全 文 ：五虎汤对呼吸道合胞病毒复制
的抑制作用研究△
湖南中医学院第一附属医院儿科 (长沙 41 0 07 0) 贫双腾 .欧正式 伍参荣 .
摘要 传统治喘名方五虎汤在体外和活体内均具有抑制呼吸道合胞病毒作用 。 在 H ep一 2细胞单层
上 , 五虎汤抑制5 0 %以上病毒空斑的浓度为 1 : 80 ,在此一浓度 ,病毒繁殖量下降 10 ` ’ . ` T C I D . 。 ,
病毒核酸合成下降率约 5 % 。 方中麻黄具有抗 R S V 活性 ,其抑制50 纬以上病毒空斑浓度为 1 . 6 m g /
m l
。 在动物体内 , 本方通过雾化吸入或口服 , 能降低小鼠肺组织内 R S V滴度 , 促使 小 鼠肺组织
R S V 提前消失 , 并能促进小鼠肺组织炎症吸收 。
关键词 五虎汤 吸呼道合胞病毒 抑制作用
呼吸道合胞病毒 ( R e s p i r a t o r y S y n e y t i a l V i r u s , R S V )是引起婴幼儿肺炎 , 毛细支气
管炎〔 1 〕 ,流行性喘憋性肺炎 〔 2〕 。 感染性喘呜〔’ 〕的重要病毒病原 , 目前对 R S V 感染尚无 安全有
效 的疫苗预防〔 `〕。 国外近年试用病毒哇雾化吸入治疗 , 能减轻临床症状和减少病毒排出〔 5〕 ,
但治疗费用昂贵 , 病房设备与护理技术耍求高〔 6〕。 国内探寻 中医药治疗 R S V 感染已积累了较
多经验与资料 〔7一 ’ ” 〕 。 近 年来 , 我们选用五虎汤在培养细胞上和动物体内进行了抗R S V实验
研究 , 结果满意 。
1 材料与方法
1
.
1 细胞和病毒: H e p犯细胞由湖 南医科大学病毒研究室提供 。 R s v L o n g株 , R s v N J
株 , R s v G z 株由首都儿科研究所病毒室提供 。
1
.
2 药物 : 五虎汤按朱丹溪 《 幼科全书 》 (见 《 医部全录 》 )所载 : 生麻黄 2 . 19 生甘草 1 . 29
细茶叶 2 . 4 9 生石膏 4 . 5 9杏仁 (去皮尖 ) 3 9
五药按《 中华人民共和国药典 》 ( 90 年版 )规格选购 , 洗净 , 加三蒸水 10 o m l , 煎成 25 m l
(每毫升相当含生药 5 0 m g ) , 4℃保存备用 。
1
.
3 培养细胞上抑病毒实验
1
.
3
.
1 空斑抑制试验 : H e p一 2细胞接种于 I Om l小 方瓶中 , 培养 4 h8 , 弃培养液 , 加 入 约 2 0
P f u 的 R SV , 3 7℃吸附 l h , 加入含不同浓度五虎汤药液的 E d g l e琼脂培基 , 3 5℃培养 4 d , 1 0%
中性甲醛溶液固定 , 0 . 5%结晶紫溶液染色 ,计数空斑 。
1
.
3
.
2 病毒繁殖量降低测定 : 以。 . : M O (I 感染倍数 ) R S V 感染细胞 , 培养 72 h ,冻融 3 次 , 离
心 , 取上清 , 测定病毒滴度 。
1
.
3
.
3 病 毒 R N A 合成抑制试验 : 以 ZM O I的 R S V 感染 H e p一 2细胞单层 , 吸附 l h ,加入含不
同浓度五虎 汤 药液和 1卜C i/ m l ( 5一 3 H )尿核昔 (中国原子能科学研究院同位素研究所 )的维持
液 , 培养 1 h0 , 破碎细胞 , 50 % 冷三氯 乙酸沉淀 , 玻璃纤维滤膜收集 , 5%冷三氯乙酸冲洗 ,
F ZJ o l 7 G型液体闪烁计数器 (西安 )测定放射性 。
.
A d d r e s s
: 圣l e S h u a n g t e n g , H u h a n
么本文为国家 自然科学基金资助项目
. 现庄单位 : 湖南 省中医研究院 ( J l o o 0 6 )
e o l l e g e o f T r a d i t i o n a l e h i n e s e M e d i e i n e
,
C h a n g s h a
` 今傲生物教研室
《中草药)1 9 ” 年第 26 卷第U 期 每8与,
1
.
4 动物体内挑直 gV卖验
1
.
4
.
1动物及分组 : N H I纯系小鼠新生幼仔由湖南省医药工业研究所动物室提供 。 幼 鼠产
后无菌饲养 , 第 5天 , 选健康无病幼鼠 , 雌雄各半 , 随机分为 3组 : 感染对照组 , 五虎汤 口服
组 , 五虎汤雾化组 , 每组 20 只 , 各组隔离 , 保持室温 20 ℃ 。
1
.
4
.
2 感染 : 3组均按G r a h a m 法〔1卫〕将滴度为 5 . 2 x l o ` P f u / in l的 R S V 悬液 o . l m l点鼻感染。
1
.
4
.
3 治疗 : 口服组以五虎汤煎液灌胃 , 每鼠 o . 20 m l/ 次 , 3次 / d (剂量为 12 o m l/ k .g d) 。
雾化组以 C W一Z A型晶体管超声雾化器将五虎扬煎液稀释 3倍给药 , 3次 / d , Z h /次 , 雾化液
量为 0 . s m J / m i n , 每天雾化液量 l s o m l (相当药量 6 m l /鼠 一 d , 剂量 12 0 0m l / k g 一 d ) 。 雾 化在
容积 6 0 L的特制薄膜罩内进行 。 治疗于感染24 h后开始 , 疗程 3 d 。
1
.
4
.
4 观察指标 : 于感染后第 5天和第 10 天分 2批处死小鼠 ,无菌取肺 。 右肺捣碎 ,冻 融 3次 ,
离心 ,取上清 ,测定肺组织病毒滴度 。 左肺以 10 % 中性甲醛溶液固定 ,切片 , 观察肺组织病变 。
2 结果
2
.
1 对 R S V 空斑和病毒繁殖量的降低作用 。 药物组 比病毒对照组 出斑迟 5一 1h0 , 空斑数目
明显少 于对照组 , 蚀斑范围亦 明显缩 小 。 药物浓度越高 , 空斑数目越少 , 两者呈明显负相关
( r
, = 一 l , 尸 < 0 . 0 5 ) , 病毒繁殖量亦随药物浓度增高而降低 , 见表 1 。 当五虎汤浓度为 l : 80
时 , 被抑制空斑数超过 50 % , 病毒繁殖量降低 10 一 2 · ` T C I D 。 。 。 经对 3株 R s v 重复 实 验 , 结
果一致 , 见表 2 。
衰 1 五虎汤对 R SV ( L o n g株 )空斑
教目和病毒份殖 t 的影晌 表 2 五虎汤对 3株 RS V的抑制效果
组 别 药物浓度 空斑数目
( n = 4 少
子代病毒滴度
( L g T C I D
。 。
)
1
.
5 6 士 0 . 3 2△
药物浓度 空斑数目 (牙 二 S , n = 3 x 4 )撅万石而不丽盯丽丽不丽嚼几丽丽丽
五虎汤组 l , 10
l : 8 0
1 : 1 6 0
1 : 3 2 0
1 : 6 4 0
病毒对照组 一
17
.
5士 1 0 . 5、
5 1
。
3上 9。 6 么
9 1
。
5 士 8 。 4 △
1 3 3
。
8士 9 。 8 么
1 7 6
.
3 士 8 . 2今
1 8 1
.
3 士 1 0 。 2
2
。
13 士 0
2
。
8 5士 0
3
。
5 2士 0
4
。
0 2士 0
4
。
5 3士 0
l : 4 0
1 : 8 0
1
: 1 6 0
1
:
32 0
1
: 6 4 0
1 2
。
3土 8 . 4么
5 6
。
5土 9 。 6 久
1 0 3
。
8土 1 0 . 3 选
1 4 4
。
5土 8 。 7 么
1 7 2
。
3 士 1 0 。 6 .
1 8 0
。
8 士 1 0 。 4
9
。
1 士 8 。 2 `
5 0
。
5士 9 . 4 。
9 1
。
3士 1 0 。 6 山
1 2 3
。
6 士 8 。 9△
1 6 7
。 ` 士 1 0 。 7 .
1 7 3
。
8 士 9 。 2
9
.
8土 7 . 3八
遵5 . 5士 9 . 6△
8 7
。
3 士 1 0 。 3么
1 2 1
。
8 士 1 1 . 6么
1 6马。 5 士 1 0 。 2 .
1 7 7
。
1士 1 0 。 1
护尹沪*33,`份O鳗J尸勺
尸 < 0 . 0 5 , . 尸 > 。 . 0 5 (t 检验 , 与病毒对照组比较 ) 么尸< 0 . 05 , 中 尸 > 0 . 0 5 (t 检验 , 与病毒对照组比较 )
2
.
2 对药毒 R N A 合成的抑制效果 : 如图所示 , 药物浓度越高 , R S v 感染组细胞破碎物的放
射性越低 , 当药物浓度为 l : 80 时 , 放射性降低约 5 % , 而非感染组细胞破碎物的放 射性强
度 低于感染组 , 且不受药物浓度影响 。 表明五虎汤对 R S V 核酸合成具有抑制作用 。
2
.
3 方中单味药抗 R S V 作用筛选 : 采用空斑抑制法对方中五药分别进行抗 R S V 作用试验 ,
以麻黄具有较好的抗 R S V作用 , 其抑制 50 %空斑浓度 为 1 . 6 m盯 m 1( 相当含生药量 ) , 抑 制
90 % 空斑浓度为 25 m g/ m l 。 茶叶在病毒吸附前有微弱抑制 R S V 作用 , 但在病毒吸附 后 无 此
作用 。 杏仁 、 石膏 、 甘草 3药未发现有抗 R S V作用 。
2
.
4 对培养细胞的毒性作用 : 向培养 2 4 h 的 H e p一 2细胞加入含不同浓度的五虎汤药液 , 再培
养 72 h , 所得细胞总数 、 死亡细胞数如表 3 , 在 l : 40 药物浓度时 , 细胞 已能较好生长 ,细胞总
数与正常对照细胞无显著性差异 。
2
.
5 对小 鼠肺组织病毒滴度的降低作用 , 各组小鼠肺组织病毒滴度测定如表 4 。 在感染后
第 5天 , 两治疗组肺组织 R S V滴度均较感染对照组显著下降 , 但五 虎汤雾化组效果优于口服
组 ( t = 6 . 1 1 , 尸 < 0 . 0 5 ) 。 在第 10 天感染对照组肺组织 R S v 部分消失 , R SV滴度大幅度下降 ,
. 5 8p
省会乞州巷
· , . … 。 . . … , 二 ” . . … 。 。 , . ”二 2
姨茸辍葺佳育
这 与R S V 感染的 r l 然病 程 相 符〔 1 1 〕 。 日
服组仅余 l例R S V未消失 , 雾化组已个部消
失 , 两组 .与感染对照组比较 , 差异显著 , 见
表 4 。 提示五虎汤雾化或 口服均能降低 小 鼠
肺 组 织 R SV 滴度 , 促进 R S V 提前消失 、
2
.
6 对小鼠肺组织炎症的 改 善作用 : 感染
后第 5天切片观察 , 3组小鼠肺部均有局灶性
或大片弥漫性间质性炎症 , 肺间质增厚 , 淋
巴细胞与单核细胞浸润 , 支气管粘膜水肿 ,
但肺泡内无渗出物 , 肺组织炎症与文献报道
相一致 〔 1 1 〕 。 同期作正常对照小鼠肺部切片
检查 . 肺组织清晰 , 无炎症 出现 。 感染对照
最慕
1 : 6 4O j : I G0 1: 10
药物 ;农度 (稀仔 {寿数 )
圈 五虎汤对 R SV核酸合成的抑制作用
1
一
R SV感染组细胞 2 一非感染组细抱
表 3 五虎汤对日e p 一 2细脸增长的影晌 (细胞数单位 x 1o ` / m l)
药物浓度 细抱接种量 加药细胞
7 2 h
总数 抑制率 ( % ) 死亡细胞 死亡率 ( % )
0
。
9 3 士 0 , 2 3
0
。
7 6 士 0 。 2 4
0
。
4 2 士 0 。 3 2
0
。
0
。 士 0 。 1 8
0
。
3 2 土 0 。 1 3
3 4
。
1 3
。…J性九O叮.5-non仙,三嘴几1 : 1 01 · 2 01 : 4 0
1
:
8 0
0
3
.
7 x 士 0 . 3 3么
5
.
8 5 士 0 . 5 4△
6
。
7 3 士 0 。 6 5 .
7
。
9 0 土 0 。 6 2*
7
。
9 8 士 0 。 4 9
△尸< 0 . 0 5 , . 尸 < 0 . 0 5 (t 检试 , 与未加本物细胞比较 )
表 4 五虎汤对小徽肺组织增殖的抑制和炎症的改普作用
组 别
第 5天
R S V滴度
(
火 1 0 . P f u /肺 )
( n ” 1 0 )
小鼠肺炎数
第 10 天
R S V阳 性数
(
n 巴 10 )
R S V滴 度
( P f
u
/肺 ) 小鼠肺炎数
2 4
。
7 士 6 。 2
0
.
5土 1 . 6 A
。 八
8
1△
1八
*
八”OJ朽,l` .1感染对照组
五虎汤口服组
五虎汤雾化组
2
。
0 2 士 0 。 3 1
1
.
6 5 士 0 . 2 9八
0
.
s a 土 o . 2 7 A
△尸< 0 . 0 5 , 中 P > 0 . 0 5 (与感染对照组 比较 )
组与两治疗组肺炎小鼠数无差别 , 炎症程度与范围亦相 同 。 在第 10 天 ,两治疗组 肺炎 己吸收 ,
小鼠肺组织清晰 。 感染对照组小鼠肺炎无明显改善 , 肺炎小 鼠数多于两治疗组 , 见表 4 。 提
示五虎汤无论口 服或雾化吸入 , 均有改善R SV 所 致 小鼠肺组织炎症作用 , 且 两 效 呆 相 同
( x
Z = o , P > 0
.
10 )
。
3 讨论
本文结果显示 , 五虎汤在培养细胞上和动物体内均具有抑制R S V 增殖作用 , 并有改善小
鼠实验性 R SV 肺炎作用 。 五虎汤为中医学治疗小儿外感喘证的传统名方 , 出朱丹溪 《 幼科全
书 》 (见 《 医部全录 》 ) , 朱氏谓此方为发散之重剂。 ( 医宗金鉴 · 幼科杂病心法要诀 · 喘证
门 》 以此方治马脾风 , 云 : “ 马脾风乃俗传之名 , 即暴喘是也 , 因寒邪容于 肺 俞 , 寒化为
热 , 闭于肺经 , 故胸高气促 , 肺胀喘满 , 两肋煽动 , 陷下作坑 , 鼻窍煽张 , 神气闷乱 。 机遇
之 , 急服五虎汤 , 继用一捻金下之 , 倘得气开 , 其喘自止 , “根据临床症状 , 暴喘 , 马脾风
`中草药》 1 9孕5年第2 6卷第1李期 万B 7
与现代医学的毛细支气管炎 (式称阵发性喘憋性肺炎 )相似 。 故临床报道 , 在西医常规治广毛
细支气管炎的基础上加用麻杏石 一甘汤或射干麻黄汤 , 疗效明显提高〔 7〕。 五虎汤为麻杏石 ’廿汤
加茶叶而成 , 我们多年的临床经验证实 , 五虎汤治疗小儿阵发性喘憋性肺炎疗效可靠 。 己知
R s V 是小儿肺炎 , 毛细支气管炎 , 感染性喘鸣的重要病原 , 因此 , 根据本文实验结果 , 提示
五虎汤治疗婴幼儿 R S V 感染具有抗病原治疗作用 。
由于呼吸道 R SV 感染时 , 病毒在呼吸道粘膜细胞内增殖并引起粘膜损伤 , 病毒不进 入血
流〔 1 〕 , 故文献报道动物实验以雾化吸入抗病毒药物比其他给药途径效果均好 c 1 2〕 , 临床亦大
多主张 )月病毒哩连续雾化吸入治疗a S V感染 , 全身用药效果欠佳“ , 6〕。 但雾化吸入时 , 药物
大部分消散在空气中 , 故所需药物用量大 , 造成一定浪费 。 本实验表明 , 五虎汤 口 服降低小
鼠肺组织 R S V滴度的效果低于雾化吸入 , 但改善肺部炎症的效果与雾化吸入相等 , 而剂量仅
为雾化的 l / 10 。 说明五虎汤 口服亦有其优越性 , 且不需要其他附加设施 。
本实验发现五虎汤中麻黄具有较好的抗 R S V 作用 , 其有 效 成分有 待进 一步 研究分析 。
今 考 文 献
S t o l t E J
, e t a l
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A r c h V i r o l
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1 9 8 2 2 1 . 1 2 ,
( x g P-4 1-0 l o收稿 )
(上接第 5 9 7页 )
有性繁殖便于大面积种植 , 关键在于适时播种 (秋播 )及选用当年的新鲜种子 , 营养繁殖适用
于小面积栽培 , 产量 、 质量均高于前者 , 但费工 , 不适用大 田生产 。
5
.
3 间苗对铁筷子并无必要 , 因为单生株与丛生株的根系重量 、 质量相差无几 , 且丛 生 者
可节省耕地 。 也无需摘蕾 , 因花期极短 , 花也小 , 所耗养分可忽略不计 。
5
.
4 铁筷子 田内尚未发现过虫害 , 可能 与 其有小毒有关 。 但真菌易侵入根部 , 使其腐败 ,
因此应注意排水和疏土 。
今 考 文 献
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T he
r e at t U C S
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n ad in cr e a s ed c on cn et r at i on s of M G
。
( or i g in al r at i cl n e oP a g e 5 74 )
Ef f 0 e ef S ix Ef f e et iv e C o爪 P n o en t s of C i hn e s eH er b al D r u g sn o林
C al m od ul in 一D ep n ed n et C y cl i cN u cl e ot id eP ho sP hod i e st er a s e
Y an gD n o gl f
,
G u X i o n g f e i
, e t a l
E f f e c t s o f n i t i d i n e ( N i t )
,
b e r b e r i n e ( B e r )
, s i n o m e
n i n e ( S i n )
, e P h e d r i n e ( E P h )
,
h o
-
u t t u y n i n ( H o u )
,
q u e r e e t i n ( Q
u e ) a n d t r i f l u o P r a z i n e ( T F P ) o n c a l m o d u l i n
一
d e p e n d e n t c
-
y e l i e n u e l e o t i d e P h o s P h o d i e s t e r a s e ( C a M
一
P D E ) w e r e i n v e s t i g a t e d b y
·
d r t h 6 g o n a l d e s i g n
.
o u r o b
s e r v a t i o n e a m e o u t t h公 t N i t , Q u e a n d T F P s i g n i f i e a n t l y i n h i b i t e d t h e C a M 一 a c t i v a -
t e d P D E a e r i v i t y ( P < 。 . 0 1 ) i n t h o o r d o r o f Q u : ) T F P ) N i t . B e r , E P h , a n d H o u h a d n o e -
f f e e t s o n t h e e n z y m e a e t i v i t y ( P ) 0
.
0 5 )
.
T a o e f f e c t o f S i
n o n C a M
一
P D E w a s u n c e r t a i n
。
1 t w a s a l s o s h o w n t h a t t h e r e w e r e e o o P o r a t i v i t y b
e t w e e n N i t a n d T F P a n d s y n e r g i s 血 b e t -
w e e n Q u e a n d T F P
。
T h e s e r e s u l t s s u g g e s t o d t h a t N i t a n d Q u e m a y a e t a s e a l m o d u l i n a n
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t a g o n i s t s a n d m i g h t h a v e
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d i f f e r e n t s i t e s o n c a l m o d u l i n i n c o m P a r i s o n w i t h t h o s e f o r T F P
.
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r i g i n a l a r t i o l e o n P a g e 5 8 2 )
In :1 ib i t i o o o f R e : Pi r a t o
,
y S y o e y 之i a l V i r u ; b y W J ’ l u七a o g , A T r a j i七i o n a l
C h i n e s e P r e s c r ip t i o n C o m Po s e d o f F iv e M e d i c i n a l H e r b s
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W卫 h u t江 n g ` a w e l l k n o w n t r a d i t i o n a l C h i n e s e h e r b a l d 峨c o c t j o n f o r t h . t r e a t城 。 n t o f a s -
t h m a w a s f o 从n d t o h a v o a n a n t i v i r a l e f f 眨 e t o n r e s p i r a t o r y s y n c y t i a l v i r u s ( R s V ) b o t h i n
v i t r o a n d i n v i v o
.
A 5 0石 r e d u p t i o 林 o f P l a q u e f o r m a t i o n w a s o b s e r v e d o 肚 H “ p 一 2 c e l l 班 o n o l -
a y e r a t a c o n c e n t r a t i o n o f l
, 8 0
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A t s u c h c o n c e n t r a t i o n
, t h o v a l u e o f 19 T C I D 5 0 of
`
v i r a l
y i e l d w a s 2
. 二 , a n d 5 5不 R N A s y n t h e s i s o f R SV w a s i n h i b i t e d . I t w a s f o u n d t h a t a m o n g t h e
f i v e m e d i e i n a l h e r b s i n P r e s c r i P t i o n E P 人e d r a 5 1” i e a S t a P f 1 5 r e s P o n s i b l e f o r t h e a n t i v i r a l
a e t i v i t y o n R S V
.
I C 5 0 f o r P l a q u e i n h i b i t i
o n w a s f o u n d t o b
e 1
. 6 m g / m l
.
I n a n i m a l m o d e l
,
W
u h u t a n g , i n g n f z e a n r l y r e d u e e d’ t h e t i t r。 。 f 、 R SV a n d a e e e l e r a t e d R S V e l e a r a n e e i n m i e e ,
a n d a l l e v i a t o d v i r a l P n e u m o n i t i s b y e i t h e r Q r a l o r a , r o s o l r o u t e
.
( o r i g i n a l a r r i c l e o n p a g e s ` 8 5 )
E f f e e 七 o f C o二 m o lr T h r e e w l o g n u t ( T r i P t e r夕 g i u二 。 亡l j o r d玄￡) 0 0 B l o o 」 R h e o ! o g y
i n E x p e f im e n t a l A r t h r i t i s R a t s
L 1a n g w 七几 b o
,
J i n Z h e n g n a n
,
P i a o H
u i s h u n
, e t a l
E t h y l a 。 。 t a t e 。 x t r a o t o f T r i P t 召r y g ` : `川 。 了I f o r d i ( 2 0二 g / k g , 4 0二 g / k g ) , g i v e n t o a d j u v a n t
a r t h r i t i s r a t s ( 19 ) f o r 7 e o n s : 。 u t i v e d 己 y s , m a r k e d l y d e e r e a 3 e d b o t h h i g h a n d l o w s h e a r w -
h o l e b l
o o d v i s e o s i t y
,
P l a s m a v i s c o s i t y
,
w h o l e b l o o d r e d u e t i o n v i s e o s i t y
,
h e m a t o沁 r i t a n d f i -
b r i n o g e n c o n t e n 全 , b u t w i t h o u t e f f e e t o n b l o o d s e d i m e n t a t i o n a n d K v a l u e i n b l o o d s e d j m e -
n t 城 t 1 o n e q u a t i o n . T h e : e r 。 s u l t s i n d i e a t e d t h a t t h e d e e r e a s i n g e f f o e t o f T . w i l f o r d f i o n b l o o d
v i s e o s i t y m a y b
e r e l a t e d t o i t s i n f l 通 e n : 2 o n r e d b l o o d e e l l s a n d P l a s沮 a c o m P o s i t、 10 从:
( 0
r i g i n a l a r t i e l e o n p a g e 5 8 9 )
.
6 1 6
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