浸膏分别加入适量蒸馏水, 搅匀, 加入 CaC l2 1 g, 静
置过夜。离心, 分别收集上清液, 用氨水调 pH 至
7～ 8, 分别加入大孔吸附树脂柱中, 调节流速 5 mL ö
m in, 用蒸馏水洗去杂质, 以乙醇为流动相解吸附,
回收乙醇, 得总黄酮提取物。将水提取物稀释成含生
药 1 g ö10 mL 的溶液, 其他提取物稀释成含生药
1 gö200 mL 的溶液, 分别测定总黄酮含量。
11414　总黄酮的含量测定: 精密称取芦丁对照品
10 m g, 置 50 mL 量瓶中, 加 60% 乙醇稀释至刻度,
摇匀, 即得 012 göL 的对照液。标准曲线的绘制: 精
密吸取对照液 1、2、3、4、5 和 0 mL (空白) , 分别置
10 mL 量瓶中, 各加 60% 乙醇溶液使成 7 mL , 精
密加入 5% 亚硝酸钠 013 mL , 摇匀, 放置 6 m in, 精
密加入 10% 三氯化铝溶液 013 mL , 摇匀, 放置 10
m in, 加入 1 mo löL 氢氧化钠溶液 2 mL , 分别用
60% 乙醇稀释至刻度, 摇匀, 放置 10 m in, 置比色杯
中, 在 510 nm 处测吸光度 (A ) , 测 3 次取平均值,
以浓度为纵坐标,A 值为横坐标计算回归方程和相
关系数。
115　M T T 法测定提取物的抗肿瘤作用: 细胞以每
孔 1×104接种于 96 孔培养板, 5% CO 2、37 ℃ 温箱
中培养 24 h 后, 分别加入生理盐水, 山楂果总黄酮
及 52氟脲嘧啶 (阳性药) 溶液, 山楂果总黄酮及阳
性药的浓度为 100、10、1、011、0101 ΛgömL , 继续培
养 48 h 后, 加入 50 ΛL M T T , 温育 4 h, 弃去培养
基, 加入 150 ΛL DM SO , 在平板摇床上摇匀, 在酶标
仪 495 nm 读板, 根据测得的吸光度值计算存活率。
存活率= 实验组吸光度值ö对照组吸光度值×100%
116　F luo23öAM 染色测定细胞内 Ca2+ 浓度变
化[5 ]: 6 孔培养板中, 加入终质量浓度为 15、30 Λgö
mL 的山楂果总黄酮和生理盐水, 各设 2 个平行孔,
混匀后, 5% CO 2、37 ℃ 温箱中培养 48 h 后, 用
01125% 胰蛋白酶消化, PBS 液清洗, 加入 100 ΛL
F luo23öAM 染液, 37 ℃ 避光放置 1 h。用适量 PBS
液制成细胞悬液, 在激光扫描共聚焦显微镜下观察
细胞内钙变化, 并记录细胞的荧光强度, 以细胞的荧
光强度反映 Ca2+ 浓度, 在激发波长为 488 nm、发射
波长 530 nm , 40 倍物镜下观察。
117　P I 染色测定细胞内DNA 含量变化[6 ]: 6 孔培
养板中, 加入终质量浓度为 15、30 ΛgömL 的山楂果
总黄酮和生理盐水, 各设 2 个平行孔, 混匀后, 5%
CO 2、37 ℃ 温箱中培养 48 h 后, 用 01125% 胰蛋白
酶消化, PBS 清洗, 70% 乙醇 4 ℃ 固定 115 h, 加入
200 ΛL PBS 和 250 ΛL RN aseA 液, 37 ℃ 共同保温
10 m in, 荧光染料 P I 750 ΛL , 室温避光染色 30
m in。加 PBS 制成细胞悬液, 在激光扫描共聚焦显微
镜下记录细胞的荧光强度, 以反映DNA 的含量。在
激发波长 488 nm、发射波长 630 nm , 40 倍物镜下
观察。
118　倒置显微镜下观察细胞形态学变化: 培养瓶中
加入终质量浓度为 15 ΛgömL 的山楂果总黄酮, 5%
CO 2、37 ℃ 温箱中培养 48 h, 倒置显微镜下 (10×
20) 观察给药前后细胞形态改变。
119　统计学方法: 采用 Sigm ap lo t 5. 0 软件求得药
物的 IC 50; 采用 t 检验分析给药前后细胞内钙和
DNA 含量变化。
2　结果
211　不同提取方法对山楂果总黄酮提取收率的影
响: 结果见表 1。
表 1　不同提取方法的提取率
Table 1　Y ield of extract by differen t methods
方　法 A 含量ög 提取率ö%
水提 01422 0 01012 0104
醇提 01475 9 01278 0193
超声提取 11031 5 01588 1196
索氏提取 11055 7 01600 2100
212　标准曲线: 回归方程为 Y = 9. 297×10- 2A +
21101×10- 3, r= 0. 998 9。
213　对 H ep 22 细胞生存率的影响: 见表 2。结果表
明山楂果总黄酮对 H ep 22 细胞有抑制作用, 且呈明
显的剂量依赖性。山楂果总黄酮及 52氟脲嘧啶的
IC 50值分别为 16124、0190 ΛgömL。
214　对细胞内钙和DNA 含量的影响: 山楂果总黄
酮作用 H ep 22 细胞 48 h 后, 细胞内钙浓度显著升
高, 而 DNA 含量明显降低。高、低浓度山楂果总黄
酮组的细胞内钙和DNA 含量与相应的空白对照组
相比差异均有显著性 (P < 0105)。见表 3。
215　形态学观察: 倒置显微镜下正常肿瘤细胞呈多
角形, 体积较大, 细胞核体积约占细胞总体积的
2ö3, 细胞聚集生长。山楂果总黄酮作用 48 h 后细胞
·887· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 7 期 2004 年 7 月
表 2　山楂果总黄酮对 Hep-2 细胞生存率的影响 (n= 5)
Table 2　Effect of f lavono ids in C. p inna lif ida fruit
on surv iva l rate of Hep-2 cells (n= 5)
　　组　别 质量浓度ö(Λg·mL - 1) 生存率ö%
山楂果总黄酮 　　　　100 　　 22124
10 58117
1 84136
011 90117
0101 91117
52氟脲嘧啶 100 20121
10 28124
1 50117
011 80118
0101 83121
表 3　山楂果总黄酮对细胞内钙离子及 D NA
含量的影响 (x±s, n= 40)
Table 3　Effect of f lavono ids in C. p inna lif ida fruit on
Ca2+ and D NA of Hep-2 cells (x±s, n= 40)
组　别
质量浓度ö(Λg·mL - 1) F ICa2+ DNA
生理盐水 - 214± 45 　986±189
山楂果总黄酮 15 552± 963 457±1173
30 1 648±2753 262± 593
　　与生理盐水组比较: 3 P < 0105
　　3 P < 0105 vs N S group
变圆, 体积明显变小; 细胞核畸变, 体积变小, 且细胞
数目明显减少, 细胞单个生长。表明山楂果总黄酮有
效的抑制了肿瘤细胞的增殖。
3　讨论
　　实验结果表明对于山楂果中总黄酮的提取, 有
机溶剂提取效率明显高于水提取。索氏提取为连续
回流提取, 因此提取效率高于单纯回流提取。超声提
取可以破坏细胞壁, 使细胞内的有效成分大量溶于
有机溶剂, 所以提取效率也较高。以甲醇为溶剂、经
索氏提取器提取、大孔吸附树脂分离, 提取效率最
高; 以 60% 乙醇为溶剂、超声提取、经大孔吸附树
脂分离, 提取效率较高。超声提取简便易行, 节约有
机溶剂, 所用试剂对人体较为安全, 因此适于规模生
产。索氏提取虽然效率略高, 但耗时、费力, 且所用试
剂对人体危害较大。因此, 超声提取是一种较为理想
的提取方法。
山楂果总黄酮对正常细胞的生长无明显影响,
但对肿瘤细胞的生长却有显著抑制作用。共聚焦实
验结果显示山楂果总黄酮使肿瘤细胞DNA 含量明
显降低, 表明山楂果总黄酮是通过抑制肿瘤细胞
DNA 的生物合成, 从而阻止瘤细胞的分裂繁殖。最
新研究结果认为细胞内钙离子浓度与细胞凋亡过程
关系密切。大量证据表明在多种细胞中凋亡的诱导
和抑制与信号传导通路有关, 细胞内游离的 Ca2+ 浓
度对信号传导起着重要作用。Ca2+ 与细胞凋亡的两
个主要阶段即基因凋亡过程的起始阶段和凋亡的最
后通路——Ca2+ 依赖性的核酸内切酶的激活都有关
系。Ca2+ 还可通过调节某些转录因子的活性, 导致
基因表达的变化, 诱导凋亡的发生。因此, 胞浆 Ca2+
浓度的增加可作为凋亡起始的早期信号。共聚焦实
验结果表明山楂果总黄酮使肿瘤细胞内钙离子浓度
明显升高, 山楂果总黄酮在体外对 H ep 22 细胞的抑
制作用可能是通过钙超载, 进而导致细胞凋亡。
References:
[ 1 ]　T raditional Ch inese H erb Group of N o. 157 Ho sp ital of PLA 1
H aw tho rn [J ]1 Ch in T rad it H erb D rug s (中草药) , 1975, 5
(5) : 462551
[ 2 ]　L iu Z P, Guo F C, Yang H Y, et a l. T he inh ib ito ry effect of
haw tho rn ex tract on L 1210 ascites carcinom a [J ]1 J H enan
O ncol (河南肿瘤学杂志) , 1993, 6 (4) : 24322451
[ 3 ]　L iu C Y, T ang L H , Gu Z L , Effects of differen t m ethods on
the ex traction rate of flavono ids from haw tho rn [J ]1 A cta
A cad M ed S uz hou (苏州医学院学报) , 1998, 18 (12) : 12661
[ 4 ]　D eng S W , M a S C1 Iso lation of the ex tract of L ig usticum
w allich ii F ranch by adso rben t resin [J ]1 Ch in T rad it H erb
D rug s (中草药) , 1999, 30 (1) : 232241
[ 5 ]　Dong D L , Sun J P, L uo D L , et a l. Effect of berberine on
the cyto so lic calcium concen tration in the single ven tricu lar
cell of gu inea p ig [J ]1 Ch in J P harm acol T ox icol (中国药理
学与毒理学杂志) , 2000, 14 (2) : 12821301
[ 6 ]　Zhao C J , Kong F Y, L iu Q H , et a l. A pop to sis of gliobas2
tom a m ultifo rm e cells induced by VM 226 treatm en t in v itro
[J ]1 Ch in J Cancer (癌症) , 2000, 19 (7) : 64926521
癃清片对大鼠前列腺炎的抑制作用
韩双红, 王玉芬, 陈卫平, 韩行湛, 张富庚Ξ
(天津市医药科学研究所, 天津　300070)
　　癃清片 (LQ T ) 主要由黄连、泽泻、赤勺、金银
花等中药精制而成, 具有清热解毒、凉血通淋之功
效。临床用于热淋所致的尿频、尿急、尿痛、尿短、腰
痛等症。本实验主要探讨其抗前列腺炎的药理作用,
旨在为其临床应用提供理论依据。
1　材料
·987·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 35 卷第 7 期 2004 年 7 月
Ξ 收稿日期: 2003210215