全 文 ：化学发光法研究培植牛黄清除 O牙的作用△
沈阳农业大学 ( l10 1 6 1)袁春莲 带 王 芬 叶凤阁 温 占华
摘 要 应用化学发光法研究培植牛黄对碱性二甲基亚枫体系产生 ( )牙清除作用 。结果显示 ,培植
牛黄对 O J一 有较强的清除作用 , 其 50 % 清除率剂量为 0 . 03 拜g / m L ,清除活性远高于维生素 E 。
关键词 培植牛黄 超氧负离子自由基 0 矛 化学发光
超 氧负离子 自由基 0 子是活性氧之 一 ,
具有细胞毒性 , 如不及时清除 ,过量的 ( )歹可
造成机体损伤 , 引发多种疾病田 。 牛黄是传统
的名贵中药 ,培植牛黄系在 活牛胆囊内培育
而成 ,按国家规定 ,优质培植牛黄可与天然牛
黄同等药用 , 具有多种药理活性 。 以往研究发
现 , 培植牛黄存在稳定的超氧自由基川 。 因
此 , 我们运用化学发光技术 ,研究培植牛黄对
碱性二 甲基亚矾体系产 生的 〔)于 的清除能
力 , 在分子水平上为牛黄药理活性揭示新的
作用机制 。有关这一领域的研究 , 国内外未见
报道 。
1 材料与方法
1
.
1 样品与试剂
培植牛黄由云南农业大学提供 , 系多头
牛产的混合样 品 。 鲁米诺 (I 沮 m i n ol )系美国
iS g m a 公 司 产 品 , 含 量 97 % ; 二 甲基亚 矾
( D M (S ) )
、 氢 氧 化 钠 、 乙 二 胺 四 乙 酸
( E D’ r A ) 、 磷酸二氢钠和磷酸氢二钠 ,均为国
产 分析 纯试 剂 。 三 蒸水 配制 0 . 3 m ol / L
N a ( ) H
, 含 0 . 1 : n m o l / I J E D T A 的 0 . 2 m o l / I J
P B S ( p H 一 8 . 6 ) , 0 . 3 m m o l / I一 鲁米诺的 P B S
溶液 。
1
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2 仪器和方法
1
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2
.
1 化学发光仪 , I洲 K B 一 W a l l a e l 2 5 0 型 。
1
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2
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2 用十万分之一分析天平准确称取一
定量样品 ,溶于 D M S O 溶液中 ,转入容量瓶 ,
配制固定溶液 , 采用逐级稀释法获得系列浓
度稀溶液 。
1
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2
.
3 D M (S ) 通氧数分钟制成氧饱和溶
液 。 取此溶液 0 . 3 m l , 放入 5 0 m m 又 1 2 m m
硬质玻璃管中 ,加入 0 . 3 m o l / I , N a O H O· 2 5
拼I一 , 轻轻振 荡混 匀 , 3 0 m i n 后加 入 p H S · 6
P B S 0
.
1 m I
J 。 置测定位置 ,注入 0 . 3 m m o l / I ,
鲁米诺溶液 0 . 6 m l 礴 , 总体积为 1 m I J ,立即启
动发光仪并记录 , 检测样 品时 , 可相应减少
P B S 的用量 , 使总体积保持 1 m I J 。
2 结果与讨论
2
.
1 D M S ( ) ( ( ) H
一
)
一
I一 u n i i n o l 发光体系的建
立 , , 4 1
2
.
1
.
1 N a 0 H 溶液的加入量对发光强 度的
影 响 : 固定 D M (S ) 及 鲁米诺的用量 , 改变
Na 0 H 溶棘的加入量 ,结果如图 1所示 , 随着
N a( ) H 溶液加入量的增加 ,发光强度开始呈
线性增加 ,当 N a O H 溶液达 0 . 6 m m o l / L 时 ,
发光强度趋于稳定 。 表 明实验条件不变 ,随
N a 0 H 溶液加入量的增加 , 0 子的生成量逐
渐趋于饱和状态 。
2
.
1
.
2 二 甲亚矾加入量对发光强度的影响 :
固定 N a O H 和鲁米诺的用量 , 改变二 甲亚矾
的加入量 ,用 p H S . 6 的 P B S 溶液调节总体积
保持 1 m l一 。 由图 1看出 , 其发光强度在 D M -
5 0 的加入量为 0 . 1 m L ~ 0 . 2 m L 时缓慢增
加 , 0 . 2 m I J ~ 0 . 4 m L 时迅速增加 , 0 . 4 m l二一
谙毅 es了指品像翠监岑瓮鼠装肇礴笙壤货军薪碑誓}书睿鱿扛泞锡教授 ,多年从事分析化学的教学和科研工作主编的 《分析化学 》和 《分析化学实验技术 》等书 ,被采用为高等农林院校教材 。 多次参加国家和省 、 市的科研课题研究工发表论文 l() 余篇 , 分别获得辽宁省以及沈阳市科技进步三等奖 。
,其
作 。
合 国家自然科学基金资助项目
·
3 2 8
·
0
.
5m l
, 时趋于稳定 。 说明随着 D M S O 加入
量的增加 , O牙一 的生成量逐渐达到饱和 。
2
.
1
.
3 鲁米诺浓度对发光强度的影响 : 固定
D M (S ) 的加入量和 N a O H 的浓度 ,改变鲁米
诺的浓度 , 发现其发光强度随鲁米诺浓度的
增 加而增大 。 如图 1 所示 . 当鲁米诺浓度为
0
.
1 8 m m ol / L 时 ,发光强度渐渐趋于稳定状
态 。
2
.
1
.
4 反应时间对发光强度的影响 :二 甲亚
矾与 N a O H 反应产生 O了 的过程是缓慢的 ,
为了找到该体系达到 O 子最高浓度时的最佳
反应时 l旬 ,分别在体系形成的 1 0 、 2 0 、 3 0 、 4 0 、
5 0 m in 测其发光强度 。 由图 1看到 20 m in 产
生的 O 于浓度最大 , 发光强度在 35 m in ~ 45
m in 时体系趋于稳定状态 。
ǎ趁)侧口识刹
N . O H 浓皮 ( m . 刃 L )
0
,
1 0 2 0
, 】0 滩 0 . 5
DM SO 加 人 t ( m l )
图 1
0
.
0 3 0
.
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香来切馆度(
~
叮L ) 时阅 t ( 。)
对发光强度的影响
l
一
N a 0 H 加入量 2一 D M S O 加入量
综合试验结果 , 应用 D M S O 一 Io m ion l 发
光体系研究培植牛黄对 0 矛的清除作用的最
佳 条件是 : 反应 时 间 2 0 m i n , O· 6 m m o l / I ·
N a O H 溶液 , D M S O 用量 0 . 3 m l ~ 0 . 4 m I J ,
0
.
1 8 m m o l / I
, 鲁米诺的 P B S 溶液 。
2
.
2 培植牛黄对 O二的清除作用 : 利用化学
发光法 , 已明显测 出培植牛黄有清除超氧自
由基 ( 0 牙) 的能力 。 将培植牛黄原液稀释至一
定量范 围 ,能够看出 O 牙致鲁米诺的发光强
度随培植牛黄浓度的变化而改变 。 培植牛黄
对 ( )厂5 0%清除率的剂量为 0 . 03 拌g /m l 了 ; V E
是 ( )了的特异性清除剂 , 其 50 %清除率的剂
量为 2 . 0 拜g /m l , 。 前者清除活性约为后者的
7 0 位 ( 见图 2 ) 。
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0 1 0
.
3 0
.
5
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2 4 6 8 1 0
荆 . (阳尸m L )
图 2 对 0 『的清除作用
1
一培植牛黄 2一 V E
已经研究证实 ,培植牛黄是胆红素钙大
分子聚合物沉积在粘蛋白上形成的复杂配合
物 , 这里主要存在胆红素类物质与粘蛋 白间
《中草药 》 1 9 9 8年第 29 卷第 5 期
手鲁米诺浓度 4一反应时间
的疏水结合作用 ,也还存在氢键 、 静电力等相
互作用氏 5 〕。这些作用使得胆红素类物质的构
象更加稳定 ,大大抑制了 0 『的释放 ,从而稳
定 了培植牛黄本身存在的超氧 自由基 , 它们
能起到 自由基阱的作用 。 另外蛋 白与胆红素
钙结合时呈不对称 ,使 C , 。上的氢裸露在外 ,
易被抽出形成 自由基 , 能阻断氧化反应的自
由基链锁反应 5[, 6〕 ,也 能俘获其他自由基 , 其
实质属 自由基偶联的终止反应 ,表现 出了很
强的清除 O于的能力 , 因此可以认为培植牛
黄具有断链型氧化剂的作用 。 D M S O 为非质
子溶剂 , 与溶于其中的培植牛黄构成疏水系
统 ,这与生物系统相似 。 就这个意义而言 ,培
植牛黄在机体内可起到内源性抗氧化剂的作
用 。 这一研究结果为在分子水平上阐明牛黄
的药理活性 ,揭示新的作用机制 ,提供了具有
重要价值的信息 。
参 考 文 献
l 郑荣梁 . 生物化学与生物物理进展 , 1 9 84 , 1 : 9
2 叶凤阁 ,等 . 吉林大学 自然科学学报 , 19 9 5 . 1 : 74
3 H y l a n d K
, 尸 t a l
.
B i o e h e m B i o Ph y s R e s C o m m u n
,
1 98 1
,
1 0 2 ( 1 )
:
5 3 1
4 赵琢道 ,等 . 生物化学与生物物理进展 , 1 9 8 7 , 6 : 5
5 S t o e k e r R
, e t a l
.
S e i e n e e
,
19 8 7
,
2 3 5
:
10 4 3
6 S o e k e r R
, e t a l
.
P r o e N a t l A e a d s e i U S A
,
1 9 8 7
,
8 4
:
5 9 18
( 1 9 9 7
一
0 6一 0 6 收稿 )
.
3 2 9
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