全 文 ：广 西 植 物 Ｇｕｉｈａｉａ ３２（１）：１１３－１１７ ２０１２年１月
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－３１４２．２０１２．０１．０２２
尾巨桉ＨＭＧＲ基因的克隆及表达分析
蒋 春１，张华玲２，彭 江２＊
（１．四川大学 生命科学学院 生物资源与生态环境教育部重点实验室，四川 成都６１００６４；
２．西南大学 生命科学学院 三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆４００７１５）
摘 要：基于ＲＡＣＥ技术克隆得到尾巨桉３－羟基－３－甲基戊二酰ＣｏＡ还原酶（ＥｕＨＭＧＲ）基因全长为１ ９５５
ｂｐ，包含１ ５６０ｂｐ的开放阅读框（ＯＲＦ），编码５１９个氨基酸。生物信息学分析表明ＥｕＨＭＧＲ包含两个
ＨＭＧ－ＣｏＡ结合基序和两个ＮＡＤＰ（Ｈ）结合基序；同源建模得到ＥｕＨＭＧＲ三维构象呈“Ｖ”型，包含Ｎ－结构
域、Ｓ－结构域和Ｌ－结构域。将ＥｕＨＭＧＲ组ＤＮＡ与ｃＤＮＡ序列进行比对表明ＥｕＨＭＧＲ存在一个３１９ｂｐ的
内含子。通过实时定量ＰＣＲ进行组织特异性表达分析表明ＥｕＨＭＧＲ在茎中的表达量最高，叶次之，在根中
基本无表达。该研究为后续尾巨桉ＥｕＨＭＧＲ的功能验证以及遗传转化奠定基础。
关键词：尾巨桉；ＨＭＧＲ；生物信息学；内含子；组织特异性表达
中图分类号：Ｑ９４３．２；Ｑ９４６．８５ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－３１４２（２０１２）０１－０１１３－０５
＊ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ
３－ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ－ＣｏＡ Ｒｅｄｕｃｔａｓｅ Ｇｅｎｅ
ｆｒｏｍＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌａ×Ｅ．ｇｒａｎｄｉｓ
ＪＩＡＮＧ Ｃｈｕｎ１，ＺＨＡＮＧ Ｈｕａ－Ｌｉｎｇ２，ＰＥＮＧ Ｊｉａｎｇ２＊
（１．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｂｉｏ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ Ｅｃｏ－ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｃｈｕａｎ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００６４，Ｃｈｉｎａ；２．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｅｃｏ－ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｔｈｒｅｅ Ｇｏｒｇｅｓ Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ Ｒｅｇｉｏｎ，
Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４００７１５，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ３－ｈｙｄｒｏｘｙ－３－ｍｅｔｈｙｌｇｌｕｔａｒｙｌ－ＣｏＡ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（ＨＭＧＲ）ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｂｙ Ｒａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ）ｍｅｔｈｏｄ，ｔｈｅ ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ ＥｕＨＭＧＲｃＤＮＡ ｗａｓ １９５５ｂｐ，ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ａ １ ５６０ｂｐ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ
ｆｒａｍｅ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａｐｅｐｔｉｄｅ ｏｆ ５１９ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ＥｕＨＭＧＲｃｏｎｔａｉｎｅｄ ｔｗｏ ＨＭＧ－ＣｏＡ
ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆｓ ａｎｄ ｔｗｏ ＮＡＤＰ（Ｈ）ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｔｉｆｓ；ａｎｄ ｉｔ ｈａｄ ａ ３－Ｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｗｉｔｈ“Ｖ”ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｂａｓｅｄ ｏｎ ｍｏｄｅｌｉｎｇ，
ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｎ－ｄｏｍａｉｎ，Ｓ－ｄｏｍａｉｎ ａｎｄ Ｌ－ｄｏｍａｉｎ．Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａ ３１９ｂｐ ｉｎｔｒｏｎ ｉｎ ＥｕＨＭＧＲｇｅｎｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ Ｅｕ－
ＨＭＧＲｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｉｎ ｓｔｅｍ，ｆｏｌｏｗｅｄ ｂｙ ｌｅａｆ ａｎｄ ｎｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｏｏｔ．Ｔｈｅ ｐａｐｅｒ ｗｏｕｌｄ ｓｕｐｐｌｙ ｓｏｍｅ
ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ＥｕＨＭＧＲｆｒｏｍＥｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌｌａ×Ｅ．ｇｒａｎｄｉｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌａ×Ｅ．ｇｒａｎｄｉｓ；ＨＭＧＲ；ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ；ｉｎｔｒｏｎ；ｔｉｓｓｕｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
尾巨桉（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌａ×Ｅ．ｇｒａｎｄｉｓ）是
尾叶桉（Ｅ．ｕｒｏｐｈｙｌｌａ）和巨桉（Ｅ．ｇｒａｎｄｉｓ）的杂交
种，属于桃金娘科（Ｍｙｒｔａｃｅａｅ）桉树属（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ）
（陈少雄等，１９９９）。桉树是世界公认的三大速生树
种（杨、松和桉）之一，桉树已成为主要的工业原料来
源（张宁南等，２００９）。桉树除了木材资源、园林绿化
＊ 收稿日期：２０１１－０８－０２ 修回日期：２０１１－１１－２３
基金项目：重庆市自然科学基金重点项目（２００９ＢＡ１００４）；三峡库区生态环境教育部重点实验室开放基金（ＥＦ２００６０９）［Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉ－
ｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ（２００９ＢＡ１００４）；ｔｈｅ Ｏｐｅｎ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｅｃｏ－ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｔｈｒｅｅ Ｇｏｒｇｅｓ Ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ Ｒｅｇｉｏｎ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ
Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ（ＥＦ２００６０９）］
作者简介：蒋春（１９８５－），女，四川德阳市人，硕士，主要植物转基因工程研究，（Ｅ－ｍａｉｌ）Ｊｉａｎｇｃｈｕｎ８５＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ。
＊通讯作者（Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ，Ｅ－ｍａｉｌ：ａｉｑｕｎ２００９＠１６３．ｃｏｍ）
方面的用途外，其油腺细胞分泌的芳香精油有着更
重要的价值，广泛应用于医药、香料、食品等工业，经
济效益可观（田玉红等，２００７）。工业上桉树精油产
率一般为０．８％～５％，相对较低，故通过基因工程
提高精油产率对林业经济的发展有着重大意义（宋
永芳，１９９０）。
桉精油几乎全部由单萜、倍半萜以及它们的简
单含氧衍生物所组成（Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ等，２００９）。植物
萜类合成代谢有甲羟戊酸（ＭＶＡ）和２－Ｃ－甲基－Ｄ－赤
藓糖醇－４－磷酸（ＭＥＰ）两种途径，产生萜类物质的共
同前体异戊烯基焦磷酸，再由它生成单萜、倍半萜、
双萜等化合物。３－羟基－３－甲基戊二酰ＣｏＡ还原酶
（ＨＭＧＲ）是 ＭＶＡ途径中的第一个关键酶，催化３－
羟基－３－甲基戊二酰－ＣｏＡ生成甲羟戊酸（ＭｃＧａｒｖｅｙ
等，１９９５）。Ｈｏｌｍｂｅｒｇ等（２００３）将橡胶树 ＨＭＧＲ
和烟草Ｃ２４醇甲基转移酶基因在烟草中共表达，结
果烟草中的醇总含量提高２．５倍。Ａｑｕｉｌ等（２００９）
将长春花ＨＭＧＲ转化到青蒿中，与野生型相比，青
蒿中的青蒿素含量提高 ２２．５％。本研究基于
ＲＡＣＥ技术得到尾巨桉 ＨＭＧＲ 基因全长ｃＤＮＡ，
并进行生物信息学、内含子以及组织特异性表达分
析，为后续尾巨桉 ＨＭＧＲ 基因功能验证以及精油
代谢工程改良奠定基础。
１ 材料与方法
１．１实验材料
尾巨桉种于西南大学生态种植园，取其距茎尖
第３～４轮叶片为试验材料。
１．２质粒、菌株及试剂
ｐＭＤ１９－Ｔ载体、ＴａＫａＲａ ＴａｑＴＭ、ＤＮＡ Ｌｉｇａ－
ｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．２．０、ＴＡＫＡＲＡ ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ
（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．３．０、ＳＹＢＲ? Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ Ⅱ购
自ＴａＫａＲａ大连宝生物公司；ＲＮＡ ｐｌａｎｔ（ｍｉｎｉ）Ｋｉｔ
购自上海华舜生物技术有限公司。大肠杆菌ＤＨ５α
菌株由西南大学三峡库区生态环境教育部重点实验
室保存。
１．３总ＲＮＡ及基因组总ＤＮＡ提取
按ＲＮＡ ｐｌａｎｔ（ｍｉｎｉ）Ｋｉｔ说明分别提取尾巨桉
根、茎和叶总ＲＮＡ；采用改良ＣＴＡＢ法（王关琳等，
２００２）提取叶基因组总ＤＮＡ。总ＲＮＡ及ＤＮＡ都
经１．２％琼脂糖凝胶电泳，并用 ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００型
分光光度计检测ＯＤ２６０／ＯＤ２８０值。
１．４ ＨＭＧＲ基因的克隆
根据ＨＭＧＲ基因保守片段，基于ＲＡＣＥ技术
得到ＨＭＧＲ基因３′端和５′端，在Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ Ｓｕｉｔｅ
８中进行拼接得到ＨＭＧＲ基因ｃＤＮＡ全长，并进行
生物信息学分析。
１．５ ＨＭＧＲ基因内含子分析
根据 ＨＭＧＲ 基因 ＯＲＦ，用软件 Ｏｌｉｇｏ６．０和
ＤＮＡＳｔａｒ设计３对引物，ｆｇ Ｈ１：５′－ＡＴＧＧＣＣＧＣ－
ＣＡＴＣＧＴＣＧＣＣＴＴＣＧ－３′，ｒｇ Ｈ１：５′－ＴＧＧＣＣＴＴＧ－
ＣＡＧＣＣＣＣＴＧＴＴＣＧＴＧ－３′；ｆｇ Ｈ２：５′－ＣＡＣＧＡＡ－
ＣＡＧＧＧＧＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡ－３′，ｒｇ Ｈ２：５′－ＴＡＧＡＡ
ＧＧＣＡＴＧＧＴＣＡＣＡＧＡＡＡＣＧＴＧ－３′；ｆｇ Ｈ３： ５′－
ＣＧＴＴＴＣＴＧＴＧＡＣＣＡＴＧＣＣＴＴＣＴＡ－３′，ｒｇ Ｈ３：５′－
ＴＴＡＡＧＡＧＧＡＧＡＣＣＴＴＧＧＴＡＡＣＧＴＣＴＴＴＧＣ－
３′。以基因组 ＤＮＡ为模板，按ＴａＫａＲａ ＴａｑＴＭ说
明于６４、６２℃和５７℃进行ＰＣＲ扩增得到ｇ Ｈ１、
ｇ Ｈ２和ｇ Ｈ３片段，经回收、转化及测序，并拼接得
到ＨＭＧＲ基因组ＤＮＡ序列，记为ｇＤＮＡ－ＨＭＧＲ；
将ＨＭＧＲ的ｃＤＮＡ序列ｃＤＮＡ－ＨＭＧＲ与ｇＤＮＡ－
ＨＭＧＲ进行比对，分析ＨＭＧＲ内含子情况。
１．６ ＨＭＧＲ基因组织特异性表达分析
根据内参基因１８Ｓ（登录号：ＡＹ６１５６７９．１）和
ＨＭＧＲ基因序列，用软件Ｂｅａｃｏｎ Ｄｅｓｉｇｎｅｒ７．６设计
引物。１８Ｓ 基因引物为ｆ１８Ｓ：５′－ＡＣＴＣＡＴＡＡＣ－
ＧＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＡＣ －３′， ｒ１８Ｓ： ５′－ＧＣＧＴ－
ＴＣＡＡＡＧＡＣＴＣＧＡＴＧＧＴ－３′；ＨＭＧＲ 基因引物为
ｆ ＨＭＧＲ：５′－ＧＡＡＡＧＧＣＧＣＴＡＡＣＡＡＧＧＡＧＣＴＡ－
３′，ｒ ＨＭＧＲ：５′－ＧＴＡＣＴＴＣＡＴＧＴＧＧＣＴＣＴＴＣＡ
ＣＧ－３′。将尾巨桉根、茎和叶总ＲＮＡ按 ＴＡＫＡＲＡ
ＲＮＡ ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＡＭＶ）Ｖｅｒ．３．０说明逆转录合成
ｃＤＮＡ第一链，按照ＳＹＢＲ? Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ Ⅱ
说明于５８℃在Ｃｈｒｏｍｏ ４实时定量ＰＣＲ仪（Ｂｉｏ－
Ｒａｄ）进行反应，每组样品重复３次，采用２－ΔΔＣＴ法于
软件Ｏｐｔｉｃｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒ ３中进行结果分析。
２ 结果与分析
２．１尾巨桉总ＲＮＡ及ＤＮＡ提取
尾巨桉根、茎和叶组织总ＲＮＡ经电泳表明没
有基因组ＤＮＡ污染，２８Ｓ与１８Ｓ亮度接近２∶１（图
１）。ＯＤ２６０／ＯＤ２８０均在１．９２～２．１８之间，ＲＮＡ完整
性较好，降解程度较低，达到实验要求。尾巨桉叶总
ＤＮＡ经电泳检测表明没有ＲＮＡ污染，ＯＤ２６０／ＯＤ２８０
４１１ 广 西 植 物 ３２卷
在１．６５～１．８７范围内，ＤＮＡ纯度较高。
图１ 尾巨桉总ＲＮＡ及总ＤＮＡ提取
Ｆｉｇ．１ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｌｅａｆ ｏｆ
Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｕｒｏｐｈｙｌａ×Ｅ．ｇｒａｎｄｉｓ
图２ 尾巨桉与其它植物 ＨＭＧＲ氨基酸序列多重比对
Ｆｉｇ．２ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｄｅｄｕｃｅｄ ＥｕＨＭＧＲ
ａｎｄ ＨＭＧＲｓ ｆｒｏｍ ｏｔｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ
２．２ ＨＭＧＲ基因的克隆及生物信息学分析
基于ＲＡＣＥ技术，克隆得到尾巨桉ＨＭＧＲ基因
ｃＤＮＡ全长１ ９５５ｂｐ，命名为ＥｕＨＭＧＲ；包含１ ５６０
ｂｐ的ＯＲＦ，编码５１９个氨基酸，ＧｅｎＢａｎｋ登录号为
ＧＱ９１５６１１。尾巨桉与青钱柳（Ｃｙｃｌｏｃａｒｙａｐａｌｉｕｒｕｓ）、
橡胶树（Ｈｅｖｅａ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ）、沙梨（Ｐｙｒｕｓ ｐｙｒｉｆｏｌｉａ）、
青蒿（Ａｒｔｅｍｉｓｉａ ａｎｎｕａ）、普通烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａ－
ｃｕｍ）、喜树（Ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃａ ａｃｕｍｉｎａｔａ）、番茄（Ｓｏｌａｎｕｍ
ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）（登 录 号 依 次 为 ＡＢＸ８２８３８．１、ＢＡＦ
９８２８１．１、ＡＣＥ８０２１３．１、ＡＡＡ６８９６６．１、ＡＡＬ５４８７８．１、
ＡＡＢ６９７２６．１、ＡＡＢ６２５８１．１）的ＨＭＧＲ氨基酸序列比
对分析，尾巨桉ＥｕＨＭＧＲ与其它物种一样，具有两
个ＨＭＧ－ＣｏＡ结合基序（图２）：ＥＭＰＶＧＹＶＱＬＰ和
ＴＴＥＧＣＬＶＡ；其中，ＴＴＥＧＣＬＶＡ 中的谷氨酸（Ｇｌｕ）在
ＨＭＧＲ催化中起着重要作用。同时包括两个ＮＡＤＰ
（Ｈ）结合基序：ＲＣＤＧＨＥＨ和ＧＴＶＧＧＧＴ，只显示其
重要功能的结合基序（Ｌｉａｏ等，２００４）。
以（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）的 ＨＭＧＲ（２ｑ６ｂＡ）为模型，
同源建模得到尾巨桉ＥｕＨＭＧＲ的三维构象呈一个
“Ｖ”型（Ｉｓｔｖａｎ等，２０００）。用 Ａｃｃｅｌｒｙｓ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ
Ｓｔｕｄｉｏ Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｒ２．５处理后的结果（图３）。尾巨桉
ＥｕＨＭＧＲ的空间结构与其它植物一样具有３个结
构域：（１）氨基末端的小的螺旋状的 Ｎ－结构域；（２）
位于中间部分大的Ｌ－结构域，其隐藏着两个 ＨＭＧ－
ＣｏＡ结合域（ＥＭＰＶＧＹＶＱＬＰ和 ＴＴＥＧＣＬＶＡ）；
以及一个有着像由α－螺旋组成中心结构的棱柱形
的ＮＡＤＰ（Ｈ）结合域（ＧＴＶＧＧＧＴ）；（３）螺旋状的
小的 Ｓ－结构 域，包 含 ＮＡＤＰ（Ｈ）结 合 域 （ＲＣ－
ＤＧＨＥＨ）。
图３ 尾巨桉ＥｕＨＭＧＲ三维结构模型
Ｆｉｇ．３ Ｔｈｒｅｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＥｕＨＭＧＲ
图４ 尾巨桉ｇＤＮＡ－ＥｕＨＭＧＲ扩增
Ｆｉｇ．４ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＥｕＨＭＧＲＯＲＦ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
２．３ ＨＭＧＲ基因内含子分析
通过ＰＣＲ扩增，分别于６４、６２℃和５７℃从基
因组ＤＮＡ中扩增得到大小为６３４、１ ０２０ｂｐ和２７１
ｂｐ的３个片段（图４），将这三个片段的序列拼接得
到大小为１ ８７９ｂｐ的ｇＤＮＡ－ＥｕＨＭＧＲ。ｇＤＮＡ－
５１１１期 蒋春等：尾巨桉ＨＭＧＲ基因的克隆及表达分析
ＥｕＨＭＧＲ 与 ｃＤＮＡ－ＥｕＨＭＧＲ 比对表明，ＥｕＨ－
ＭＧＲ在编码区内存在一个内含子，长度为３１９ｂｐ
（图５），只显示内含子部分比对序列。
２．４ ＨＭＧＲ基因组织特异性表达分析
通过实时定量ＰＣＲ得到ＥｕＨＭＧＲ 在不同组
织中的相对定量表达结果（图６），ＥｕＨＭＧＲ在茎中
图５ 尾巨桉ｃＤＮＡ－ＥｕＨＭＧＲ与ｇＤＮＡ－ＥｕＨＭＧＲ比对
Ｆｉｇ．５ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ＥｕＨＭＧＲＯＲＦ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｒｏｍ ｃＤＮＡ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
图６ 尾巨桉不同组织中ＥｕＨＭＧＲ的定量表达分析
Ｆｉｇ．６ Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｆ ＥｕＨＭＧＲｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｉｓｓｕｅｓ
的表达量最高，叶次之，而根中几乎无表达；这结果
与Ｊｉａｎｇ等（２００６）的研究结果相一致。叶是桉树精
油合成的主要组织，其次是茎。叶油腺细胞中萜类
相关代谢旺盛，ＨＭＧＲ作为 ＭＶＡ途径中生成萜类
前体物质的第一个关键酶，在茎和叶中较高表达。
３ 结论与讨论
目前，在橡胶树（Ｃｈｙｅ等，１９９１）、杜仲（Ｊｉａｎｇ
等，２００６）、大戟（Ｃａｏ等，２０１０）等植物中已成功克隆
ＨＭＧＲ基因，并进行了相关结构及功能分析。对已
报道植物的 ＨＭＧＲ进行功能结构分析得知，通常
植物 ＨＭＧＲ 存 在 两 个 ＨＭＧ－ＣｏＡ 结 合 基 序
（ＥＭＰＶＧＹＶＱＬＰ 和 ＴＴＥＧＣＬＶＡ）以 及 两 个
ＮＡＤＰ （Ｈ ） 结 合 基 序 （ＤＡＭＧＭＮＭ 和
ＧＴＶＧＧＧＴ）。本研究所克隆得到尾巨桉 ＥｕＨ－
ＭＧＲ功能结构基序与其它植物不同，即第一个
ＮＡＤＰ（Ｈ）结 合 基 序 不 是 多 数 植 物 典 型 的
ＤＡＭＧＭＮＭ结构，而是 ＲＣＤＧＨＥＨ，推测其为一
个新的ＮＡＤＰ（Ｈ）结合基序，因为该结合基序中间
部位与其它植物典型的结构一样存在一个甘氨酸
（Ｇ）位点，在甘氨酸后组成为组氨酸－谷氨酸－组氨酸
（ＨＥＨ）与其它植物典型的的蛋氨酸－天冬酰胺－蛋
氨酸（ＭＮＭ）极为相似。为了验证这一假设，可进
一步表达、分离和提纯尾巨桉ＥｕＨＭＧＲ蛋白，进行
催化作用位点方面的研究。
前体ｍＲＮＡ需要将内含子剪接掉，再经加工修
饰才能形成有效的 ｍＲＮＡ。目前对内含子的功能
尚不明确，主要作用可能是通过外显子的复制和移
动简化新基因的进化过程，同时内含子可变剪接改
变基因结构，增加表达蛋白的多样性（王悦兵等，
２００８）。本研究表明尾巨桉ＥｕＨＭＧＲ基因包含一
个大小为３１９ｂｐ的内含子；根据多数植物 ＨＭＧＲ
基因的克隆分析，ＨＭＧＲ基因一般存在多个基因家
族成员。尾巨桉中是否存在ＨＭＧＲ基因家族还不
６１１ 广 西 植 物 ３２卷
清楚，后续工作将通过Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ进行验证，确
定内含子剪接与各基因家族成员之间的是否存在一
定联系，同时也有助于 ＨＭＧＲ 基因家族各成员的
功能进行分析验证。
Ｓｃｈａｌｅｒ等（１９９５）将橡胶树的 ＨＭＧＲ 基因转
化到烟草中，结果 ＨＭＧＲ的活性增强３～８倍，同
时甾醇总含量提高近６倍。Ｍａｎｚａｎｏ等（２００４）在拟
南芥中超量表达其自身 ＨＭＧＲ 基因，结果也能够
提高甾醇总含量。尾巨桉ＥｕＨＭＧＲ是否为精油代
谢调控靶点，有待进一步进行遗传转化方面的研究；
本研究为最终通过基因工程提高桉树精油产量奠定
了一定基础。
参考文献：
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檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸檸
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