全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Sept．２０１４,３４(５):６０８－６１３　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０５．００６
王运华,李楠,陈庭,等．种间转移扩增筛选仙湖苏铁微卫星位点及其遗传多样性研究[J]．广西植物,２０１４,３４(５):６０８－６１３
WangYH,LiN,ChenT,etal．ScreeningofmicrosatelitelocibycrossＧspeciesamplificationandtheiruseinCycasfairylakea(Cycadaceae)[J]．Guihaia,
２０１４,３４(５):６０８－６１３
种间转移扩增筛选仙湖苏铁微卫星
位点及其遗传多样性研究
王运华,李　楠,陈　庭,邓焕祥
(深圳市中国科学院仙湖植物园 深圳市南亚热带植物多样性重点实验室,广东 深圳５１８００４)
摘　要:运用刺叶苏铁、葫芦苏铁、海南苏铁的SSR引物,在仙湖苏铁中进行种间转移扩增,筛选得到７对引
物能扩增出清晰的特异带,其中３对引物的扩增产物具有多态性.为验证微卫星的真实性,扩增产物切胶回
收后克隆测序.结果表明:重复单元的数目变化是扩增片段长度多态性的主要来源.运用筛选出的３对SSR
标记对４个仙湖苏铁野生种群进行遗传结构研究,等位基因数从２~５,杂合度从０．０００~０．６６７,期望杂合度为
０．０００~０．６１０.种群两两遗传分化系数从０~０．３８２.总体上仙湖苏铁遗传多样性水平低,而种群间遗传分化
显著.STRUCTURE分析结果表明,４个野生种群可被分配到３个假想的遗传簇.BOTTLENECK分析结
果表明种群近期没有遭遇瓶颈效应.
关键词:仙湖苏铁;微卫星;种间转移扩增;遗传多样性
中图分类号:Q９４９．６２　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０５Ｇ０６０８Ｇ０６
ScreeningofmicrosatelitelocibycrossＧspecies
amplificationandtheiruseinCycas
fairylakea(Cycadaceae)
WANGYunＧHua,LINan,CHENTing,DENGHuanＧXiang
(ShenzhenKeyLaboratoryofSouthernSubtropicalPlantDiversity,FairylakeBotanical
Garden,Shenzhen&ChineseAcademyofSciences,Shenzhen５１８００４,China)
Abstract:Simplesequencerepeat(SSR)markersdevelopedfromCycasrumphi,C．changjiangensisandC．hainＧ
anensiswerecrossＧspeciesamplifiedingenomicleafDNAofC．fairylakea．ThepositivePCRproductionswere
clonedandsequenced．Sevenlociconsistentlyyieldedthepredictedsizeranges．Oftheseloci,threewerepolymorphic
andconfirmedassimplesequencerepeat(SSR)lociinC．fairylakea．TheywereutilizedtoinvestigatethegeneticdiＧ
versityamongfourwildpopulationsofC．fairylakea．Thenumberofalelesperlocusrangedfrom２to５,andthe
observedandexpectedheterozygositiesvariedfrom０．０００to０．６６７andfrom０．０００to０．６１０,respectively．PairwiseFst
variedfrom０to０．３８２．Inthewhole,C．fairylakeahaslowlevelsofgeneticvariationwithinpopulationsandhigh
variationacrosspopulations．TheSTRUCTUREanalysisindicatedthatthefourC．fairylakeapopulationscouldbe
subdividedintothreediferenthypotheticalgeneticclusters(K)．TheBOTTLENECKresultssuggestedthatnopopuＧ
lationshadfacedrecentsignificantbottleneck．
Keywords:Cycasfairylakea;microsatelite;crossＧspeciesamplification;geneticdiversity
收稿日期:２０１３Ｇ１０Ｇ１５　　出版日期:２０１４Ｇ０８Ｇ２５
基金项目:国家林业局“珍稀濒危物种野外救护与繁育”财政专项(２０１０);深圳市仙湖植物园基金(２０１２).
作者简介:王运华(１９７６Ｇ),男,湖北仙桃人,助理研究员,从事植物多样性研究,(EＧmail)７６wasir＠１６３．com.
　　苏铁类植物是现存最古老的种子植物,全世界
现存苏铁类植物有３科(苏铁科、蕨叶铁科与泽米
科)１１属约３００种(Norstogetal．,１９９７),星散分布
于热带与亚热带地区.我国仅有苏铁属分布,共有
２３种(陈家瑞等,２０１１),全部列入国家重点保护野
生植物名录.仙湖苏铁(Cycasfairylakea)是国家
一级濒危保护植物,目前仅在我国广东省和福建省
发现有自然分布,个体数在４０００株以下.除广东
省深圳市的两个种群外,其余种群野生个体总数均
不足２０株(王定跃,１９９６;简曙光等,２００５a).
微卫星分子标记(也称简单重复序列,Simple
SequenceRepeat,SSR)具有分布广泛、多样性高、共
显性、可转移性等特点,已被广泛用于物种的遗传多
样性研究(Poweletal．,１９９６).目前,在刺叶苏铁
(Cycasrumphii)(CibriánＧJaramiloetal．,２００８)、
葫芦苏铁(C．changjiangensis)(Lietal．,２００９)和
海南苏铁(C．hainanensis)(Zhangetal．,２００９)等
多种苏铁中已成功开发了SSR分子标记.SSR引
物在亲缘关系较近的不同物种间具有一定通用性,
将这些已成功开发的SSR分子标记运用到同属的
仙湖苏铁中,可充分利用现有资源、减少引物开发成
本.本文采用种间引物转移扩增方法,从亲缘物种
的SSR引物中筛选仙湖苏铁微卫星位点,并运用其
进行种群遗传结构研究,以期对仙湖苏铁种群恢复
和保护策略的制定提供遗传多样性方面的参考.
１　材料与方法
１．１材料
从广东省的梅林水库(ML)、塘朗山(TLS)、曲
江县罗坑水库(LK)和福建省马坑(MK)４个仙湖苏
铁自然种群中采集１１５份个体植株的新鲜叶片.梅
林水库的样品包括３４份１~２年生幼苗,其余样品
均为成年个体植株且均匀分布在种群中,每个个体
采集３~５个羽片,用硅胶干燥保存.
１．２DNA提取与引物筛选
用CTAB法提取叶片总 DNA(Doyle,１９９１).
选取４个仙湖苏铁DNA样品(来自４个不同的野
生种群),用刺叶苏铁(CibriánＧJaramiloetal．,
２００８)、葫芦苏铁 (Lietal．,２００９)和海南苏铁
(Zhangetal．,２００９)的SSR引物序列,在仙湖苏铁
中进行种间转移PCR扩增.引物由上海生工合成,
引物序列来自引用文献.PCR反应体系为２０μL,
含有３０ngDNA,２．０μL１０×buffer(含２０mmol􀅰
LＧ１Mg２＋),１．０μL(１０mmol􀅰LＧ１)dNTP,上下游
引物各２．０μL(２．０μmol􀅰LＧ１),１．０μL(２U)Taq酶
(Takara),ddH２O补齐.PCR反应程序为９４℃变
性５min;随后９４℃变性４０s,４５~６０℃退火３０s
(退火温度因引物而定),７２℃延伸３０s,循环３５
次;最后７２℃延伸１０min,４℃保存.PCR扩增产
物在３％的琼脂糖凝胶上进行电泳,紫外灯下检测.
对于成功扩增出目的条带的样品,在８％聚丙烯酰
胺凝胶上电泳,采用快速银染法检测.
１．３SSR分型与真实性验证
对于成功扩增的SSR引物,用６ＧFAM(羧基荧
光素)荧光标记SSR引物(上海生工),在１１５份仙
湖苏铁DNA样品中进行PCR扩增,反应体系和程
序采用上文的方案,PCR扩增产物用 ABI３７３０XL
进行毛细管检测分型(华大基因),分型结果运用
GeneMarkerv１．９０(SoftGeneticsLLC)软件分析.
为了验证SSR位点的真实性,将PCR扩增产
物进行TA克隆并测序分析,各位点扩增的不同大
小片段至少选取一个进行克隆测序.PCR扩增产
物用２％琼脂糖凝胶在１×TAE缓冲液中电泳后,
用切胶纯化试剂盒纯化(北京天根),将纯化后的片
段连接到Pmd１９ＧT载体系统中(Takara),随机挑选
２~３个克隆,用质粒小抽试剂盒纯化(Takara).纯
化后的质粒用 M１３ 通用引物 (M１３RV:CAGＧ
GAAACAGCTATGAC, M１３M４: GTTTTCＧ
CCAGTCACGAC)进行PCR鉴定,用ABI３７１０自
动测序仪双向测序(上海立菲生物).DNA序列运
用BioEdit７．０软件的ClustalX进行人工比对.
１．４数据分析
１．４．１遗传多样性指数　用GenAlExv６软件计算
每个种群各位点的等位基因数目(Na)、杂合度
(Ho)、期望杂合度(He),以及固定系数(F),并检
测哈温平衡(Peakaletal．,２００６).
１．４．２种群遗传结构　采用GenAlExv６软件计算
pairwiseFst,得出群体两两之间的遗传分化系数.
假定有K个(未知)遗传群体,样本个体被随机指派
到群体中,如果某些个体的基因型显示他们是混合
的情况,而且他们甚至加入到两个或多个群体中,通
过对不同K值下概率的对数值进行比较,即可确定
最佳的K值.用这种方法可以解释现有群体结构,
识别独特的遗传群体,将个体指派到群体中,鉴定迁
移者和混合的个体.采用STRUCTURE２．３．４软
９０６５期　　　　　 王运华等:种间转移扩增筛选仙湖苏铁微卫星位点及其遗传多样性研究
图１　微卫星位点CY２３８(A)、CY２６６(B)、HL０８(C)的DNA序列比对　第一行数字表示一致序列的碱基位点.黄色标示区域为
微卫星的重复区,括号内的核酸为重复单元,下标为重复数.红色标示处为单个的碱基突变,绿色标示区域为存在插入或缺失的位点.
Fig．１　AlignmentofasubsetofDNAfragmentsatsimplesequencerepeat(SSR)lociCY２３８(A),CY２６６(B)andHL０８(C)　
Numbersinthetoplineindicatepositionsrelativetotheconsensussequences．BoldnucleotidesinbracketsindicateSSRmotifsandtheirnumberofrepeats．
Dashesindicategaps,highlightednucleotidesinredmarkmutationsfromonebasetoanother,greenboxindicategroupsofinsertionordeletions．
表１　仙湖苏铁中筛选的微卫星位点
Table１　CharacteristicsofmicrosatelitelociinCycasfairylakea
微卫星位点
Locus
引物序列(５′Ｇ３′)
Primersequence(５′Ｇ３′)
重复单元
Repeatmotif
退火温度
T(℃)
等位基因大小
Alelerange
等位基因数
Na
CY２３８ F:TGCCCATTGATTTTGGTTTT (GA)n ５５~５３ ２１７~２１９ ２
R:AAATTTGCTGATTCGGCTTC
CY２６６ F:AAATGCTTTGATGTTCCCAAA (AT)n ５６~５４ ２３６~２５３ ５
R:ATGCAATGCTCAACAAGCTG
HL０８ F:AAAACATTCCTTGCCCTGT (TCT)n ５５~５３ ２１８~２３９ ５
R:GGAGCCTGTTGAAGAGCTA
件推算种群的遗传结构.设定K值从２~７,参数设
为１０００００burnＧinsteps和１０００００MCMCsimulaＧ
tionsteps,其它参数选择默认设置.
在经历了瓶颈的种群中,有效种群大小下降,根
据种群内等位基因频率推算得来的期望杂合度也会
相应减少,但等位基因数的降低比杂合度更快,从而
使得杂合度比期望杂合度大,即杂合子过量,反之为
杂合子不足.采用BOTTLENECK１．２．０２测试群
体中最近是否遭遇瓶颈效应.选择适合SSR位点
的SMM(StepwiseMutationModel)和TPM(TwoＧ
０１６ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
PhaseModel)两种突变模型进行分析,结果采用
Wilcoxon和SIGN两种方法进行显著性检测.
２　结果与分析
筛选７对能清晰扩增出目的大小的特异性条带
引物.分别来自葫芦苏铁的 HL０８、海南苏铁的
Ch０５、刺叶苏铁的CY２３８,CY２４０,CY２６６,CY２７０,
CY２８４.其中引物CY２３８、CY２６６、HL０８在仙湖苏
铁１１５个样品DNA中扩增出多态性条带,大小在
２１７~２５３bp之间,另外４对引物只呈现单态性(表
１).对３个多态性位点的各类等位基因的测序结果
证实了 GA,AT,TCT简单重复序列的存在,同时
还得到了SSR位点的侧翼序列以及存在的单核苷
酸多态性(SingleNucleotidePolymorphism,SNP)
和插入缺失(Indel)位点,但重复单元的数目变化是
扩增片段长度多态性的主要来源(图１).结果表明
新筛选的３个多态性SSR位点可用于仙湖苏铁遗
传多样性研究.
１１５个样品在CY２３８、CY２６６、HL０８位点上的
等位基因数分别为２、５、５,杂合度从０．０００~０．６６７,
期望杂合度为０．０００~０．６１０.４个野生种群中梅林
(ML)、塘朗山(TLS)的多样性最高,包含平均等位
基因个数分别为３．６６７和３．３３３.罗坑(LK)和马坑
(MK)种群多样性最低,平均等位基因个数均为
１．６６７.４个种群中３个位点的哈温平衡检测结果表
明,CY２３８位点因缺乏杂合度而偏离哈温平衡,LK
种群的 HL０８和CY２６６位点因杂合度过剩而偏离
哈温平衡.偏离哈温平衡说明种群内存在非随机交
配现象.固定系数说明 ML(F＝０．２６８)、TLS(F＝
０．１３３)两种群存在中等至较高水平的近亲繁殖,LK
和MK种群过度杂合.遗传多样性分析结果见表２.
种群两两间遗传分化系数,即PairwiseFst的
大小从０~０．３８２之间.结果说明仙湖苏铁种群之
间已显著分化,即使是地理距离相对较近的 ML和
TLS种群也有显著的遗传分化.ML与TLS种群
间遗传分化相对最小(Fst＝０．１９９,P＝０．０１０),而与
LK和 MK 种群的分化大,遗传分化系数分别为
０．３８２(P＝０．０１０)和０．３６１(P＝０．０１０),TLS种群与
LK和 MK种群也有显著分化,遗传分化系数分别
０．２３８(P＝０．０１０)和０．２０８(P＝０．０１０).LK和 MK
种群间的遗传分化系数为０(P＝０．３２０),P＞０．０５
结果不显著(表３).
表２　仙湖苏铁四个野生种群的遗传多样性分析
Table２　Geneticdiversitywithinpopulationsof
Cycasfairylakeausingthe３newlydeveloped
polymorphicmicrosatelitemarkers
种群
Population
微卫星
位点
Locus
样本数
N
等位
基因数
Na
杂合度
Ho
期望
杂合度
He
固定系数
F
梅林 HL０８ ７５ ５．０００ ０．５３３ ０．６１０ ０．１２６
ML CY２６６ ７５ ４．０００ ０．６５３ ０．５５０ Ｇ０．１８９
∗CY２３８ ７５ ２．０００ ０．０６７ ０．４９４ ０．８６５
Mean ７５．０００ ３．６６７ ０．４１８ ０．５５１ ０．２６８
SE ０．０００ ０．８８２ ０．１７９ ０．０３４ ０．３１２
塘朗山 HL０８ ２０ ４．０００ ０．６００ ０．５８０ Ｇ０．０３４
TLS CY２６６ ２０ ４．０００ ０．６５０ ０．５５４ Ｇ０．１７４
∗CY２３８ ２０ ２．０００ ０．１００ ０．２５５ ０．６０８
Mean ２０．０００ ３．３３３ ０．４５０ ０．４６３ ０．１３３
SE ０．０００ ０．６６７ ０．１７６ ０．１０４ ０．２４１
罗坑 ∗HL０８ １４ ２．０００ １．０００ ０．５００ Ｇ１．０００
LK ∗CY２６６ １４ ２．０００ １．０００ ０．５００ Ｇ１．０００
∗CY２３８ １４ １．０００ ０．０００ ０．０００ Monomorphic
Mean １４．０００ １．６６７ ０．６６７ ０．３３３ Ｇ１．０００
SE ０．０００ ０．３３３ ０．３３３ ０．１６７ ０．０００
马坑 HL０８ ６ ２．０００ １．０００ ０．５００ Ｇ１．０００
MK CY２６６ ６ ２．０００ １．０００ ０．５００ Ｇ１．０００
∗CY２３８ ６ １．０００ ０．０００ ０．０００ Monomorphic
Mean ６．０００ １．６６７ ０．６６７ ０．３３３ Ｇ１．０００
SE ０．０００ ０．３３３ ０．３３３ ０．１６７ ０．０００
总计
Total Mean ２８．７５０ ２．５８３ ０．５５０ ０．４２０ Ｇ０．２８０
SE ８．１８９ ０．３７９ ０．１１９ ０．０６２ ０．２０２
　注:∗显著偏离哈温平衡(P＜０．０１);SE．标准误差.
　Note:∗SignificantdeparturefromHardyＧWeinbergEquilibrium(P＜０．０１);SE．
standarderror．
表３　种群间Fst的两两比对
Table３　PairwisepopulationFstvalues
梅林
ML
塘朗山
TLS
罗坑
LK
马坑
MK
梅林 ML ０．０００ ０．０１０ ０．０１０ ０．０１０
塘朗山 TLS ０．１９９ ０．０００ ０．０１０ ０．０１０
罗坑LK ０．３８２ ０．２３８ ０．０００ ０．３２０
马坑 MK ０．３６１ ０．２０８ ０．０００ ０．０００
　Fst值位于对角线下方,相应的置信度 (P 值)在对角线上方.
　FstValuesbelowdiagonal．Probabilityvaluesbasedon９９permutationsare
shownabovediagonal．
STRUCTURE分析结果表明,４个仙湖苏铁野生种
群可被分配到３个假想的遗传簇(K).从K值概率
折线图可看到,当K＝３时,概率的对数值(LnP)达
到最大值(图２).４个自然种群的１１５个样本按照
一定的概率被指派到３个遗传簇中,ML种群大部
分被指派到１簇(Q＝０．５４),TLS种群大部分被指
派到２簇(Q＝０．５３１),LK、MK种群被指派到３簇
(Q＝０．９７)(表４).
利用BOTTLENECK 软件,在两个演化模式
(SMM 与TPM)下进行分析,结果显示在 WilcoxＧ
on’ssignrank和SIGN检验下,ML、TLS、LK３个
种群均未出现显著的杂合过度与杂合不足,说明３
１１６５期　　　　　 王运华等:种间转移扩增筛选仙湖苏铁微卫星位点及其遗传多样性研究
个种群近期没有遭遇瓶颈效应.MK种群因样本数
少于１０,未做BOTTLENECK检测.
图２　STRUCTURE软件分析的K值
(K＝２~７)概率 (LnP)折线图
Fig．２　LogＧlikelihoodprobabilityLnP (D)ofthenumber
ofinferredclusters(K)asafunctionofKusing
STRUCTURE,forK＝２to７
表４　４个仙湖苏铁野生种群分配到３个假想的
遗传簇的关联样本概率 (Q)
Table４　Estimatedmembershipprobabilities(Q)
of４populationsinto３hypotheticalclusters
种群
Pop
假想的遗传簇GivenInferredclusters
１ ２ ３
个体数
No．of
individuals
ML ０．５４７ ０．４０１ ０．０５２ ７５
TLS ０．１２ ０．５３１ ０．３４９ ２０
LK ０．０１ ０．０２ ０．９７ １４
MK ０．０１ ０．０２ ０．９７ ６
　注:每个种群的概率最高值用粗体标示.
　Note:Thehighestvalueofmembershipprobability(Q)ofeachpopulationis
inbold．
３　讨论与结论
３．１苏铁SSR引物在种间转移扩增的可行性
CibriánＧJaramilo等(２００８,２０１０)从刺叶苏铁
中开发SSR引物,部分引物在C．micronesica,C．
curranii,C．edentata,海南苏铁和C．wadei等多
种苏铁中成功扩增出目的条带,并从中筛选到１４对
通用性好的SSR引物,对关岛上的C．micronesica
开展遗传多样性研究,阐明２４个野生种群间的遗传
连通性.Yang等(２００８)在德保苏铁(C．debaoenＧ
sis)中开发的SSR引物大多在同属的其它４种苏铁
(C．micholitzii,C．multipinnata,C．guizhouenＧ
sis,C．hongheensis)中成功扩增.Ju等(２０１１)在台
东苏铁(C．taitungensis)中开发的SSR引物大多也
在苏铁(C．revoluta)和德保苏铁中成功扩增.这些
结果表明,利用DNA的保守性及同源性筛选合适
的SSR标记,将苏铁属植物中已知的SSR标记直
接运用到同属不同物种中,继而进行相关遗传多样
性研究是可行的.需要注意的是,运用SSR标记进
行遗传多样性研究,是建立在简单重复序列突变基
础上的.在种间转移扩增中出现的阳性扩增产物,
必须检验真实性,确认其多态性来源于微卫星的突
变.扩增的假阳性条带不适合进行建立在微卫星突
变基础上的遗传研究(Liuetal．,２００７).
３．２仙湖苏铁的遗传多样性与遗传分化
仙湖苏铁野生种群具有中等及以上水平的近亲
繁殖,种群内多样性低,种群间的遗传分化显著.这
一结果与其他苏铁类植物多样性研究类似.如贵州
苏铁(肖龙骞等,２００３)、德保苏铁(Xieetal．,２００５)
(Yangetal．,２００８)、台东苏铁(Juetal．,２０１１)、篦
齿苏铁(Yangetal．,１９９６)、苏铁(Kyodaetal．,
２０１０)等.主要原因在于:小种群导致了遗传漂变和
近亲繁殖.目前发现的仙湖苏铁野生种群中,除塘
朗山、梅林两个种群外,其余种群个体均在２０株以
下(简曙光等,２００５a);种子散布和传粉机制使基因
交流受阻.苏铁植物主要依靠一、两种昆虫进行虫
媒传粉,种子一般较大,主要依靠重力和啮齿类动物
散布,基因流的有效距离为２~７km (Huanget
al．,２００４),再加上仙湖苏铁种群分布区域狭窄,呈
间断不连续的岛屿状(简曙光等,２００５a),种群间的
基因交流十分有限.生境特点和土壤条件的差异也
是种群产生遗传分化的动力.塘朗山、梅林种群位
于稀疏常绿阔叶林下,郁闭度适中,环境潮湿,枯枝
落叶层厚(汪殿蓓等,２００３).罗坑种群位于稀疏针
叶林下,郁闭度较小,土壤为砖红性红壤,落叶层薄
(简曙光等,２００５b).这种差异使得种群为适应各
自的生境而形成较大的遗传分化.
３．３保护策略
由于人为因素带来的生境改变和采挖,以及自
身遗传因素的影响,仙湖苏铁个体少、生长状态差,
已处于濒危状态,除梅林种群有开花植株和一年生
小苗外,其它种群已严重老化,鲜见有性繁殖(简曙
光等,２００５a),对其制定科学的保护措施十分紧迫.
遗传多样性水平是一个物种或种群对环境的适应和
进化能力的反映.保护生物学的主要目的之一就是
保护生物的遗传多样性(Geetal．,２００３).遗传分
化分析表明仙湖苏铁种群间已发生了显著的分化,
２１６ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
种群间的遗传多样性很高,除了保护多样性较高的
种群之外,也要对那些多样性相对低的种群实施保
护(肖龙骞等,２００３),应尽可能地保护更多的种群.
在就地保护的基础上,要努力提高种群的遗传多性,
可以开展种群间的人工授粉和移苗等措施,促进基
因交流,从而提高物种的遗传多样性.
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