全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Oct．２０１５,３５(５):７４１－７４７　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．１１９３１/guihaia．gxzw２０１３１２０３４
王彩云,李富生,李涛,等．滇龙胆GrWRKY５基因的克隆和植物表达载体构建[J]．广西植物,２０１５,３５(５):７４１－７４７
WangCY,LiFS,LiT,etal．CloningandconstructionofplantexpressionvectorofGrWRKY５geneinGentianarigescens[J]．Guihaia,２０１５,３５(５):
７４１－７４７
滇龙胆GrWRKY５基因的克隆和植物表达载体构建
王彩云１,４,李富生１,李　涛２,李彩霞２,张晓东２∗,王元忠３
(１．云南农业大学 农学与生物技术学院,昆明６５０２０１;２．玉溪师范学院 资源环境学院,云南 玉溪６５３１００;３．云南省
农业科学院 药用植物研究所,昆明６５０２２３;４．贵州省毕节市中药研究所,贵州 毕节５５１７００)
摘　要:WRKY蛋白是目前被广泛研究的一类DNA特异结合转录因子,在植物次生代谢物生物合成、植物
生长和发育及衰老等生理过程以及生物、非生物防御反应中起重要的调控作用.该研究从滇龙胆幼叶中克隆
萜类合成的关键转录因子基因GrWRKY５,并利用生物信息学方法对基因功能进行预测,构建植物过表达载
体.结果表明:根据三年生滇龙胆转录组GrWRKY５基因序列,设计特异性引物,通过 RTＧPCR 扩增
GrWRKY５ORF序列,并进行TA克隆、测序和序列分析;构建入门载体pENTRTM２BＧGrWRKY５,经LR反
应后构建植物过表达载体.GrWRKY５ORF全长５９１bp,编码１９６个氨基酸,GenBank登录号为KF９２２３７５,
其中第１６７与１７０之间的色氨酸(W)、精氨酸(R)、赖氨酸(K)、酪氨酸(Y)组成 WRKY 蛋白所特有的
“WRKY”结构.序列分析表明GrWRKY５是 WRKY超家族的成员.经生物信息学在线软件分析发现,
GrWRKY５的等电点为６．２９,脂肪族指数为６１．３７,不稳定指数为５７．８０.总平均疏水性为Ｇ０．７０８,为亲水蛋白;
含有２０种氨基酸,其中天冬氨酸(Asp)和脯氨酸(Pro)含量最高,为８．１％;半胱氨酸(Cys)含量最低,仅为
１．０％.氨基酸序列系统发育分析表明,GrWRKY５与拟南芥中 WRKY 家族中遗传距离最接近的是
WRKY２７,属于Ⅱe类成员;与 CrWRKY２２和 VvWRKY２２蛋白的亲缘关系较近;与JcWRKY４７和 TcＧ
WRKY２７亲缘关系较远;BLASTp结果显示,GrWRKY５与欧洲油菜BnWRKY２７Ｇ１的同源性最高(为６９％);
与拟南芥AaWRKY２２的一致性最低(仅为３１％).以Gateway入门载体pENTR２B和目的载体pK２GW７为
基础,成功构建了植物过表达载体pK２Ｇ３５SＧGrWRKY５,该载体的成功构建为该基因在拟南芥、滇龙胆等植物
中的遗传转化奠定了基础,同时为WRKY 基因功能的深入研究提供依据.
关键词:滇龙胆;GrWRKY５;基因克隆;序列分析;植物表达载体构建
中图分类号:Q９４３．２,Q７８６　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１５)０５Ｇ０７４１Ｇ０７
Cloningandconstructionofplantexpressionvectorof
GrWRKY５geneinGentianarigescens
WANGCaiＧYun１,４,LIFuＧSheng１,LITao２,LICaiＧXia２,
ZHANGXiaoＧDong２∗,WANG YuanＧZhong３
(１．CollegeofAgricultureandBiologicalTechnology,YunnanAgricultureUniversity,Kunming６５０２０１,China;２．Collegeof
ResourcesandEnvironment,YuxiNormalUniversity,Yuxi６５３１００,China;３．InstituteofMedicinalPlants,YunnanAcademy
ofAgriculturalSciences,Kunming６５０２２３,China;４．BijieInstituteofTraditionalChineseMedicine,Bijie５５１７００,China)
Abstract:WRKYproteinisaclassofspecificDNAＧbindingtranscriptionfactorwidelystudiedatpresent,whichplays
keyregulatingrolesinthebiosynthesisofplantsecondarymetabolites,thephysiologicalprocessesofplantgrowth,
收稿日期:２０１４Ｇ０８Ｇ２３　　修回日期:２０１４Ｇ１０Ｇ２１
基金项目:国家自然科学基金(８１２６０６０８);云南省教育厅科学研究基金重点项目(２０１３Z０７５);国家“十二五”科技支撑计划项目(２０１１BAI１３B０２Ｇ０４).
作者简介:王彩云(１９８９Ｇ),女,云南宣威人,硕士研究生,研究方向为药用植物资源评价与利用,(EＧmail)wangcaiyun０７１６＠１２６．com.
∗通讯作者:张晓东,博士,讲师,主要研究方向为植物代谢基因工程,(EＧmail)zxd９５＠１２６．com.
development,senescenceandthedefensereactionsofbothbioticandabioticstresses．Toobtainthekeytranscription
factorsinvolvedintheterpenoidbiosynthesis,ageneGrWRKY５wasclonedfromthespireofGentianarigescens．Its
bioinformaticanalysis wasperformedtopredictitsfunctionsanditsplantoverexpressionvector wasalso
constructed．ThegenespecificprimersweredesignedaccordingtothetranscriptsequenceofGrWRKY５fromthe
transcriptomeoftriennialG．rigescens．Theopenreadingframe(ORF)ofGrWRKY５wasobtainedbyReverseTranＧ
scriptionＧPolymeraseChain Reaction (RTＧPCR)．Then TA cloning,sequencing,andsequenceanalysis were
performed．EntryvectorpENTRTM２BＧGrWRKY５wasconstructed,andtheplantoverexpressionvectorofpK２Ｇ３５SＧ
GrWRKY５wasobtainedafterLRreaction．TheORFofGrWRKY５hasalengthof５９１bpandencodesapredicated
proteinof１９６aminoacids．TheGenBankaccessionnumberforGrWRKY５isKF９２２３７５．Thetryptophan(W),argiＧ
nine(R),lysine(K),tyrosine(Y)between１６７and１７０in WRKYproteinconsistofthe＂WRKY＂symbolic
structure．SequenceanalysisshowedthatGrWRKY５wasamemberof“WRKY”superfamily．ResultsofbioinformaＧ
tionsoftwareonlineanalysisshowedthatthetheoreticalisoelectricpoint(pI),thealiphaticindexandtheinstability
indexofGrWRKY５proteinwere６．２９,６１．３７and５７．８０,separately．TheGRAVY (grandaverageofhydropathicity)
ofGrWRKY５proteinwasＧ０．７０８,whichindicatedthatitbelongedtohydrophilicprotein．GrWRKY５proteinconＧ
tainedmorethan２０kindsofaminoacids,andtheasparticacid(Asp)andproline(Pro)accountedforthehighest
content(８．１％),whileCysteine(Cys)contentwasthelowestaccountingforonly１．０％．ResultsofphylogeneticaＧ
nalysisshowedthatGrWRKY５wasatthesameevolutionarybranchwithAtWRKY２７,amemberofclassⅡe,and
thatGrWRKY５wasclosetotheCrWRKY２２proteinofCatharanthusroseusandtheVvWRKY２２proteinofVitis
viniferaandwasfarfromtheJcWRKY４７proteininJatrophacurcasandtheTcWRKY２７proteininTheobromacaＧ
cao．ResultsofBLASTpshowedthatGrWRKY５proteinhadthehighestidentity(６９％)withtheBnWRKY２７Ｇ１
proteininBrassicanapus,whileithadthelowestidentity(３１％)withtheAaWRKY２２proteininArabidopsisthaliＧ
ana．TheplantoverexpressionvectorpK２Ｇ３５SＧGrWRKY５whichwassuitableforagrobacteriumtumefaciensand
genegunＧmediatedtransformationwassuccessfulyconstructedbaseonentryvectorpENTR２Banddestinationvector
pK２GW７ofGatewaysystem．ThesuccessfulconstructionofplantoverexprossionvectorpK２Ｇ３５SＧGrWRKY５wil
provideafoundationforitsgenetictransformationintoArabidopsisthalianaandGentianarigescensandprovideabaＧ
sisforthefurtherstudyofgenefunction．
Keywords:Gentianarigescens;GrWRKY５;genecloning;sequenceanalysis;coustructionofplantexpressionvector
　　WRKY转录因子是近年来在植物中新发现的转
录调控因子,最早由Ishiguroetal．(１９９４)在番薯(IpＧ
omoeabatatas)中发现,随后在烟草(NicotianatabaＧ
cum)、野生燕麦(Avenafatha)、马铃薯(SolanumtuＧ
berosum)、玉米(Zeamays)、水稻(Oryzasatiwa)等植
物中相继克隆了该家族的成员(Weietal．,２０１２;
Dongetal．,２０１２;Huangetal．,２０１２).WRKY基因
在原生生物蓝氏贾第鞭毛虫(Giardialamblia)(Pan
etal．,２００９)和粘液菌盘基网柄菌(DictyosteliumdisＧ
coideum)(Ülkeretal．,２００４)中的成功克隆,打破人
们对该基因是植物中特有基因的误解,也证实了该基
因的起源,即大约１５．４亿年前,原生生物与植物分化
之前.(张娟,２００９).
WRKY转录因子是一类含高度保守的、由约
６０个氨基酸残基组成的 WRKY结构域的锌指蛋
白,靠 近 氨 基 (N)末 端 的 ７ 个 保 守 氨 基 酸
WRKYGQK是该保守结构域的核心序列,而该序
列的变异将会导致DNA的结合活性的减弱或者丧
失(王彩云等,２０１３);而羧基(C)末端的类似锌指结
构在植物进化中起重要作用(Xieetal．,２００５).根
据锌指结构的特征及 WRKY 结构域的数量,将
WRKY蛋白家族分为３类:含有２个 WRKY构结
域及C２ＧH２(CＧX４Ｇ５ＧCX２２Ｇ２３ＧHＧXＧH)锌指结构的
为第Ⅰ类;含有１个 WRKY构结域及C２ＧH２(CＧ
X４Ｇ５ＧCX２２Ｇ２３ＧHＧXＧH)锌指结构的为第Ⅱ类;含有
１个 WRKY构结域及C２ＧHC(CＧX７ＧCＧX２３ＧHＧXＧC)
锌指结构的为第Ⅲ类.(Eulgemetal．,２０００;Liet
al．,２０１０;王彩云等,２０１３).
WRKY转录因子在植物生物和非生物防御调
控、生长发育和信号应答中起着重要作用(Mingyu
etal．,２０１２;Rushtonetal．,２０１０;Robatzeket
al．,２００２;Renetal．,２０１０).Xuetal．(２００４)从陆
地棉(Gossypiumhirsutum)中克隆到的GaWRKY１
转录因子在棉子酚的生物合成调控中起重要作用,
２４７ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
而在该途径中GaWRKY１主要参与了陆地棉(＋)Ｇ
１ＧδＧ杜松烯合酶ＧAＧ((＋)Ｇ１ＧδＧcadinenesynthaseＧA,
CAD１ＧA)活性的调节;Maetal．(２００９)从黄花蒿
(Artemisiaannua)中克隆到AaWRKY１基因,并
证明该基因通过调节青蒿素生物合成途径中的关键
酶基因amorphaＧ４,１１Ｇdienes(ADS)的活性进而参
与青蒿素生物合成的调控.
滇龙胆(Gentianarigescens)是云南道地药材
之一,其主要药效成分龙胆苦苷属萜类化合物(沈涛
等,２０１１).但其生物合成途径及调控机理尚不清
楚,赵恒伟等(２０１２)的研究表明 WRKY转录因子
在萜类生物合成调控中起重要作用(赵恒伟等,
２０１２).目前,国内外对 WRKY的研究主要集中在
拟南芥、水稻等植物中,而有关滇龙胆等龙胆科植物
WRKY基因功能的研究未见有报道.本研究将为
龙胆苦苷等萜类化合物生物合成途径的研究及其调
控机理的阐明奠定基础,同时为 WRKY转录因子
的深入研究提供依据.
１　材料与方法
１．１材料
选取种植于云南省农业科学院药用植物研究所
种质资源圃(２５°０８′０４．５０″N,１０２°４６′１５．０５″E)长势
良好的滇龙胆(Gentianarigescens)幼叶为材料.
种植地海拔１９４２ m,年平均降水量９８０~１０５０
mm,年平均气温１４．７°C,极端高温３０．４°C,极端低
温Ｇ０．２℃(王彩云等,２０１４a;王彩云等,２０１４b).大
肠杆菌(Escherichiacoli)Trans５α感受态细胞购自
宝生物工程(大连)有限公司.
１．２试剂
RNAisoforPolysaccharideＧrich Plant Tissue
Reagent、反转录试剂盒、限制性内切酶及IPTG(异
丙基ＧβＧDＧ硫代半乳糖苷)、XＧgal(５Ｇ溴Ｇ４Ｇ氯Ｇ３Ｇ吲哚Ｇ
βＧDＧ半乳糖苷)等均购买于宝生物工程(大连)有限
公司;高纯质粒小量制备试剂盒、多功能DNA纯化
回收试剂盒购买于北京百泰克生物技术有限公司;
入门载体 pENTRTM２B 和植物过表达载体 pK２
GW７由玉溪师范学院分子实验室保存;由上海捷瑞
生物工程有限公司合成引物,生工生物工程(上海)
有限公司完成测序工作(王彩云等,２０１４a;王彩云
等,２０１４b).
１．３方法
１．３．１总RNA提取及GrWRKY５的PCR扩增　滇
龙胆幼叶总 RNA的提取按照多糖植物组织提取
(RNAisoforPolysaccharideＧrichPlantTissue)试
剂盒说明进行;cDNA 的合成根据 ReverseTranＧ
scriptaseMＧMLV(RNaseHＧ)试剂盒说明书完成.
根据三年生滇龙胆转录组GrWRKY５基因序列和
入门 载 体 pENTRTM ２B,设 计 １ 对 特 异 引 物
GrWRKY５EcoRIＧF:GAATTCATGGCTGATTTＧ
TGAAGATAATTG;GrWRKY５XhoIＧR: CTCＧ
GAGTTAAAAATGGAGCAATTTAATTTGA.
以cDNA为模板进行PCR扩增,反应条件为９４℃
３min;９４℃３０s,５０℃３０s,７２℃４０s,３０个循环;
７２℃延伸７min.
１．３．２GrWRKY５基因的克隆与测序　GrWRKY５
基因PCR产物经１．０％的琼脂糖凝胶电泳检测、分
离后,按照说明书用胶回收试剂盒回收目的片段,纯
化后连接到pMD１９ＧT载体上,转化E．coliTrans
５α感受态细胞,涂布于添加氨苄青霉素(１００mg􀅰
LＧ１)、IPTG和XＧgal的LB平板,３７℃培养１２~１６
h后随机挑选阳性克隆摇菌并提取质粒,经PCR检
测和 酶 切 验 证 正 确 后 测 序,获 得 pMD１９TＧ
GrWRKY５重组载体(王彩云等,２０１４a,b)(图１).
１．３．３GrWRKY５的生物信息学分析　利用 NCBI
网站上的BLAST程序对 GrWRKY５进行序列比
对;利用在线软件预测蛋白质相对分子量、等电点、
功能、结构域、二级结构和三级结构等;应用DNAＧ
MAN软件进行多序列比对;应用 Mega５．１软件内
置的NJ法构建系统进化树,设置bootstrap＝１０００
(王彩云等,２０１４a,b).
１．３．４植物过表达载体构建　pMD１９TＧGrWRKY５
重组质粒和 pENTRTM２B 载体分别用 EcoRI和
XhoI双酶切,回收目的基因和载体片段,按１∶４物
质的量比混合后经LigationSolutionⅠ连接过夜、
转化E．coliTrans５α感受态细胞,涂布于含卡那霉
素(１００mg􀅰LＧ１)的LB平板,次日随机挑选阳性克
隆摇菌并提取质粒,经PCR检测和酶切验证正确后
测序(王彩云等,２０１４a,b),即可获得入门克隆载体
pENTRTM２BＧGrWRKY５(图１).使用GatewayLR
反应试剂盒(Invitrogen),将入门载体与目的载体
pK２GW７进行LR反应,２５℃过夜反应后转化大肠
杆菌Trans５α感受态细胞,并涂布于LB平板(含
１００mg􀅰LＧ１壮观霉素),３７℃培养过夜.次日,挑
３４７５期　　　　　　　　王彩云等:滇龙胆GrWRKY５基因的克隆和植物表达载体构建
单菌落、摇菌后用试剂盒提取质粒,经PCR和酶切
检测载体的正确性.
２　结果与分析
２．１滇龙胆GrWRKY５cDNA的克隆
经琼脂糖凝胶电泳检测以滇龙胆cDNA为模
板扩增出的PCR产物,得到６００bp左右的扩增片
段,与预期片段大小一致(图２).测序结果表明克
隆到GrWRKY５(登录号为KF９２２３７５),其ORF全
长５９１bp.
２．２GrWRKY５序列分析
２．２．１氨基酸序列同源性分析　利用Genetyx以及
DNAMAN软件分析GrWRKY５基因序列,结果表
明GrWRKY５基因的开放阅读框(ORF)全长５９１
bp,编码１９６个氨基酸,其中由１６７~１７０之间的色
氨酸(W)、精氨酸(R)、赖氨酸(K)和酪氨酸(Y)组
成WRKY 基因所特有的标志性的“WRKY”结构.
用DNAMAM 对GrWRKY５和选自 NCBI中
的８７条拟南芥 WRKY蛋白进行多序列比对,并用
MEGA５．１构建系统进化树(图３).图３结果显示
GrWRKY５与拟南芥中 WRKY２７的亲缘关系最
近,属于Ⅱe类成员.AtWRKY２７蛋白与GA信号
调控有关,因此 GrWRKY５蛋白可能具有类似
功能.
用DNAMAN将GrWRKY５氨基酸序列与拟
南芥中 WRKY蛋白序列的保守结构域进行多序列
比对,结果表明GrWRKY５蛋白与已知蛋白序列的
WRKY结构域高度保守,进一步表明其为 WRKY
超家族成员.用GenBank数据库中的BLASTp程
序分析GrWRKY５氨基酸序列的同源性,结果显示
在所选的 WRKY序列中,GrWRKY５与欧洲油菜
BnWRKY２７Ｇ１的同源性最高,为６９％;与拟南芥
AaWRKY２２的一致性最低,仅为３１％(表１).
将GrWRKY５蛋白与 NCBI中一致性较高的
序列进行系统进化分析,结果发现 GrWRKY５与
CrWRKY２２和VvWRKY２２蛋白的亲缘关系较近;
与JcWRKY４７和TcWRKY２７亲缘关系较远(图４).
将GrWRKY５蛋白与NCBI中已知 WRKY序
列进行多序列比对,结果显示 GrWRKY５与已知
WRKY蛋白在 WRKY保守结构域具有较高相似
性外,其余部分同源性较低(图５).
２．２．２理化性质分析　用ExPASyProtParamtool
表１　GrWRKY５蛋白与NCBI中已知植物
WRKY序列比对结果
Table１　BLASTpresultsofGrWRKY５proteinwith
otherknownWRKYproteinsofNCBIinplants
物种
Species
基因
Gene
相似性
Identity
(％)
登录号
Accession
No．
长春花
Catharanthusroseus
CrWRKY２２ ３７ AFK８８６７５．１
葡萄
Vitisvinifera
VvWRKY２２ ３６ XP_００２２７８２２１．１
欧洲油菜
Brassicanapus
BnWRKY２２ ３５ ACQ７６８０２．１
番茄
Solanumlycopersicum
SlWRKY２２ ３３ XP_００４２２９９３２．１
野草莓
Fragariavesca
FvWRKY２９ ３４ XP_００４２９８８３７．１
麻疯树
Jatrophacurcas
JcWRKY４７ ３４ AGQ０４２３８．１
可可
Theobromacacao
TcWRKY２３ ３２ EOX９５８６２．１
拟南芥
Arabidopsisthaliana
AaWRKY２２ ３１ NP_１９２０３４．１
麻疯树
Jatrophacurcas
JcWRKY４５ ５３ AGQ０４２３６．１
欧洲油菜
Brassicanapus
BnWRKY２２Ｇ１ ３１ ACI１４３８９．１
大豆
Glycinemax
GmWRKY２２ ５９ XP_００３５５５３９５．１
可可
Theobromacacao
TcWRKY２７ ６５ EOY２０３０８．１
欧洲油菜
Brassicanapus
BnWRKY２７Ｇ１ ６９ ACI１４３９２．１
软件分析,GrWRKY５蛋白分子量为２２．２８KD,理
论等电点为６．２９,化学式为C９９０H１５０８N２７８O２９５S８.脂
肪族指数为６１．３７,不稳定指数为５７．８０,半衰期为
３０h.总平均疏水性为Ｇ０．７０８,该值位于Ｇ２至０之
间,表明该蛋白.GrWRＧKY５蛋白含有２０种氨基
酸,其中天冬氨酸(Asp)和脯氨酸(Pro)含量最高,
为８．１％;半胱氨酸(Cys)含量最低,仅为１．０％.
２．２．３蛋白质二级结构和三维建模　用Sspro在线
工具对GrWRKY５蛋白进行二级结构分析.结果
显示在该蛋白的二级结构中,无规则卷曲(C)占
７７．６６％,αＧ螺旋 (H)占 １４．２１％,βＧ折叠 (E)占
８．１２％.用 CPHmodels３．２Server在线工具对
GrWRKY５蛋白的三级结构进行预测(图６).从图
６中可以看出GrWRKY５的三级结构形成了多个无
规则卷曲,这些无规则卷曲由αＧ螺旋与βＧ折叠连接.
２．２．４结构域预测　采用InterProScan在线软件对
GrWRKY５蛋白的保守结构域进行预测,结果表明
GrWRKY５蛋白 DNA 结合结构域(DNAＧbinding
WRKY)(IPR００３６５７)可 能 位 于 １６１~１８１ 位
WRKY结构域(PF０３１０６),或１６０~１９１位DNA结
４４７ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
图１　植物表达载体pK２Ｇ３５SＧGrWRKY５的构建策略
Fig．１　ConstructionofpK２Ｇ３５SＧGrWRKY５
plantexpressionvector
图２　GrWRKY５基因的 RTＧPCR 扩增　M．DNA
MarkerⅢ;泳道１．GrWRKY５扩增产物.
Fig．２　AmplificationofGrWRKY５genebyRTＧPCR　
M．DNAMarkerⅢ;Lane１．PCRproductofGrWRKY５．
合结构域(SM００７７４),或１５５~１８１位 WRKY结构
域(PS５０８１１),或１５１~１８１位 WRKYDNA结合结
构域(SSF１１８２９０),还有未明确定义的１４６~１８１位
(２．２０．２５．８０)结构域.另外还有一个在IPR中没有
明确 分 类 的 保 守 结 构 域,位 于 １４１~１８１ 位
(PTHR３１２８２).利用推测的蛋白序列检索 NCBI
的CDD(ConservedDomainDatabase)数据库,发现
图３　GrWRKY５与拟南芥 WRKY蛋白的系统进化树
Fig．３　PhylogeneticrelationshipofGrWRKY５with
WRKYproteinsinArabidopsisthaliana
图４　GrWRKY５与其他植物中WRKY蛋白的系统发育分析
Fig．４　PhylogeneticrelationshipofGrWRKY５and
WRKYproteinsinotherplants
WRKY蛋白含有 WRKY保守结构域,进一步表明
GrWRKY５属于 WRKY家族.
２．２．５信号肽、跨膜区、亚细胞定位以及功能预测分
析　利用ExPASySignalP４．０Server在线工具对
GrWRKY５蛋白进行信号肽分析,结果显示该蛋白
为非分泌型蛋白.应用在线软件Expasy中的TMＧ
HMM工具预测GrWRKY５蛋白的跨膜螺旋区,未
发现跨膜螺旋区,表明该蛋白为非膜蛋白.对
GrWRKY５蛋白进行亚细胞定位情况预测,结果表
明该蛋白的定位系数为６．６(chlo:６．６),可能定位
于叶绿体.使用ProtFun软件预测GrWRKY５蛋白
５４７５期　　　　　　　　王彩云等:滇龙胆GrWRKY５基因的克隆和植物表达载体构建
图５　GrWRKY５与其他植物中 WRKY５氨基酸序列的保守区比对结果
Fig．５　ConservativeregionalignmentofGrWRKY５aminoacidswithWRKYproteinsinotherplants
图６　GrWRKY５的三维结构预测
Fig．６　Predictedthreedimensionalstructure
ofGrWRKY５protein
的功能,结果显示GrWRKY５蛋白参与转录、复制
与转录、转录调控功能的可能性分别为０．２８３、
０．３３５、０．２９９,远高于其他功能;另外其信号转导功
能的可能性为０．０６４,这些数据能为GrWRKY５的
后续研究提供参考.
２．２．６植物过表达载体的构建　将检测正确的入门
载体 pENTRTM２BＧGrWRKY５ 和目的载体 pK２
GW７进行LR反应,获得植物表达载体pK２Ｇ３５SＧ
GrWRKY５.使用EcoRI和XhoI双酶切pK２Ｇ３５SＧ
GrWRKY５重组质粒,可以切出约５９１bp的片段
(图７),表明LR反应成功;该重组质粒的测序结果
显示,GrWRKY５未发生突变现象,且与原序列保
持一致,表明该植物表达载体连接正确.
图７　pK２Ｇ３５SＧGrWRKY５ 的酶切检测 　 M．DNA
MarkerⅢ;泳道１Ｇ３．重组质粒pK２Ｇ３５SＧGrWRKY５EcoRI和
XhoI双酶切、XhoI单酶切产物和质粒对照.
Fig．７　DetectionofpK２Ｇ３５SＧGrWRKY５bydigestions　
M．DNAMarkerⅢ;Lane１Ｇ３．ProductsofrecombinantplasmidpK２Ｇ
３５SＧGrWRKY５digestedbyEcoRIandXhoI,XhoIandplasmidconＧ
trol,separately．
３　讨论与结论
WRKY在生物和非生物防御、植物生长发育以
及次生代谢物合成中起到重要作用,也是萜类合成
中的重要转录因子.克隆WRKY 基因的方法有
cDNA差异显示法、同源克隆法以及分析EST数据
库.根据基因预测设计特异性引物,直接从基因组
文库或cDNA文库中扩增WRKY 基因,例如TailＧ
PCR、RACE等.本研究采用RTＧPCR技术成功扩
增到滇龙胆GrWRKY５基因完整的cDNA序列,并
６４７ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３５卷
对其进行分析.序列分析表明GrWRKY５全长５９１
bp,编码１９６个氨基酸,含有一个 WRKY保守结构
域,属于 WRKY家族的Ⅱe类.BLASTn分析显
示,GrWRKY５的同源蛋白很多,但相似性不是很
高,多重比对分析结果显示GrWRKY５蛋白与其他
植物 WRKY蛋白在 WRKYGQK区域高度保守.
系统进化分析显示GrWRKY５与AtWRKY２７亲缘
关系较近,但GrWRKY５是否与 AtWRKY２７具有
类似的功能仍需通过遗传转化等试验进一步验证.
目前最常用的两种植物遗传转化方法是基因枪
法和农杆菌介导的遗传转化法.提高植物遗传转化
效率的重要基础是高效载体的优化和开发,而RNA
干扰载体和植物过表达载体是目前通过遗传转化研
究植物基因功能的主要工具.Gateway技术是由
Invitrogen公司开发的一项基于λＧ噬菌体特异位点
重组特性的通用克隆技术,该技术借助特异性重组
位点,在将目的基因批量连接到受体载体的同时,有
效地将传统载体构建过程中需多次酶切、连接等繁
琐操作以及受酶切位点限制等缺点成功克服,现已
被广泛应用于基因克隆和植物表达载体构建(毕惠
惠等,２０１３).目前,国内外学者在玉米、水稻、小麦
等植物中已经建立较成熟的基因枪和农杆菌介导的
遗传转化体系,但在滇龙胆中仍未涉及.本研究利
用Gateway技术并结合传统酶切、连接方法,构建
了适用于植物农杆菌介导和基因枪法的植物过表达
载体pK２Ｇ３５SＧGrWRKY５,该载体的成功构建为滇
龙胆GrWRKY５基因功能的进一步研究奠定基础,
也为 WRKY的深入研究提供参考.
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７４７５期　　　　　　　　王彩云等:滇龙胆GrWRKY５基因的克隆和植物表达载体构建