全 文 ：进口油菜籽中十字花科小球腔菌检测方法概述
吴翠萍 1　陈贯源 2　李 彬 1　粟 寒1　郑斯竹1　季健清 1　吴新华 1　安榆林 1
(1.江苏出入境检验检疫局　江苏南京　210001;2.南京林业大学)
收稿日期:2009-08-20, 2009-11-25修回
　　摘要　十字花科小球腔菌(Leptosphaeriamaculans)是影响油菜生产的重要病原真菌 ,主要分布在加拿
大 、澳大利亚 、美国等油菜主产区。我国尚无此病原危害的报道。该病原通过带菌种子作远距离传播传入
新发病区 ,加强该病原菌的检测是防范该有害生物传入的重要手段。本文对该病原菌的现有检测鉴定方
法进行了综述 ,为口岸部门开展该病原菌的检测以及制定相应检测方法标准提供借鉴 。
关键词　油菜籽;十字花科小球腔菌;检测方法
中图分类号　S435.654, S41-30
　　十字花科小球腔菌 (Leptosphaeriamaculans),
又称油菜茎溃疡或油菜黑胫病 ,是世界范围内广泛
存在的一种真菌性病害 ,寄主范围广泛 ,主要是一
些十字花科的作物 ,如油菜 ,甘蓝 ,大白菜等 ,它可
造成幼苗的死亡 ,倒伏或者植株的早衰 。迄今为
止 ,世界上大部分国家都有分布 ,严重危害着大田
作物油菜籽的产量 ,尤其是在澳大利亚 、欧洲及北
美等世界主要的油菜产区 ,每年由于该病原菌造成
的损失超过 9亿美元 [ 1] 。我国目前尚无该病原菌
的分布 ,是我国进境植物检疫性有害生物 。
中国是油料作物产品进口大国 ,近几年油菜籽
进口量居世界第一 ,该病菌有可能随带菌种子进口
而传入我国 。从病菌的远距离传播来看 ,种子是该
病原菌传入新发生区的重要途径 [ 2] 。种子的带菌
率通常为 0.1% ～ 5%,由此导致田间植株发病率为
0.1% ～ 19%,换算成种传发病率为 100% ～ 380%,
可见带菌种子传入该病原菌的风险很大 [ 3] 。但是
我国每年需要引进大量油菜籽来满足国内市场的
需求 ,进口份额达到了近 60%,可以说我国正面临
着该病原菌入侵和传入的前所未有的考验 。因而 ,
确保该病原菌从油菜籽中准确检出 ,以此与进口国
商谈 、交涉有关进口条件 ,是避免该病原菌传入 、保
护国内油菜籽产业安全的唯一途径。为此 ,本文就
目前从油菜籽中检测该病菌的检测方法进行综述。
1　病原
油菜黑胫病的致病菌为小球腔菌属(Leptospha-
eria)的真菌复合种 [ 1, 2 ～ 4] ,包括 2个不同的种 L.
maculans和 L.biglobosa,其中 L.maculans致病力
强 ,造成的损失大 ,在我国没有分布 ,而在其他油菜
主产国有分布 ,习惯上又称为 A型种或强致病力
种;L.biglobosa致病力弱 ,造成的损失小 ,在我国有
分布 ,习惯上又称为 B型种或弱致病力种 。这两种
菌无性世代属于茎点霉属(Phomaspp.),至于两种
是否是同一个种尚未得到确认 [ 5] 。因而 ,对于该病
原菌的准确鉴定 ,最关键是区分两种病原菌 。
2　检测方法
文献资料表明 ,根据 A型种与 B型种在寄主上
引起的症状 、培养特性 、分生孢子萌发产生芽管的
长度 、同工酶谱分析 、次级代谢产物分析 、血清学方
法 、分子生物学方法 (核型 、RFLP、RAPD、REP-
PCR、特异性引物 PCR、SCAR标记 、ITS序列)等方
法能够将两型区分开 [ 6] 。但是 ,从适合口岸简便 、
准确 、快速 、灵敏的检测要求的角度 ,培养特性的差
异以及特异性引物 PCR检测方法是行之有效的区
分方法。
2.1　培养性状的差异
L.maculans和 L.biglobosa两种菌的有性阶段
一般是在油菜植株的残体上产生 ,在培养条件下只
产生形态特征基本相同的无性阶段的分生孢子器
和分生孢子。
关于该两种菌的培养特性区别主要在于在标
准化的培养条件下(培养基类型与成份 、时间 、光
照),菌株的生长速度 、气生菌丝疏密程度 、菌落边
缘光滑与否 、产生色素与否 、产孢能力 、培养基质
pH值的变化等的差异。其中 A型种生长慢 、气生
菌丝灰白且紧密 、菌落边缘不光滑 、不产生色素与
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液滴 、产孢量大 、培养过程中降低基质 pH值 ,而 B
型生长快 、气生菌丝白色且松散 、菌落圆形且边缘
光滑 、产生桔色至棕色的色素与小液滴 、产孢量少 、
培养过程中引起基质 pH值升高[ 6, 7] 。
采用培养特性的差异区分这两种菌的关键是如
何从感病组织中分离获得纯培养物。针对油菜籽中
病原菌的成功分离 ,学者们做了大量研究工作。国
际种子检测协会所推荐的吸水纸保湿培养法是通用
的方法[ 8] :在直径为 9cm培养皿内 ,铺 2层灭菌湿润
滤纸 ,其上均匀放上 25粒油菜籽 , 20℃黑暗条件下培
养 1d,将培养皿放入 -20℃冰箱中 1d(以阻止种子
发芽),然后再在 20℃条件下 ,将种子进行 12h紫外
/12h黑暗交替处理培养 10d,观察茎点霉属(Phoma)
产生情况 ,最后采用常规方法进行分离纯化。汪国
平等 [ 9] (2003)采用这一方法 ,发现从源于英国和波
兰的油菜籽中检测茎点霉(Phoma)分离率较低 ,仅
为 0.47% ～ 0.85%,为此 ,他们对该方法进行改进 ,
油菜籽在未培养前先用 1%NaClO清毒 10min,再
用无菌水漂洗后按上述步骤处理 ,结果茎点霉种子
分离率达到了 1.21% ～ 1.98%,分离率至少提高了
1倍 ,说明了种子上茎点霉可能被其它杂菌所隐
藏 , 1%NaClO可有效地去除杂菌 ,从而提高种子中
病原菌的分离率 。
可以看出 ,采用病原菌培养特性的差异来区分
A型种与 B型种 ,其优点是所需试剂和仪器比较普
遍 ,对人员的技术能力要求不高 ,易于在口岸推广 ,
也能保证检测准确可靠。但该方法也有其局限性 ,
其一检测周期很长 ,病原菌分离约需 15d,病原菌产
生色素至少需要 20d,因而 ,整个鉴定过程至少需要
35d;其二 ,由于此方法采用培养皿中放置吸水纸保
湿培养 ,每个培养皿中所放种子有限 ,仅为 25粒 ,
且长出病原菌后 ,涉及很多生存菌株的分离纯化问
题 ,因而该方法不适合于大批量样品的检测。
2.2　PCR方法
基于 PCR的分子生物学方法能有效地解决上
述缺点 。在检测中样品 DNA提取的关键步骤是病
原菌增殖 ,同时 ,实现病原菌的增殖过程中也可进
行大量样品的检测。
2.2.1　DNA的提取
针对油菜籽病原菌的增殖 , Taylor[ 10] (1993)研
究出一种简单易行的方法 , 2g种子(约 1000粒)在
1%NaClO中消毒 15min,无菌水漂洗后 ,加入 50mL
查氏基本培养液中 ,在 26±2℃振荡培养 72h,用 2
层无菌纱布过滤除去种子 , 2500G离心 10min,沉淀
用无菌水洗涤 2次 ,转移至离心管中 ,真空低温干
燥过夜 ,接着采用 SDS法提取 DNA。在此步骤中 ,
振荡培养时间以及培养液的类型很重要 ,以 48h替
代 72h培养及马铃薯葡萄糖肉汤培养液替代查氏
基本培养液的病菌增殖效果均不好 。在 SDS法的
DNA提取过程中 , 发现在最初沉淀 DNA时以
CTAB替代 100%的酒精扩增效果更佳。 George
等[ 11] (1996)研究出病残体上的假囊壳 、种子中
DNA最佳的提取方法:将含假囊壳的病残体用 1%
NaClO消毒 2min,无菌水漂洗后晾干 , 在 pH8.0
Tris溶液中煮沸 20min,即获得了扩增模板;2000粒
种子在滤纸上进行冷冻培养 ,产生分生孢子后于
pH8.0的 Tris溶液中煮沸 20min,即获得扩增模板。
2.2.2　PCR引物
对于区分 A型种与 B型种的 PCR引物方面 ,
国内外学者也做了许多探索 。Taylor[ 10] (1993)根
据 A型种内存在一段特有的长度为 5238bp的中度
重复序列(而此序列在 B型种中是不存在的)设计
了代号为 A至 E的 5对引物 ,验证结果表明 D引
物不仅有很好的特异性 ,而且有较高的扩增效率 ,
其对菌丝 DNA的检测灵敏度能达到 100fg,而油菜
籽样品的检测灵敏度为 2粒带菌籽粒 /1000粒(带
菌率 0.2%),而当油菜种子带菌率在 1% ～ 2%时 ,
检出的成功率可达 96%。
Mahuku等(1995)设计出 A型种特异性引物
HV17S/HV26C[ 12] , Xue等(1992)设计出了 B型种
的特异性引物 WV17S/5.8S[ 13] , 这 2对引物被
George等(1996)应用于安大略湖油菜田块 A型种
和 B型种分布调查 [ 11] 。Liu等 [ 14] (2006)根据 A型
种和 B型种 ITS区差异 ,设计了分别能检出 2种病
原菌的特异性引物 ,该引物的特异性所用到的对照
菌株则是从油菜上经常分离得到的病菌 , 如
Pyrenopezizabrasicae, Alternariabrasicae, A.bras-
sicicola, Peronosporaparasitica, Plasmodiophorabras-
sicae, Botrytiscinerea, Sclerotiniasclerotiorum, Verti-
ciliumlongisporum。结果显示 ,用于 A型种的特异
引物可扩增出 331bp的产物 ,而用于 B型种的特异
引物可扩增出 444bp的产物 。刘泽等 [ 7] (2008)利
用此方法对 2005 ～ 2007年我国一些油菜产区获得
的油菜黑胫病害感染的植株 ,进行分离鉴定 ,结果
显示分离到的菌株均为弱侵染性的 B型种 ,而尚未
获得强侵染性的菌种 A型种。
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3　讨论
上述基于培养性状差异的区分方法以及 PCR
检测方法的思路和流程容易理解 ,并且也不需特殊
的设备和专门的技术 ,因而容易被口岸检疫部门采
纳和接受。但这些方法均不是专门针对收获后油
菜籽样品的检测 ,其关键点和细节不易把握 ,如对
培养时间 、培养基类型 、光照等条件的掌握和控制
还不清楚 ,易使检测结果偏离客观情况 ,进而造成
漏检可能性发生 。因而 ,当务之急是要将这些方法
在口岸进行改进并充分验证 ,便于在口岸检测工作
中应用推广 ,逐步形成相应的检测标准或规范 。
目前 ,我国大批进口的油菜籽大都是来自该病
原菌的疫区 ,如加拿大 、澳大利亚 、美国等。因而 ,
口岸检疫部门需要加强油菜籽中十字花科小球腔
菌的检测。此外 ,我国各口岸每年还从美国 、日本 、
欧洲等疫区国引进大白菜 、甘蓝等该病原菌的寄主
种子用于种植 ,以江苏口岸为例 ,作为日本花卉 、蔬
菜种子的对外繁殖基地 ,仅甘蓝种子的引进量就达
100多 kg,由于病原菌带菌率和种传发病率均很
高 ,因而 ,此类种子相比非种用的油菜籽而言 ,传病
风险更大。近来 ,江苏口岸运用 PCR方法首次从
加拿大输华油菜籽中检出十字花科小球腔菌(L.
maculans),并连续检测出 5批次 ,病原菌的检出率
达到近 80%。为此 ,江苏口岸管理部门将此情况上
报我国政府检疫管理部门 ,我国政府部门高度重
视 ,立即通报加方并告之即将采取一系列紧急检疫
措施 ,以最大程度降低病原菌随加拿大输华油菜籽
传入的可能 。因此 ,我国口岸检疫部门应加强对加
拿大油菜籽的检测。
日常检疫工作中 ,进口油菜籽携带了大量的秸
杆 、种荚等病残体 。病残体是该病原菌最主要的越
冬场所 ,也是形成病害侵染 、传播与大流行的最最
重要的途径 ,如果油菜籽在生产加工过程中监管不
到位 ,就容易造成病残体的撒漏 ,给病原菌的入侵
带来了大量的机会 ,因而 ,口岸检疫部门应进一步
加强病残体存放区及无害化处理流程的监管 ,严防
外流。
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