全 文 ：· 药材
提高长春花冠瘦细胞中叫噪生物碱含量的研究
南 开大学生命科学学院 (天津 3 。。0 7 1) 王淑芳 帝 王宁宁 王 勇 田俊英
摘 要 研究 了长春花冠痪细胞接种物年龄与接种量对悬浮培养细胞生物产 量的影响 , 探讨 了以
大 丽花轮枝抱菌的匀浆物为外源刺激物处理冠澳细胞 , 对细胞 生长和 叫噪生物碱积累的作用 。 确
立 了外源刺激物产生效应的最适条件 。
关键词 长春花冠瘦细胞 外源刺激物 叫噪生物碱
夹 竹 桃 科 植 物 长 春 花 Ca th a ra nt h us
ro se u : 是一种重要的中草药 。 从它的根 、茎 、
叶 、种子中可分离 出 70 余种生物碱 , 其 中三
分之一是属叫噪类化合物 。 它们均具有抗癌
活性 , 其作用是抑制细胞有丝分裂 , 阻碍纺锤
体形成 , 使其分裂中期 中止 。 其中长春碱 、长
春新 碱已 用于 临床治疗急性 白血病 、绒毛膜
上皮癌等 , 对其它肿瘤也有一定疗效 〔‘〕。 目前
这些药物主要是从整体植株获得 。 但植物中
该成分含量很低 , 生长受 自然条件限制 , 周期
长 , 原料来源困难 。因此利用细胞培养技术 生
产叫噪生物碱的研究倍受国内外专家 的高度
重视 。这方面的工作国外已取得了很大进展 ,
比如加拿大用长春花愈伤细胞培养生产阿呜
碱 , 德 国用长春花愈伤细胞生产蛇根碱 已 达
到中试或工业化生产水平 。
细胞培养技术 中也存在很多函待解决的
问题 。其中之一是愈伤细胞培养基中 , 除加人
必需的营养成分外 , 还需加人适量生长素和
细胞分裂素 , 否则 , 细胞不能生长 。 而外源植
物激素会干扰植物 的次级代谢产物的积累 ,
导致药用成分含量降低 。为此 , 改为以冠痪细
胞为材料更为理想 。 长春花冠痪细胞是将长
春花愈伤细胞与土壤农杆菌 Cs : 共培养时 , 该
细菌中 T 一D N A 片段将会移人到愈伤细胞 核
D N A 中去 , 长 出冠痪细胞来 。 因为 T 一D N A
片段 中含有对合成生长素和细胞分裂素的必
需基因 , 所 以冠瘦细胞在无任何激素培养基
中能正常增殖 。 而且该组织生长迅速不易分
化 。在适宜条件下 , 其生长和叫噪生物碱含量
比愈伤细胞高得多 〔2〕 。
目前 , 外源刺激物 (lic itor s )对植物次级
代谢影响的研究倍受国内外普遍关注 。 外源
刺激物是指一些生物 (多为真菌提取物 )或非
生物 的分子 (如无机盐等 ) , 它们能够通过信
号传 导途径去刺激植物发生防御反应 , 诱导
植 物特 定 的刺 激代谢 产 物 的形成 和积 累 。
1 9 8 6 年 U . Ei ler t 等人研究 了不 同来源真菌
匀浆物对长春花愈伤细胞叫噪生物碱含量的
影响 , 效果很好 〔3〕。
本文在原来工作 的基 础上 , 进一步探讨
了细胞悬浮培养中的接种物最适年龄的接种
量 , 研究 了大丽花轮枝抱菌匀浆物对 叫噪生
物碱积累的影响 , 以期为大规模细胞培养生
产叫噪生物碱提供理论和实验依据 。
1 材料与方法
1
.
1 材料
1
.
1
.
1 长春花冠 瘦细胞培 养 : 细胞 在加有
1 0 m L MS 培养液的 50 0 m L 三角瓶中摇床
(1 0 0一 1 2 0 r / m in )培养 , 培养液 中不加任何
植物激素 , 培养温度为 25 ℃一27 ℃ 。
1
.
1
.
2 外源刺激 物.制备 : 按照 U . Ei ler t 方
, 冬d这re s s ; W a n g S hu fa n g , Co lle罗 o f L ife Se ie n e e s , N a n k a iU n iv e r s ity , T ia n jin方 向森潍履赢甜荔跳霜鑫壕黯磊跳今拿氯议髦措豁魏暑糯清缪黔黯少, 主要科研
.
1 3 0
.
法〔3〕 , 将大丽花轮枝抱菌接种于 M S 培养基
中悬 浮培养 7 d 后高压灭 菌备用 。
1
.
2 方法
1
.
2
.
1 冠瘦细胞生长的测定 : 收获悬浮培养
细胞 , 真空抽滤至不滴水后称其鲜重 (取 3 瓶
细胞鲜重平均值 ) , 表示培养过程中细胞生长
的变化 。
1
.
2
.
2 冠瘦细胞个数的测定 : 准确吸取细胞
均匀分 布的悬 浮液适 当稀释后 , 放在计算盘
中 , 在显微镜下记数 (取 3 次平均值 ) 。
1
.
2
.
3 ngl 噪生物碱含量 的测定 : 按照 M or -
ri s 等〔4〕的方 法测定 了细胞 内叫噪生物碱 的
含量 。
2 结果与讨论
2
.
1 接种物年龄及接种量对悬浮培养生物
产量的影响 : 植物细胞培养过程 中 , 接种物年
龄和接种量对继代培养生物产量影响很大 。
为提高细胞生长速率 , 我们对适宜接种物年
龄和接种量进行了选择 。
2
.
1
.
1 适宜悬浮培养接种年龄的选择 : 取不
同天数悬浮培养细胞分别接种于相同量的液
体培养基 中 , 使原始 细胞 密度 为 10 万 / 毫升
左右 。 悬浮培养 18 d 后收获 , 结果如图 1 所
示 : 悬浮培养细胞年龄为 16 d 时进行继代扩
大培养生物产量最高 。
量很低 , 密度超过 2 万 / 毫升时 , 细胞增殖速
率与接种量呈正相关 系 , 密度超过 10 万 /毫
升时 , 细胞个数不再增加 。
2
.
2 外源刺激物对悬浮培养细胞的刺激作
用 : 比较几 种真菌匀浆物对冠瘦细胞刺激作
用 , 得知以 适量大丽花轮枝抱菌制备 的外源
刺激物能 明显提高叫噪生物碱的积累 。 为确
立刺激效果的最适条件 , 我们作了 以下实验 。
2
.
2
.
1 外 源刺激物对不同年龄细胞 中叫噪
生物碱含量的影响 : 于悬浮培养不同天数 的
细胞培养液 中分 别加人 s m L 外源刺激物 ,
对照加 s m L 水 , 继续培养 1 8 h 后收获细胞 ,
称其鲜重并进行叫噪生物碱含量的分析 。 结
果表 明 : 外 源刺激物对细胞生物产量无多大
影响 。而叫噪生物碱的含量均有明显提高 , 如
图 3 所示 , 一般 比对照提高 1 倍左右 , 其中以
培养 15 d 的细胞对外源刺激物处理最为敏
感 , 叫噪生物碱积累最多 , 是对照的 2 倍 。
2
.
2
.
2 外源刺 激物处理时间对细胞 中叫噪
生物碱含量 的影响 : 取 s m L 外 源刺激物加
入到培养 巧 d 的细胞培养液 中 , 每隔 Z h 取
样一次测定叫噪生物碱含量 。 结果如图 4 所
示 :处理 18 h 效果最好 , 时间增加反而下降 ,
对照变化不大 , 结果 与国外 以 el ic it o r s 刺激
长春花愈伤细胞的报道是一致的〔们 。
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牟. ‘培养天效) 接种细饱个欲 (万/ 老升 )
5 1 0
年带 (堆养天效) 时间 t ( h)
图 1 悬浮培养接种物 图 2 悬浮培养接种 t
年龄与生物产 t 与 生物 产t 的关
的关 系 系
图 3 外源 刺激物对不 图 4
同年龄细胞中叫
噪生物碱含t 的
影响
2. 1. 2 悬浮培养接种量与生物产量的关系 :
取不 同量 的培养 15 天的悬浮培养细胞接种
于相卜量的液体培养基中 , 使原始细胞 密度
(万 /毫 升 )分 别 为 0 . 4 、 2 . 0 、 5 . 0 、 1 0 . 0 、 1 5 . 0
悬 浮培养 18 d 收获 , 称 鲜重 结果 如图 2 所
示 : 初始细胞密度小于 2 万 /毫升 时 , 生物产
《中草药》1 9 9 9 年第 3 0 卷第 2 期
2
.
2
.
3 外源刺激物剂量对细胞 中叫噪生物
碱含量的影 响 : 取不 同剂量的外源刺激物加
人到培养 15 d 龄的细胞培养液中处理 18 h ,
收获细胞并测定 叫噪生物碱含量 , 结果如 图
5 所示 。 与对照相 比 , 不同剂量的外源刺激物
的加人都程度不同地提高了叫噪生物碱的含
·
1 3 1
-
量 。 其 中以 s m L 剂量为最好 , 细胞中叫噪生
物碱 含量 提高 2 倍多 。
从我们这些研究结
果 可 以 看 出 , 长春 花冠
痪对大丽花轮枝抱菌匀
浆物的刺激反应 比较敏
0
. 仍 0 . 5 0
荆t (m L)
,
·的 ’。·的感 , 这种 外源刺 激物 的
软喊.、,侧归如催州娜
图 5 外源刺激物荆 冠痪细胞 的次级代谢活
t 对细胞中叫噪生物 动产生了明显的调节作
碱含t 的影响 。 用 。 在本文描述 的实验
条件下 , 以 5 m L 外源刺激物加人的培养 15 d
的细胞培养系统处理 18 h , 能显著提高细胞
中叫噪生物碱含量 , 比对照提高 2 倍多 , 有关
外源刺激物提高长春花冠瘦细胞药用成分的
研究尚未见过报道 。
参 考 文 献
1 常敏毅 . 抗庙药物 . 长 沙 : 湖南科学技术出版社 , 1 9 9 6 :
11 8
2 王宁宁 , 等 . 生物工程学报 , 1 9 9 4 , 1 0 ( 3 ) : 2 4 4
3 E ile r t U
, e t a l
.
J Pla n t Phy s io lo g y
,
1 9 8 6
,
1 2 6
:
1 1
4 M o r r is P
, e t a l
.
Pla n t C e ll C u lt u r e— a Pr a e t ie a l aP-
p r o a e h
.
1 9 8 5
:
1 2 7
( 1 9 9 8
一
0 8
一
2 6 收稿 )
S tu d i e s o n th e E n h a n e in g A c c u m u la ti o n o f I n d o le A lk a lo id s in C r o w n
G a ll C e lls o f M a d a g a s e a r Pe r iw in k le (C a tha ra n thu s ro s e u s )
W
a n g S h u fa n g
,
W a n g N in g n in g
,
W
a n g Y o n g
, e t a l
.
(C o lle g e o f Life S e i e n e e s
,
N a n k a i U n iv e r s ity
,
T ia n
-
jin 3 0 0 0 7 1 )
A bs tr a c t I n flu e n e e s o f e e ll a g e ( a t in o e u la t io n ) a n d th e a m o u n t i n o e u la t e d o n th e b io lo g i e a l m a s s
p r o d u e t io n o f e u lt u r e d e e lls in Ca tha ra
n th u s ro
s e u s (L
.
) G
.
1) o n s u s P e n s io n w e r e i n v e s t i g a t e d
.
E ff e e t s o f
t r e a t m e n t b y V e rt i c i lli u m d a h lia e ho m o g e n a t e a s e li e it o r o n th e e e ll g r o w th a n d a e e u m u la t io n o f in d o le a lka
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lo id s i n th e e r o w n g a ll e e lls w e r e s t u d i e d a n d t he o p t im a l s t im u la t io n e o n d i t io n s w e r e d e t e rm in e d
·
K e y w o r d s C a th a r a n th u s ro
se u s (L
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) G
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D o n e lie i t o r i n d o le a lk a lo id s
贯叶连翘组织培养及植株再生研究
陕西师范大学 生命科学学院 (西安 7 1 0 0 62) 徐元红 . 李发荣 王结之
摘 要 在 国内首次研究 了贯 叶连翘胚轴和子叶 的培养方法 , 分别通过器官型和器官发生型途径
获得 了大量再生植株 , 部分可移栽成活 。 实验表 明 , 在 B A 和 2 , 4 一D 不 同组合的M S 培养基上 , 愈伤
组织易于诱导 , 繁殖速度快 , 并且通过初步检测证明了愈伤组织 中金丝桃素存在的可能性 。 再生植
株产生极容易 , 繁殖系数高 。
关挂词 贯叶连翘 组织培养 愈伤组织再生植株 金丝桃素
贯叶连翘 J如户e ri cu m Pe l了bra tu m L . 是
藤黄科金丝桃属植物 , 为多年生草本 , 在民间
已有 2 4 0 0 余年的药用历史 。 80 年代后期 , 由
于 发 现 其 植 物 体 内含 具 有 显 著 抗 D N A 、
R N A 病毒繁殖作用的化合物—金丝桃 素
( h yp e r i e in ) 〔‘〕而引起人们对该植物 的广泛兴
趣 。 目前 , 金丝桃素 已作为药物在德国 、英国
等国家上市 , 主要用于治疗抑郁症 〔2 · 3〕、 甲型
肝炎 、乙型肝炎 〔4 , s, 及艾滋病‘6 , ’〕。 国内外对贯
叶连 翘的研究 主要集 中在化 学成分 〔8 ·” 、药
理 〔4 , ”, ‘。〕等方面 。 由于金丝桃素的广泛应用前
景 , 国内外各个公司对贯叶连翘野生资源进
.
A d d r e s s
: W a n g b h u 士a n g , U o lle g e o t L 一士e b e le n e e s , s h a n x 一 N o r m a l U n lve r s 一ty 一入 l一 a n徐元 红 女 , 31 岁 , 硕士研究 生 , 讲师 。 陕西 师范大学植物生理教研室任教 , 并于植物细胞工程实验室从 事植物组织 、细胞培养等研究工作 。 先后发 表《关于伊贝母微体繁殖植株再生途径 的研究》、《伊贝母与平贝母胚状体诱导条件的 比较 》等论
.
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