全 文 ：中药三七根核糖体 18S rRNA基因的序列分析
吴耀生 1 , Stev e Slocombe2
( 1. 广西医科大学 ,广西 南宁　 530021;　 2. Schoo l of Biochemistry and Mo lecular Bio lo gy , Univ e rsity of Leeds,
U . K. LS2 9 JT )
摘　要: 目的　研究中药三七根核糖体 18S rRN A基因的序列特征。方法　根据模式植物拟南芥的 18S rRN A的基
因序列设计引物 ,对三七根的 18S rRNA基因序列进行基因克隆、测序 ,并与模式植物拟南芥 Arabidopsis　
thaliana以及人参属植物喜马拉雅人参 Panax pseudoginseng Wall subsp. himalaicus va r. angustifolius的相应序
列进行比较。 结果　通过对产于广西靖西的三七 Panax pseudoginseng Wall. v a r. notoginseng ( Bukill) Hoo et
Tseng根的 18S rRN A基因进行克隆测序 ,获得了三七根的 18S rRN A基因的部分序列特征。结论　利用已完成全
基因组序列测定的模式植物拟南芥的分子生物学信息来研究中药植物基源的基因组序列 ,将有助于加快中药植物
基源的分子生物学研究进程。
关键词: 三七 ;拟南芥 ; 18S rRN A基因
中图分类号: R282. 7　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 12 1116 04
Sequencing of ribosomal 18S rRNA gene from
Panax pseudoginseng var. notoginseng
WU Yao-sheng
1
, Stev e Slocombe
2
　　 ( 1. Guangxi Univ er sity o f Medical Science, Nanning Guangx i 530021, China; 2. Schoo l o f Bio ch emistry and Mo lecula r
Biolog y , Univ ersity of Leeds, U. K. LS2 9 JT )
Abstract: Object　 To identify the cha racteristics o f 18S rRN A from the roo t o f Panax pseudogin-
sengWall va r. notoginseng ( Burkil l) Hoo et Tseng ( PGSN) . Methods　 The primers w ere designed accord-
ing to the gene sequence o f 18S rRN A from the model plant a rabidopsis thaliana. 18S rRN A gene sequence
o f PGSN were cloned and sequenced and compared wi th tha t of the model plant A . thal iana and P . pseudo-
ginseng subsp. Wall himalacus var. angustifol ius. Results　 Part of the cha racteristics o f ribo somal 18S
rRN A gene sequence o f PGSN from Jingx i, Guangxi Province w ere identi fied, which revealed that the 18S
rRN A gene sequence o f PGSN was 98% simi lar to tha t o f P . pseudoginseng subsp. himalalaicus var . an-
gustifol ius and 96% simila r to that of the model plant A. thaliana. Conclusion　 The use o f informations
obtained from the model plant , A . thaliana may promote the research pro g ress o f molecular biolog y of
TCM drug s.
Key words: Panax pseudoginseng Wall v ar. notoginseng ( Burki ll ) Hoo et Tseng ; Arabidopsis
thaliana ( L. ) Heynh. ; 18S rRN A gene
　　中药三七是一味应用广泛的传统药物 ,具有止
血、散瘀、消肿、定痛的作用。中药临床上主要用于治
吐血、咳血、衄血、便血、血痢、产后血晕、恶露不下、
跌扑瘀血、外伤出血、痈肿疼痛。 《本草纲目》 [1 ]上记
载 ,三七能“止血、散血、定痛。金刃箭伤 ,跌扑杖伤 ,
血出不止者 ,嚼烂涂 ,或为末掺之 ,其血即止。亦主吐
血、衄血、下血、血痢、崩中、经水不止、产后恶露不
下、血运、血痛、赤目、痈肿、虎咬、蛇伤诸病。”现代临
床研究证明 ,三七还具有滋补功能 ,有助于肾上腺皮
质激素及雄性激素的产生 ,帮助改善冠状动脉血流 ,
用于治疗动脉粥样硬化 ,高血压 ,心绞痛等 [ 2]。
三七的药用植物基源是五加科植物人参三七
Panax pseudoginseng Wall. va r. notoginseng ( Burk
i ll) Hoo et Tseng的根 ( PGSN) [3 ]。目前关于三七植
物基源的分子生物学研究在国内外尚未见报道。 从
分子生物学水平来研究中药植物基源的基因 ,寻找
有效成分的功能基因 ,对中药现代化研究有重要意
义。根据模式植物拟南芥 Arabidopsis thaliana ( L. )
Heynh的 18S rRN A的基因序列设计引物 ,对三七
根的 18S rRN A基因序列进行基因克隆 ,从而获得
·1116· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 12期
收稿日期: 2001-05-14作者简介:吴耀生 ( 1958-) ,女 ,广西医科大学生物化学教研室副教授 ,硕士 , 2000-03～ 2001-03在英国利兹大学生物化学与分子生物学系作访问学者。 Tel: ( 0771-5350741) E-mail: w uyaosheng@ hotmai l. com
了三七根的 18S rRN A基因的序列特征。
1　材料
1. 1　三七根采于广西靖西县三合乡三七产地 ,为 3
年头 ,采集后切成厚约 0. 2 cm ,直径约 1. 2 cm薄
片 ,并立即存放于购自英 国 Ambion 公司的
RNAlater溶液中 ,三七根与 RNAlater溶液的体积
比为 1∶ 5。拟南芥 A . thaliana由英国利兹大学生
物化学与分子生物学系 Green House提供。
1. 2　 Nucleon PHYTOpure DN A提取试剂盒 ,
Scot Lab Bio science; TaKaRa Ex TapTM , 10× EX
TaqTM缓冲液 , 2. 5 mmo l /L dN TP混合物 , T AK A-
RA SHUZO CO. , LTD. ; QIAquick Gel Ex traction
Kit , QIAGEN; pGEM
○R-T Easy V ecto r System ,
Promega; Bam HI、 EcoR I、 Sac I、 Smal, BioLa-
bs等。 　　
1. 3　 PCR引物: 根据拟南芥 18S rRN A基因的序
列 ( Accession: X16077, GI: 16506) 设计一对
引物: ATR RNA Sl, 5 -AGCCA TGCATGTGT AA
GT ATGAA-3 ; A TRRNA ASl, 5 -GGCATCGT
T T ATGG TTGAGACTA-3 。此对引物对拟南芥基
因组的 PCR扩增产物长度为 989 bp。
1. 4　 PCR仪 HYBAID; DN A测序仪 , ABI PRISM
Dye
TM
Terminato r Cycle Sequencing 373 Sequen-
cer等。 　　
2　方法与结果
2. 1　三七根 DNA的提取: 将存于 RNAlater溶液
中的三七根切片取出 ,放在乳钵中 ,在液氮冷冻条件
下研磨为细末 ,采用 Nucleon PHYTOpure DN A提
取试剂盒 ,按说明书操作 ,提取 DNA。所提 DNA经
电泳检测其质量 (图 1) ,紫外分光法测定其浓度 ,并
用灭菌双蒸水稀释为 20 ng /μL应用。
2. 2　 PCR及其产物的纯化: PCR条件为: 10× EX
Buf fer 4μL, 2. 5 mmol /L dN TP 4μL,引物 A TR
RNA Sl ( 10μmol /L) , ATR RNA ASl ( 10μmol /
L ) 各 2μL,模板 Arabidopsis thal iana DNA ( 0. 2
ng /μL) 2μL 或 PGSN DNA ( 20 ng /μL) 2 μL,
TaKaRa Ex-Taq 0. 5μL,灭菌双蒸水补足体积为
50μL。采用热启动 PCR, 94℃ 30 s, 50℃ 1 min, 72
℃ 2 min。 35个循环 , 72℃ 10 min补齐 PCR产物
片段。 PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳 ,溴乙啶染
色 ,在紫外灯下切出含 PCR产物条带的凝胶 ,采用
Q IAquick Gel Ex traction Ki t ,按说明书操作 ,纯化
PCR产物。
1-PGSN DNA　 2-Arabidopsis DN A　M -lkb DN A lad der
5-PGSN PCR产物　 6-Arabidopsis PCR产物
图 1　 PGSN或 Arabidopsis DNA及 PCR产物
电泳图
2. 3　 PCR产物 PGSN-rRN A与 pGEM○REasy载体
的连接与转化: 采用 Promega试剂盒按说明书操
作。经 X-Ga l / IPTG /Carbenicillin琼脂板蓝白筛选 ,
挑出白色阳性克隆 ,进一步扩大培养 ,纯化质粒 ,作
酶切鉴定 (见图 2)。
　
阳性克隆质粒电泳图　 M-1Kb DN A ladd er　　　　　经 Eco R I酶切的阳性质粒电泳图　 M-1Kb DN A
1～ 10-阳性质粒 　　　　　　　　　　　　　　　　 ladder　 1～ 10-经 EcoR I酶切的阳性质粒
图 2　三七克隆质粒电泳图
2. 4　 pGEM○R -T Easy- PGSN -rRN A的序列测
定: 采用 ABI PRISMTM Dye Terminator Cycle Se-
quencing试剂盒 ,按说明书操作 ,采用 T7、 SP6启动
子序列引物 ,进行双向测序反应 ,在 ABI PRISMTM
Dye Terminato r 373 Sequencer仪上进行序列分析。
所得序列已送 Genbank, Genbank Accession Num-
ber 为: Bank It418689, AF412275。 用 EBI 的
CLU STAL W ( 1. 81) M ultiple Sequence Alingem-
·1117·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 12期
nts软件比较拟南芥 A . thaliana、人参属植物
P. pseudoginseng subsp. himalaicus ( PGSH) ( AC-
CESSION AB044902; V ERSION AB044902. 1;
GI: 13516365)、三七 ( PGSN)的 18S rRN A的 DNA
序列。 三七与人参属植物 PGSH 18SrRN A同源区
域比较 ,同源性为 98% ;人参属植物 PGSH与拟南
芥比较 ,同源性为 9 6% ; 三七与拟南芥比较 ,
同源性为 94%。 Multiple Sequence Alignemnts结
果见图 3。
11768-PGSN, 9888-PGSH, 3416-Arabidopsis;
下划线 ,引物位点
图 3　 PGSN , PGSH, Arabidopsis的 18S rRNA序列的
比较分析
2. 5　 PCR产物的酶切分析: 采用 Bam HI、 EcoRI、
SacI、 Sma I分别对拟南芥和三七的 AT R RNA
PCR产物进行酶切 ,并用 BCM Serach Launcher
query sequence软件对所测定的序列进行酶切位点
分析。 结果见图 4。
3　讨论
　　随着分子生物学技术的飞跃发展及其在生命科
学领域中的广泛应用 ,使采用现代生物技术研究开
发现有的中药 ,实现中药现代化研究迫在眉捷并可
能实现。 利用已完成全基因组序列测定的模式植物
拟南芥 Arabidopsis [4 ]　的分子生物学信息来研究中
药植物基源的基因组序列 ,将有助于加快中药植物
基源的分子生物学研究进程。
M-1 kb DNA ladder, 1～ 5- PGSN; 6～ 10, Arabidopsis
1, 6-未酶切 ; 2, 7-Eco R I酶切 ; 3, 8-BamH I酶切 ; 4, 9-
Sac I酶切 ; 5, 10-Sma I酶切
图 4　 PGSN 或 Arabidopsis PCR产物限制性酶
切分析图
对中药三七根的 18S rRN A基因的序列研究 ,
是我们对三七分子生物学研究的一个开端。 18S
rRN A是生物进化上保守的一个区域。 根据我们对
三七 18S rRN A基因序列的克隆测序结果 ,三七与
拟南芥有 94%的同源性 ,拟南芥在该序列的 495 bp
处有一个 BamH I酶切位点 ,可将 PCR产物切成
494 bp、 495 bp两个片段 ,琼脂糖凝胶电泳时仅见一
条带。三七在该序列的 493 bp处也有一 BamH I酶
切位点 ,酶切后可得 498 bp、 489 bp两个片段 ,琼脂
糖凝胶电泳时也仅见一条带。 可见该酶切点是相当
保守的。 相对于拟南芥的 324位碱基 , PGSN和
PGSH均有插入序列 CCG ,而拟南芥缺乏此序列 ;
在 319→ 321位点 ,拟南芥为 CTG, PGSN和 PGSH
为 TCT; 在 332→ 333,拟南芥为 CT, PGSN 和
PGSH为 GC;拟南芥在 365→ 367位的序列是
TCT,而 PGSN和 PGSH在此位置的碱基是 CTC ,
在 921→ 922 bp位 ,拟南芥是 GT,而 PGSN和
PGSH为 AC。 这些位点有可能作为人参属植物基
因鉴定的特异位点。在引物对 ATR RNA SI、 A TR
RNA ASI扩增的 18S rRN A DNA区域内 ,拟南芥
及三七均缺乏 EcoR I、 Sac I、 Sma I酶切位点。
我们采用 Ambion公司的 RNAlater溶液保存
三七块根切片 ,常温存放约 1周 , 4℃存放约 1个
月 ,采用 Nucleon PHYTOpure DN A提取试剂盒 ,
可提出质量较好的 DNA ;采用 Ambion公司的
Plant RN A Isolation Aid以及 RNAqueousTM ki t,
也可分离出 RNA用于反转录 PCR,可解决产地较
远时 ,植物样品中 DNA与 RNA的保存问题。对三
·1118· 中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 12期
七植物的分子生物学研究 ,仍在继续进行。
　　致谢:本研究是在英国利兹大学生物化学与分
子 生物 学系 Dr. Baker 实 验室 完成 的 , 得到
Dr. Baker的大力支持与帮助 , Dr . Wayne提供所需
引物 ,在此特致深切感谢。广西医科大学生物化学教
研室蓝秀万讲师帮助部分排版 ,也在此一并致谢。
参考文献:
[1 ]　李时珍 . 本草纲目 [M ] . 校点本上册 . 北京: 人民卫生出版
社 , 1982.
[ 2 ]　 Cheval lier A. Th e Encyclopedia of Medicinal Plan ts , Dorling
Kindersley [M ] . Lond on: 1996 ISBN 9-780751-303148
[3 ]　江苏新医学院编 . 中药大辞典 [M ] . 上册 . 上海: 人民出版
社 , 1997.
[4 ]　 Eckardt Nancy A. Arabidopsi s Genome Con ference 2000: How
a smal l Weed Chang ed the World [ J] . Th e Plan t Cell , 2001,
13: 5-10, www . plan tcell. org
短葶飞蓬总黄酮含量的生态生物学分析
苏文华 1 ,陆　洁 2 ,张光飞 1 ,王崇云 1
( 1. 云南大学生态学与地植物学研究所 ,云南 昆明　 650091; 2. 云南省第一人民医院 ,云南 昆明　 650021)
摘　要: 目的　为研究短葶飞蓬总黄酮含量在个体器官间、个体间 、不同地区和不同生境种群间的变化规律。 方法
测定了云南邱北、昆明等 8个地区 ,大理苍山不同海拔条件下生长和栽培的短葶飞蓬植株体内总黄酮含量。结果　
不同地区生长的短葶飞蓬总黄酮含量不同 ;同一地区 ,总黄酮含量有随海拔升高而上升的趋势。 植株地上部分茎、
叶和花的总黄酮含量高于地下部分根的 ,生长在同一生境的短葶飞蓬不同个体总黄酮含量也有差异。 结论　短葶
飞蓬体内总黄酮含量的高低是基因和环境条件共同作用的结果。
关键词: 短葶飞蓬 ;总黄酮 ;含量分析
中图分类号: R282. 21　　　文献标识码: B　　　文章编号: 0253 2670( 2001) 12 1119 03
Ecological and biological analys is of total flavonoids inErigeron brev iscapus
SU Wen-hua
1
, LU Jie
2
, ZHANG Guang-fei
1
, W ANG Cong-yun
1
　　 ( 1. Institute of Ecolog y and Geobo tany , Yunnan Univ er sity , Kunming Yunnan 650091, China; 2. Yunnan Fir st People
s Hospital, Kunming Yunnan 650021, China )
Abstract: Object　 To study the regula r change o f to tal flavonoids in Erigeron breviscapus ( V ant. )
Hand- M azz ( TFE) in dif ferent parts o f the plant , dif ferent indiv idual plant and population f rom dif ferent
habi tat. Methods　 Samples of E. breviscapus f rom eight districts around Qiubei, Kunming and a t al titude
on Cangshan mountain, Da li w ere col lected and thei r f lav onoids determined. Results　 TFE show ed di ffer-
ent values in samples f rom dif ferent o rigin, wi th the tendency to show an increa se wi th increase of alti-
tude. The aerial par ts including stem , leaf , and f low er w ere higher than that of the underg round root. E.
brev iscapus g row n in the same ecological condi tions also show ed dif ferent T FE values f rom indiv idual to in-
dividual. Conclusion　Variation in TFE was influenced by the combined ef fects o f geno type and ecolo gical
conditions.
Key words: Erigeron breviscapus ( Vant. ) Hand-Mazz. ; to tal flavonoide; quantitativ e analy sis
　　短葶飞蓬 Erigeron brev iscapus (V ant. ) Hand-
Mazz. ,俗名灯盏花 ,灯盏细辛 ,属菊科短葶飞蓬属
的植物 ,产于云南、湖南、广西、贵州、四川及西藏等
省区 [ 1]。是一种民间常用中草药 [2 ] ,全草入药 ,曾列
入《中国药典》 1977年版一部 [3 ]。 70年代起 ,对其化
学成分进行了大量研究 ,发现短葶飞蓬的主要药用
成分为黄酮 [4, 5 ]。 具有扩张血管的作用 ,对治疗闭塞
性脑血管疾病所致瘫痪及脑出血后遗瘫痪有特效。
已有的研究表明 ,短葶飞蓬植株中总黄酮含量
有季节变化 [6 ]。 本研究对其黄酮含量进行了生态生
物学分析 ,初步探讨短葶飞蓬植株中总黄酮积累规
律。 为短葶飞蓬植物资源的有效利用和人工种植技
·1119·中草药　 Chinese Traditiona l and He rbal Drug s　 2001年第 32卷第 12期
收稿日期: 2001-01-08作者简介:苏文华 ( 1962-) ,男 ,硕士 ,副教授。 研究方向:野生药用植物驯化栽培。