全 文 ：特别是血清脂蛋白成分直接相关 [4 ]。因此 ,研究海嘧
啶对红细胞膜流动性的影响可以从细胞水平和分子
水平探讨其作用机制。众所周知 ,细胞恶性增殖的分
子基础之一即跨膜信号传递链索的异常 ,肿瘤细胞
的恶性转化与再分化可能分别与跨膜信号传递链索
的损伤和修复有关 ,改变或扩增其中的某些分子 ,就
可能引起信号传递链索的失常和分子程序的紊乱 ,
造成细胞的转化和生长失控 ,引起恶性肿瘤。修复和
改变其中的某些分子就可能使损伤了的跨膜信号传
递链索得到修复 ,使恶性肿瘤细胞再分化而促使癌
细胞逆转 ,以上程序涉及到多种蛋白质 ,特别是膜蛋
白和膜脂类。细胞癌变与癌变逆转都与膜流动有
关 [7 ]。本研究证明海嘧啶能降低荷瘤小鼠红细胞膜
的微粘度 ,使膜流动性升高 ,有助于集体红细胞免疫
功能的调整 ,有助于使损伤的跨膜信号传递链索恢
复正常 ,提高对肿瘤细胞的杀伤能力。
DNA分子位于细胞中的染色体、线粒体中 ,是
一种由简单重复单位构成的线形序列所决定的高分
子聚合物 ,几乎存在于所有细胞遗传 ,信息储存在
DNA分子中 ,然后以 DNA为模板合成 RNA,继而
以 RNA为模板完成蛋白质多肽链的合成。在细胞增
殖过程中可将其周期划分为 G1、 S、 G2和 M期 ,肿瘤
细胞周期与正常细胞周期的速率和时间都是相似
的 ,即周期的长短主要由 G1期的长短来决定。因此 ,
理想的药物应该是杀死癌细胞而正常细胞免受其
害。 如绝大多数抗肿瘤药物可以通过直接损伤
DNA、抑制 DNA聚合酶、抑制有丝分裂器 ,抑制拓
扑酶等方式作用于肿瘤细胞 [8 ]。本研究结果表明: 海
嘧啶降低肿瘤细胞内 DNA含量从而发挥其抗肿瘤
作用。 随着给药时间的变化 ,海嘧啶以高、中剂量作
用 24, 36 h效果较好。随着给药时间的延长 ,其作用
并不显著 ,由此可以说明 ,海嘧啶对肿瘤细胞的影响
与其生长周期有关 ,而肿瘤细胞的周期动力学特点
是细胞群主体分布于 DNA合成活跃的 S期 ,我们的
研究结果又发现肿瘤细胞内 DNA含量明显降低 ,因
此 ,可以推测海嘧啶为一周期特异性药 ,其主要特点
是通过影响肿瘤细胞内 DNA的合成而发挥作用 ,但
是海嘧啶是通过何种途径影响到 DNA的生物合成
还有待于进一步研究。
参考文献:
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1-甲基-4-苯基吡啶离子诱发大鼠小脑颗粒细胞凋亡
蒲小平 ,李晓蓉 ,李慧农 ,李长龄⒇
(北京医科大学药学院 药理室 ,北京　 100083)
摘　要: 目的　建立 1-甲基 -4-苯基吡啶离子 ( 1-me thy1-4-phenyl py ridinium ion, M PP+ )诱导的大鼠小脑颗粒细胞
凋亡模型。方法　 M PP+ 处理大鼠小脑颗粒细胞 ,分别用甲基绿 -派诺宁染色 , DN A凝胶电泳 ,流式细胞术进行检
测。 结果　浓度为 50μmo l /L M PP+ 使小脑颗粒细胞发生凋亡。 结论　以 M PP+ 为诱导剂建立的大鼠小脑颗粒细
胞凋亡模型 ,可用于研究和帕金森病 ( PD)有关的细胞凋亡的调控机制和筛选抗 PD药物。
关键词: 1-甲基 -4-苯基吡啶离子 ( M PP+ ) ;小脑颗粒细胞 ;凋亡
中图分类号: R285. 51　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 08 0715 04
Induction of rat cerebellar granular neuron apoptosis
by 1-methyl-4-phenyl pyridinium cation
PU Xiao-ping , L I Xiao-rong , L I Hui-nong , L I Chang-ling
·715·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 8期
⒇ 收稿日期: 2000-02-12基金项目:国家重点基础研究发展规划项目课题 , No. G1998051124作者简介:蒲小平 ( 1956-) ,女 ,甘肃人 ,副研究员 ,博士 , 1995年获日本北海道大学药学博士学位 ,现在北京大学药学院分子与细胞药理学系工作。 研究方向:神经细胞凋亡蛋白酶 Caspase-3为靶的药物研究。
　　 ( Depa rtment o f Pharmaco log y, Co lleg e of Pha rmacy , Beijing Univ ersi ty of Medical Sciences, Beijing 100083, China)
Abstract: Object　 To establish a ra t cerebellar g ranula r neuron ( CGN) apopto sis model by 1-methy-
4-pheny l py ridinium cation ( M PP
+ ) . Methods　 Ra t CGN were t reated w ith M PP+ and the resulting cell
morpho logy examined by methyl green-pyronine staining, agarose gel elect ropho rsis of DN A and f low cy-
tometry. Results　 MPP+ at the concentration of 50μmol /L can induce CGNs apopto sis o f the established
model. Conclusion　 The CGNs apopto sis model induced by M PP+ can be used fo r the study on regulatory
mechanism of cell apopto sis and the screening of antiparkinsonian drugs.
Key words: 1-methyl-4-pheny l-py ridinium cation ( M PP
+ ) ; cerebella r g ranula r neuron ( CGN) ; apop-
tosis
　　帕金森病 ( Pa rkinson s Desease PD)是一种老
年人常见的中脑黑质纹状体系统多巴胺能神经元变
性丢失为主要特征的神经退行性疾病。随着我国人
口老龄化进程的加快 , PD的患病率明显增高。神经
毒素 1-甲基-4-苯基 -1, 2, 3, 6-四氢吡啶离子 ( 1-
methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tet rahydropy ridinium
ion, M PTP)能诱发啮齿类动物产生持续的 PD样
症状 ,可选择性地引起动物中脑黑质多巴胺神经元
变性。 用 MPTP制作的 PD样动物模型 ,常用于抗
PD药物的研究和开发 [1 ]。 MPTP在脑中被单胺氧
化酶氧化成活性代谢衍生物 1-甲基 -4-苯基吡啶离
子 ( 1-methy l-4-phenylpy ridinium ion, M PP+ ) ,可
以导致多巴胺能神经细胞损伤。近年来的研究表明 ,
在 PD的病理过程中 ,存在细胞凋亡机制 [ 2 ]。为了建
立与 PD有关的神经细胞凋亡模型 ,本研究以
MPP+ 为凋亡诱导剂 ,应用甲基绿 -派诺宁染色 ,
DN A凝胶电泳 ,流式细胞术对 M PP+ 诱发的大鼠小
脑颗粒细胞进行检测。 M PP+ 浓度为 50μmol /L时
可观察到典型的细胞凋亡的特征。这为研究和 PD
有关的细胞凋亡的调控机制和筛选抗 PD药物提供
良好的细胞模型。
1　材料
1. 1　动物: 7～ 8 d Wistar大鼠 ,北京医科大学动物
部提供。
1. 2　试剂: M EM培养基 ( Gibco ) ,牛胰蛋白酶 ( Dfi-
co ) ,牛胰蛋白酶抑制剂 (中科院上海生化所东风生
物公司 ) ,蛋白酶 K( M erck) , RN A酶 (中科院上海
生化所东风生物公司 ) ,多聚赖氨酸 ( M r> 30 000,
Sigma) , M PP
+
( Sigma) ,其余试剂为国产分析纯。
1. 3　仪器: CO2培养箱 (美国 Precision Scienti fic) ,
JJT-900型超净工作台 (北京半导体设备一厂 ) ,倒
置显微镜 (重庆光学仪器厂 ) ,高速低温离心机 (美国
So rv all ) ,紫外荧光观察照相仪、 DNA电泳仪 (北京
六一仪器厂 )。
2　方法
2. 1　小脑颗粒细胞的分离与培养 [3, 4 ]: 7～ 8 d Wis-
ta r大鼠 ,常规消毒后 ,无菌分离小脑 ,剔除软脑膜 ,
切成 1 mm3的小块 ,加入含 0. 1% Trypsin的 KRB
缓冲液 , 37℃消化约 10 min,其间振荡数次 ,再加入
含 83 mg /L胰蛋白酶抑制的 KRB缓冲液 (消化终
止液 ) ,终止消化 ,经 200目不锈钢网过滤 ,离心
( 500× g , 10 min)后将细胞再次悬浮于上述消化终
止液中。用吸管轻轻吹打 ,沉降 5 min后吸取上清
液 ,沉淀中再加入相同溶液 ,重复上述操作合并上
清 , 1 000× g离心 5 min,沉淀悬浮于含 10%小牛血
清 M EM培养液中 ,细胞记数后 , 2× 109 cfu /L接种
于预先经 5 mg /L多聚赖氨酸铺板的 35 mm培养
皿 ,置于 37℃ , 5% CO2培养箱中培养 , 24 h后更换
含 10μmo l /L阿糖胞苷的培养液 ,以抑制非神经细
胞的增殖。
2. 2　 M PP+ 诱导凋亡的检测
2. 2. 1　凋亡细胞的形态学观察:将细胞培养在盖玻
片上 ,培养第 4天 ,加 50μmol /L M PP+ 溶液 ,于 24,
48, 72, 96 h后用 PBS洗涤 2次 ,细胞置于 Carnoy
液 (无水乙醇 -氯仿-冰醋酸= 6∶ 3∶ 1)固定 3 min,
用甲基绿 -派诺宁染色液染色 3～ 5 min[ 5, 6] ,丙酮脱
水 ,二甲苯透明 ,中性树胶封片 ,光镜下做凋亡细胞
的形态学观察。
2. 2. 2　凋亡细胞 DNA电泳 [7, 8 ]: 小脑颗粒细胞培
养方法同上。在加 50μmo l /L M PP+溶液后 ,分别于
24, 48, 72, 96 h收集实验组和对照组细胞 3× 109
cfu /L,预冷 PBS洗 2次 ,用适量细胞裂解液 ( 10
mmol /L Tris· HCl pH 8. 0, 1 mmol /L EDTA, 10
mmol /L NaCl , 1% SDS)悬浮细胞 ,加蛋白酶 K使
其终浓度为 200 mg /L, 37℃水浴过夜 ,加入等体积
饱和酚溶液 ,抽提 2次 ,加入 2倍体积无水乙醇混
匀 ,再加入 1 /10体积 3 mol /L醋酸钠溶液混合 ,
- 20℃放置 2 h, 105× g离心 10 min沉淀 DNA ,弃
无水乙醇后用 70%乙醇漂洗两次 ,沉淀溶于适量
TE缓冲液 ( 10 mmol /L Tris· HCl, pH 8. 0, 1
·716· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 8期
mmol /L EDT A)中 ,再加入 25μL RNA酶 ( 10
g /L)放置 37℃、 30 min,加热 68℃、 10 min,以除去
RNA。置 4℃冰箱保存备用 ,提取产物进行 DNA琼
脂糖凝胶电泳 ,以检测 M PP+ 诱导细胞凋亡中所产
生的 DNA梯状裂解。
2. 2. 3　流式细胞仪分析:用流式细胞仪定量检测细
胞凋亡的百分率 [9 ]。收集对照组 , 50μmo l /L M PP+
作用不同时间的细胞 1× 109 cfu /L ,用 PBS离心
( 500× g , 5 min)洗涤 2次 ,弃上清 ,加入 70%乙醇
1. 0 mL。 500× g离心 5 min洗涤制成单细胞悬液 ,
每毫升细胞悬液加 PI( 1 g /L) 100μL染色 ,暗室放
置 30 min后用流式细胞仪检测细胞凋亡发生情况。
3　结果
3. 1　诱发细胞凋亡的形态学观察:甲基绿 -派诺宁
染色 ,在显微镜下可见 M PP+ 诱发的凋亡细胞较正
常细胞明显缩小 ,约为正常细胞的 1 /3左右 ,胞膜皱
缩不规则 ,染色体凝聚成颗粒状或团块状 ,形成凋亡
小体 (图 1) ,该形态学改变为凋亡细胞所特有。
3. 2　诱发细胞凋亡的电泳观察:细胞凋亡的生化标
志是 DNA被有规律切割 ,在凝胶电泳上形成相隔
约 200 bp阶梯状条带 ( DN A ladder ) ,观察 50
μmo l /L M PP+ 作用 24, 48, 72 h的电泳结果 ,均看
到 DNA梯带 , 24 h出现 DNA梯状条带 ,而 48 h梯
状条带最明显 ,结果见图 2。
3. 3　诱发细胞凋亡程度的观察: 50μmol /L M PP+
作用 12 h就有明显的诱发凋亡的作用 ,此时在 G1
期前就出现低于二倍体的凋亡峰 , 根据峰值的高低
定量细胞凋亡的百分率 ,加入 50μmol /L M PP+
12～ 48 h凋亡细胞数从 31. 9%上升至 67. 9% ,呈增
强趋势。流式细胞仪测定结果显示 , 48 h细胞凋亡
率最大 (图 3) ,这与 DAN凝胶电泳的结果一致。 在
DNA凝胶电泳中观察到特征性的梯状条带。
a-所示甲基绿深染细胞核中的凋亡小体 ,
而派诺宁染色细胞浆 (× 200)
图 1　 50μmol /L MPP+诱发的凋亡细胞的
甲基绿-派诺宁染色
1　　 2　　　 3　　 4　　 5
3 000 bp→
2 000 bp→
1-Mr标准　 2-对照组　 3-M PP+处理 24 h
4-M PP+处理 48 h　 5-M PP+ 处理 72 h
图 2　 50μmol /L MPP+ 诱发的凋亡细胞
的 DNA凝胶电泳图谱
A-对照　 B-M PP+ 处理 12 h　 C-M PP+处理 24 h　 D-M PP+ 处理 48 h
图 3　流式细胞仪检测 50μmol /L MPP+ 诱发的细胞凋亡率
4　讨论
　　细胞死亡有两种方式: 坏死和凋亡。一般认为细
胞凋亡是一种主动过程 , 常需合成一些新的蛋白并
在核酸内切酶存在的条件下使染色体 DNA发生降
解 [7 ]。细胞发生凋亡时 ,出现明显的核固缩、凝聚、形
成凋亡小体 ,细胞 DNA电泳时出现明显的“梯状” ,
在流式细胞仪 DNA定量分析图谱上出现显著的凋
亡峰 ,通过这些凋亡特征的检测 ,可以定性定量分析
细胞凋亡的情况。本研究采用原代培养的大鼠小脑
颗粒神经元 ,以 MPP+诱导神经元凋亡 ,通过多细胞
核形态观察、 DNA裂解的凝胶电泳分析及流式细胞
仪凋亡峰的定量分析等方面均证明 MPP+诱导的小
·717·中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 8期
脑颗粒神经元死亡是典型的细胞凋亡。而且该模型
具有以下特点及优点: ( 1)小脑颗粒细胞是哺乳动物
脑中数量最丰富的细胞之一。( 2)小脑颗粒细胞培养
方法成熟 ,易于获得 ,易于培养。细胞纯度可达 95%
左右。 虽然小脑不是 M PT P毒性的最初靶标 ,但
MPTP也作用于小脑 [10 ]。 由于 MPTP需从国外购
买 ,价格昂贵 ,而且用 MPTP所制作的动物模型用
药量大 ,成功率仅达 30%左右 ,这对于开展抗 PD的
药物研究带来困难。细胞凋亡是 PD发病机制中必
不可少的环节 ,就有可能通过阻止细胞凋亡 ,以达到
延缓 PD的发病进程和改善病情之目的。我们建立
的该细胞模型具有简单可靠的特点 ,为从中草药及
合成化合物中筛选抗 PD剂提供了新方法、新途径。
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大黄素对大鼠腹腔巨噬细胞产生的 TNFα、 IL-1、 IL-6及
细胞 [Ca2+ ]i的影响
张　骏 ,翁福海 ,李会强 ,姚　智⒇
(天津医科大学药学院 ,天津　 300203)
摘　要 :目的　研究中药大黄有效成分大黄素对不同状态下的巨噬细胞分泌 TNFα、 IL-1、 IL-6和 [ Ca2+ ]i的影响。
方法　利用脂多糖 ( lipopo ly sa cchride, LPS)刺激的大鼠腹腔巨噬细胞作为过度炎症反应的体外模型 ,用生物学方
法和荧光分光光度法测定巨噬细胞合成分泌的 TNFα、 IL-1、 IL-6和 [ Ca2+ ]i。 结果　大黄素对 TN Fα的分泌和
[ Ca2+ ]i有双向调节作用。 结论　大黄素可能具有免疫双向调节功能。
关键词: TNFα; IL-1; IL-6; [ Ca2+ ]i;大黄素
中图分类号: R286. 95　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 08 0718 04
Effect of emodin on secretion of TNFα, IL-1, IL-6, and level of intracellular Ca2+ by
rat peritoneal macrophage
ZHANG Jun, WENG Fu-hai, L I Hui-qiang , YAO Zhi
　　 ( Co lleg e o f Pha rmacy , Tianjin Univ ersity of Medical Sciences, Tianjin 300203, China)
Abstract: Object　 To study the ef fect of emodin, the activ e principle in rhuba rb on the secretion of
TN Fα, IL-1, IL-6, and [Ca2+ ]i by rat peri toneal macrophage under dif ferent condi tions. Methods　 Hyper-
nomic inf lamma tion models o f iso lated rat peri toneal macrophage were prepared by lipopo lysaccharide exci-
tation and the lev els of [ Ca
2+
]i and the proinf lamma to ry cy tokines TNFα, IL-1 and IL-6 secreated deter-
mined by f luorescence spect ropho tometry and bioassay. Results　 Emodin show ed a dual regula to ry ef fect
on the secretion of proinflammatory cytokines and [Ca
2+ ]i . Conclusion　 It seemed that emodin has a
biphasic immuno-regulatory effect.
·718· 中草药　 Chinese T raditional and Herbal Drug s　 2001年第 32卷第 8期
⒇ 收稿日期: 2001-12-11作者简介:张　骏 ( 1966-) ,男 ,浙江人 ,讲师。 1988年毕业于天津第二医学院获理学学士学位 , 2000年毕业于天津医科大学获医学硕士学位。 现在天津医科大学药学院工作 ,主要从事药理学及药物分析工作。 Tel: ( 022) 23328724