全 文 ：灯盏花素注射液中细菌内毒素动态比浊法测定的研究
劳海燕 ,林秋晓 ,刘秋琼
(广东省人民医院 药学部 ,广东 广州　 510080)
摘　要: 目的　应用动态比浊法鲎试验定量测定灯盏花素注射液中的细菌内毒素含量。 方法　通过对样品中定量
添加标准内毒素的干扰试验 ,检测其回收率应在 50% ～ 200%范围。 结果　将样品进行 1 /12稀释可以有效地消除
其对鲎试验的干扰。 结论　动态比浊法鲎试验可以高效地测定样品中的细菌内毒素含量。
关键词: 动态比浊法鲎试验 ;灯盏花素注射液 ;细菌内毒素 ;干扰试验
中图分类号: R286. 01　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2002) 06 0505 03
Study on bacterial endotoxin in BREVISCAPINI INJECTION
*
by kinetic turbidimetric limulus test
LAO Hai-yan, LIN Qiu-x iao, LIU Qiu-qiong
( Depa rtment o f Pharmacy, Guangdong People s Hospital, Guang zhou Guangdong 510080, China )
Abstract: Object　 To determine the bacterial endotoxin in BREV ISCAPINI IN JECTION ( BI) by ki-
netic turbidimetric limulus test. Methods　 By spiking the amount of standa rd endo toxin into BI sample,
the interference test was fulfiled to detect the recovery in the range of 50% -200% . Results　 A 12-fo ld di-
lution to BI sample is ef fectiv e to eliminate the interference in limulus test. Conclusion　 The kinetic tur-
bidimetric limulus test provides an ef ficient w ay to detect the bacterial endo to xin in BI sample.
Key words: kinetic turbidimetric limulus test; BREV ISCAPIN I IN JECTION ( BI) ; bacterial endotox-
in; interference test
* BREV ISCAPIN I IN JECTION consists of breviscapine, used in the t reatment of paraly sis induced
by cerebrovascula r occlusion.
　　灯盏花素注射液为灯盏花素无菌水溶液 ,可改
善脑血循环 ,增加脑血流量 ,降低血管阻力和抗血小
板凝聚 ,用于治疗闭塞性脑血管疾病所致的瘫痪及
脑出血所致的后遗症。 本实验采用动态比浊法鲎试
验 ,建立灯盏花素注射液的细菌内毒素检查法。动态
比浊法鲎试验是采用光电仪器检测鲎试验反应物
37℃保温时吸光度随时间的变化 ,预设吸光度 ,检
测反应物到达预设吸光度的反应时间以定量测定细
菌内毒素。对天然药物注射液用动态比浊法鲎试验
进行细菌内毒素测定具有巨大的临床意义 ,可为临
床安全用药提供技术支持。
1　材料及仪器
细菌内毒素检查用水 (规格: 30 mL /Amp,湛江
安度斯生物有限公司 ) ,动态比浊法鲎试剂 (批号:
991230L,λ= 0. 015 EU /m L, 1. 2 mL /Amp,湛江安
度斯生物有限公司 ) ,细菌内毒素国家参考标准品
(批号: 981, 9 000 EU /Amp,中国药品生物制品检
定所 ) ,灯盏花素注射液 (批号: 000510, 001007,
001012,规格: 5 mL /Amp,中美合资黑龙江迪龙制
药有限公司 ) ; EDS-99细菌内毒素检测仪 (北京金
山川科技发展有限公司 ) ,岛津 UV-2401型紫外分
光光度计 ; O RION 420型 pH计 (美国 )。
2　方法与结果
2. 1　试验参数:本试验按“供试品干扰试验”方法进
行 [1 ] ,各试验参数如下 [2 ]: M: 灯盏花素人用最大剂
量 0. 17 mL /kg. h, K:热原反应阈值 5. 0 EU /kg· h,
L: 灯盏花素细菌内毒素限值 L= K /M= 29 EU /mL,
MVD:最大有效稀释倍数 MVD= L /λ(动态比浊法鲎
试验:λ为标准曲线最低点浓度 ,本试验中λ= 0. 05
EU /mL, MVD= 232)。
2. 2　实验方法
2. 2. 1　标准曲线制作及可靠性 [1 ]:用细菌内毒素检
·505·中草药　 Ch inese Tradi tional and Herbal Drugs　 2002年第 33卷第 6期
收稿日期: 2001-10-08
基金项目:广东省重点科技攻关项目 ( 2KM 054063)
作者简介:劳海燕 ( 1963-) ,女 ,海南琼海人 ,副主任药师 ,执业药师 , 1985年毕业于广东药学院 ,获理学学士学位 , 2001年至今攻读中山
大学医学院药理专业硕士学位 ,研究方向为细菌内毒素与输液热原反应 ,发表论文 10余篇。
Tel: 020-83827812-2517　 E-mail: laoh yan@ 21cn. com.
查用水对细菌内毒素国家参考标准品 (批号: 981)进
行稀释 ,使其细菌内毒素终浓度分别为 5. 00,
0. 500, 0. 050 0 EU /mL,各取 0. 100 mL分别加到
预先加有 0. 100 mL鲎试剂反应管内 ,混合均匀 ,插
入 EDS-99细菌内毒素检测仪内进行检测。 其中每
一浓度重复 3管 ,并同时作阴性对照 3管。实验数据
按最小二乘法进行统计分析 ,其标准曲线为:
LogT= 2. 732 37- 0. 290 36 LogC , r= - 0. 999 09,
|r|= 0. 999 09> 0. 980,反应时间在 339～ 1 334 s,
而阴性对照管反应时间> 3 600 s,故标准曲线成立。
2. 2. 2　干扰试验: 干扰预试验: 灯盏花素最大有效
稀释倍数为 232,本试验中为获得较高的检查灵敏
度和较快的反应时间 ,仅对其在较小的范围进行一
系列稀释 ,以筛选到最好的检查浓度。 将灯盏花素
(批号: 000510)制备成原液 , 1 /4, 1 /8, 1 /12, 1 /16 5
个浓度系列 ,每个浓度下分别取 0. 100 mL样品加
0. 100 mL鲎试剂作为样品检查 ( S或 N PC) ;取
0. 100 mL样品加 0. 100 mL鲎试剂在加入 5. 00
EU /mL内毒素溶液 10. 0μL作为样品阳性对照
( PPC) , PPC中强化的内毒素浓度为 0. 500 EU /
m L,处在标准曲线的中点浓度。将溶液分别平行 2
组 ,插入 EDS-99细菌内毒素检测仪内进行检测。另
外还按标准曲线制作方法制备标准曲线及阴性对照
(N C) ,其标准曲线为: LogT= 2. 732 37- 0. 290 36
LogC , r= 0. 999 09,|r|> 0. 980,内毒素浓度范围为
0. 05～ 5. 00 EU /mL,反应时间在 339～ 1 334 s,而
阴性对照管反应时间> 3 600 s,故标准曲线成立。结
果见表 1。
　　结果可见 ,灯盏花素原液对仪器检测光源有极
强吸收而有干扰作用外 ,灯盏花素 3个浓度 ( 1 /8, 1 /
12, 1 /16)其干扰试验添加内毒素的回收率均在有效
范围 50% ～ 200%之间 ,表明 1 /8开始无干扰 ,在日
常检查中选用 1 /12倍稀释。灯盏花素 1 /4回收率虽
在有效范围 ,但其 PPC两管在反应结束前显橙色 ,
意味着因检测光吸收而提前中断反应 ,干扰尚未完
全消除。
干扰试验:为确证 1 /12稀释的有效性 ,进行 3个
批号灯盏花素 (批号: 00051, 0001007, 001012)正式
干扰试验。以灯盏花素 1 /12稀释为样品检查 ( S) ,其
他具体操作参照预试验。将溶液分别平行 3组 ,插入
EDS-99细菌内毒素检测仪内进行检测 ,其标准曲线
为: LogT= 2. 738 8- 0. 265 2 LogC , r= - 0. 996 7,
|r|> 0. 980,内毒素浓度范围为 0. 05～ 5. 00 EU /
m L,反应时间在 364～ 1 276 s,而阴性对照管反应时
间> 3 600 s,故标准曲线成立。 结果见表 2。
表 1　灯盏花素注射液 (批号: 000510)干扰预试验
稀释倍数 检查项目 反应时间
( s)
内毒素浓度
( EU /m L)
回收率
(% )
原液 S
原液 PPC > 10 无效试管
> 10
4 S 1 018 0. 165 1
　 803
4 PPC 　 583 0. 815 1 130. 0
　 562
8 S 1 712 0. 019 5
1 678
8 PPC 　 579 0. 720 1 140. 1
　 609
12 S 2 526 0. 004 9
2 527
12 PPC 　 676 0. 553 9 109. 8
　 605
16 S 3 448 0. 002 0
3 093
16 PPC 　 598 0. 676 0 134. 8
　 612
　　注:原液反应窗 ( S)完全无显示
表 2　灯盏花素注射液 1 /12稀释干扰试验
批号 检查项目 反应时间
( s)
内毒素浓度
( EU /m L)
回收率
(% )
000510 S 1 928 0. 008 7
1 894
1 961
000510 PPC 　 547 0. 8074 159. 7
　 580
　 580
001007 S 1 098 0. 045 2
1 298
1 340
001007 PPC 　 598 0. 684 3 127. 8
　 607
　 612
001012 S 1 025 0. 048 9
1 259
1 375
001012 PPC 　 583 0. 706 1 131. 4
　 631
　 589
　　结果可见 , 3个批号灯盏花素在 1 /12稀释下 ,
其干扰试验添加内毒素回收率均在有效范围
50% ～ 200%之间 ,对鲎试验没有干扰作用。
2. 2. 3　定量检查:根据以上干扰试验结果对 3个批号
灯盏花素注射液以 1 /12稀释进行定量检查 ,其标准曲
线为: LogT = 2. 738 79 - 0. 265 18 LogC , r = -
0. 996 73,|r|> 0. 980,内毒素浓度范围为 0. 05～
5. 00 EU /mL,反应时间在 364～ 1 276 s,而阴性对照
管反应时间> 3 600 s,故标准曲线成立。结果见表 3。
·506· 中草药　 Ch inese Tradi tional and Herbal Drugs　 2002年第 33卷第 6期
表 3　灯盏花素注射液动态比浊法鲎试验定量测定结果
批号 稀释倍数 S平均值
( EU /m L)
PPC平均值
( E U /m L)
回收率
(% )
内毒素实际值
( EU /m L)
000510 12 0. 008 7 0. 807 4 159. 7 0. 104 4
001007 12 0. 045 2 0. 684 3 127. 8 0. 542 4
001012 12 0. 048 9 0. 706 1 137. 4 0. 586 8
2. 2. 4　消除干扰影响的试验: 对检测光源 405 nm
的吸收作用以及不合适 pH值是导致鲎实验抑制的
重要因素 ,故进行以下 2项试验。
对检测光源的吸收试验: 以上干扰试验结果可
见 ,灯盏花素原液对仪器检测光源有极强的吸收而
有干扰作用 ,为了确证这个问题 ,将灯盏花素 (批号
000510)原液 ( 5 mg /mL)用细菌内毒素检查用水稀
释成系列浓度 1. 25( 1 /4稀释 ) , 0. 625( 1 /8稀释 ) ,
0. 312 5( 1 /16稀释 ) , 0. 156 2( 1 /32稀释 ) , 0. 078 12
mg /mL( 1 /64稀释 ) ,测定 405 nm处吸光度 ( A ) ,
将数据进行最小二乘法回归 ,得直线方程: C=
0. 241 A+ 0. 036 1, r= 0. 978 15。
　　 pH值试验: 将原液 , 1 /2, 1 /4, 1 /8, 1 /16, 1 /32,
1 /64浓度系列测定其 pH值 ,结果是 8. 00, 7. 79,
7. 59, 7. 26, 6. 87, 6. 49, 6. 13。
结果可见 , 405 nm波长处吸光度值与样品浓度
成良好线性关系 ,随着样品的稀释 ,吸光度值减少 ,
干扰也减少直到消失。pH值在 6～ 8范围内 ,样品和
鲎试剂在检测混合物 pH值范围为 6. 0～ 8. 0[ 3] ,故
pH值不是鲎试验干扰因素。
3　讨论
3. 1　计算公式: 回收率% = ( PPC实测值 - NPC实
测值 ) /强化内毒素浓度。动态比浊法干扰试验是以
样品的添加内毒素平均回收率来判断 ,若回收率在
50%～ 200%范围内 ,表明样品溶液对鲎试剂反应无
干扰影响 [4 ]。
3. 2　灯盏花素原液 N PC两管插入反应试管后 ,反
应窗无任何显示 ,说明原液对光吸收极强 ; PPC两
管反应时间分别为 10 /10 ( s)、 10 /10 ( s) ; (符号“ /”
前数据是反应物到达预设吸光度的反应时间 ,符号
“ /”后数据是反应完成时间 )。 由于灯盏花素原液对
仪器检测光源 405 nm波长有极强吸收而干扰了仪
器正常的检测过程 ,加了强化内毒素的 PPC管光吸
收作用尤其显著 ,使反应曲线提前结束。反应窗上显
示好像是被提前中断反应而出现橙色 (比如反应中
途拔出反应试管 )。 样品 1 /4回收率在有效范围内 ,
但其 PPC两管反应时间分别是 600 /1 200, 580 /
980 s,即分别在 1 200, 980 s时提前中断反应而呈
橙色 ,说明 1 /4尚未完全消除干扰。故灯盏花素原液
对仪器检测光源吸收作用是灯盏花素注射液对动态
比浊法鲎试验的主要干扰因素。
3. 3　细菌内毒素与鲎试剂的反应是基于一系列丝
氨酸蛋白酶的酶促放大作用产生的 ,其干扰因素包
括: 不合适的 pH环境 ,对照内毒素聚集或吸附 ,不
适宜的阳离子浓度 ,酶或蛋白质的修饰 ,非特异性的
鲎试剂激活物 ,对仪器检测光源的吸收作用。大部分
的干扰作用可通过适当的样品稀释将干扰消除 ,故
稀释法是排除干扰的最基本方法。
3. 4　灯盏花素注射液按 1 /12稀释用动态比浊法鲎
试验进行细菌内毒素检查是可行的。对于这类天然
药物注射液用动态比浊法鲎试验进行细菌内毒素检
查比凝胶法具有更大的优越性。
参考文献:
[1 ]　中国药典 [ S] . 2000年版 .二部 .
[ 2 ]　夏振民 . 药品细菌内毒素检查的限值 [ J] . 药物分析杂志 ,
1995, 15( 3): 54-56.
[3 ]　美国药典 [ S] . 23版 .
[4 ]　 EP Supplem ent [ S] . 1999.
正交试验法优选胃安冲剂的制备工艺
刘　芳 1 ,王小平 2 ,向爱民 1 ,伍伟祯 1 ,王　越 2
( 1. 广东开平中医院 ,广东 开平　 529300; 2. 广东彼迪药业有限公司 ,广东 开平　 529300)
摘　要: 目的　优选胃安冲剂的制备工艺。方法　以厚朴酚、白术多糖、盐酸小檗碱为指标成分 ,采用正交试验法对
胃安冲剂的制备工艺进行优选。 结果　优化工艺为:厚朴、枳实采用水提醇沉 ( 20倍量水 , 0. 5 h,提取 3次 , 95%乙
·507·中草药　 Ch inese Tradi tional and Herbal Drugs　 2002年第 33卷第 6期
收稿日期: 2001-08-14
基金项目:广东省中医药管理局 2000年立项科研课题 ( 100070)
作者简介:刘　芳 ( 1968-) ,女 ,湖南益阳人 ,副主任中药师 , 1990年毕业于湖南中医学院中药系 , 1990～ 1995年任职于广东彼迪药业有
限公司 ,负责多项新产品的开发及检测 ,现为广东省中医药学会医院中药管理委员会委员 ,在各级药学专业杂志发表论文 10
余篇 ,研究方向为中药制剂与中药检验。