全 文 ：广 西 植 物 Ｇｕｉｈａｉａ Ｊａｎ．２０１３，３３（１）：８２－８８ ｈｔｔｐ：／／ｊｏｕｒｎａｌ．ｇｘｚｗ．ｇｘｉｂ．ｃｎ
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－３１４２．２０１３．０１．０１５
张哲敏，孙萍，王旺田，等．三种不同抗冻性葡萄中ＣＢＦ２基因的生物信息学分析及植物表达载体构建［Ｊ］．广西植物，２０１３，３３（１）：８２－８８
Ｚｈａｎｇ ＺＭ，Ｓｕｎ Ｐ，Ｗａｎｇ ＷＴ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣＢＦ２ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｈｉｌｉｎｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｒａｐｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ
［Ｊ］．Ｇｕｉｈａｉａ，２０１３，３３（１）：８２－８８
三种不同抗冻性葡萄中ＣＢＦ２基因的生物
信息学分析及植物表达载体构建
张哲敏，孙 萍，王旺田，栗孟飞，李 唯＊，王雅琳
（甘肃农业大学 生命科学技术学院 甘肃省干旱生境作物学重点实验室，兰州７３００７０）
摘 要：从赤霞珠、贝达和山葡萄三种不同抗冻性葡萄的基因组ＤＮＡ中分别克隆了ＣＢＦ２ 全长基因，并利用
生物信息学的方法进行了分析。结果显示：三种葡萄的ＣＢＦ２ 基因长均为９６９ｂｐ，编码２５３个氨基酸，与
ＧｅｎｅＢａｎｋ公布的的序列相比对，核苷酸相似性在９６．７％～９７．９４％之间。生物信息学分析显示３种不同抗冻
葡萄的ＣＢＦ２基因具有连续的开放阅读框，推倒的氨基酸序列具有ＡＰ２结合域，初步判断克隆的ＣＢＦ２ 具有
诱导抗寒性产生的作用。但氨基酸序列、进化树、理化性质、疏水性／亲水性等在抗寒性较强的山葡萄、贝达与
抗寒性较差的赤霞珠之间存在一些差异，与ＧｅｎＢａｎｋ上的原始序列同源性最低的是赤霞珠，而且其ＣＢＦ２Ｎ
端７个氨基酸残基序列与山葡萄和贝达的氨基酸序列存在较大差异，且具有较强的疏水性，这些差异可能与
赤霞珠较弱的抗寒特性有关。以带有３５Ｓ启动子的载体ｐＢＩ１２１为基础，成功构建了植物表达载体ｐＢＩ１２１－
ＣａＭＶ３５Ｓ－ＣＢＦ２，为深入研究ＣＢＦ２基因在葡萄抗寒性中的作用提供了基础资料。
关键词：葡萄；ＣＢＦ２转录激活因子；生物信息学分析；克隆；表达载体构建
中图分类号：Ｑ７，Ｑ９４３．２ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－３１４２（２０１３）０１－００８２－０７
＊ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣＢＦ２ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｃｈｉｌｉｎｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｒａｐｅｓ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
ｏｆ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ
ＺＨＡＮＧ Ｚｈｅ－Ｍｉｎ，ＳＵＮ Ｐｉｎｇ，ＷＡＮＧ Ｗａｎｇ－Ｔｉａｎ，
ＬＩ Ｍｅｎｇ－Ｆｅｉ，ＬＩ Ｗｅｉ＊，ＷＡＮＧ Ｙａ－Ｌｉｎ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇａｎｓｕ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇａｎｓｕ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ
Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ａｒｉｄｌａｎｄ Ｃｒｏｐ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌａｎｚｈｏｕ ７３００７０，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｃ－ｒｅｐｅａｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ ２ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｃｈｉｌｉｎｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｒａｐｅｓ：Ｃａｂｅｒｎｅｔ ｓａｕｖｉｇｎｏｎ，Ｂｅｔａａｎｄ Ｖｉｔｉｓ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ．Ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ａｐ－
ｐｌｉｅｄ ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ．Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｌｏｎｅｄ ＣＢＦ２ｇｅｎｅ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｈｉｌ－
ｉｎｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｒａｐｅｓ ｈａｄ ９６９ｂｐ ａｎｄ ｅｎｃｏｄｅｄ ２５３ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ，ａｎｄ ｈａｄ ９６．７％－９７．９４％ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎ ＧｅｎｅＢａｎｋ．Ｔｈｅ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＣＢＦ２ｆｒｏｍ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｈｉｌｉｎｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｒａｐｅｓ
ｈａｄ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｏｐｅｎｉｎｇ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ，ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｓｏ ｈａｄ ＡＰ２ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ，ｓｏ ｗｅ
ｓｈｏｕｌｄ ｈａｖｅ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ ｊｕｄｅｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｃｏｌｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ＣＢＦ２．Ｂｕｔ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｆ
＊ 收稿日期：２０１２－０４－１９ 修回日期：２０１２－０６－１４
基金项目：甘肃省科技厅项目（１００２ＮＫＤＡ０３１）；甘肃省农业生物技术研究与应用开发（ＧＮＳＷ－２０１０－１６）
作者简介：张哲敏（１９８６－），女，甘肃兰州人，硕士研究生，主要从事植物生理和分子生物学研究，（Ｅ－ｍａｉｌ）２９５６７０４３７＠ｑｑ．ｃｏｍ。
＊通讯作者：李唯，教授，主要从事作物分子生态生理研究，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｌｉｗｅｉ＠ｇｓａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。
ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ，ｐｈｙｓｉｃｏ－ｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｙ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉａ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ
ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｓｏｍｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ｃｈｉｌｉｎｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｒａｐｅ Ｖｉｔｉｓ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ ａｎｄ Ｂｅｔａ，ａｎｄ ｔｈｅ ｌｏｗ ｃｈｉｌｉｎｇ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｒａｐｅ Ｃａｂｅｒｎｅｔ ｓａｕｖｉｇｎｏｎ．Ｔｈｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎ ＧｅｎｅＢａｎｋ
ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｗｏｒｓｔ ｏｎｅ ｗａｓ Ｃ．ｓａｕｖｉｇｎｏｎ；ａｎｄ ｔｈｅ ７ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｎ ｔｅｒｍｉｎａｌ ｉｎ Ｃ．ｓａｕｖｉｇｎｏｎ ｗｅｒｅ ｔｏｔａｌｙ ｄｉｆ－
ｆｅｒｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｖｉｔｉｓ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ ａｎｄ Ｂｅｔａ；ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｍｉｇｈｔ ｂｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｒ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｈｅａｄ ｏｆ ａｍｉｎｏ
ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ ｆｒｏｍＣａｂｅｒｎｅｔ ｓａｕｖｉｇｎｏｎ．Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｖｅｃｔｏｒ ｐＢＩ１２１ｗｉｔｈ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ３５Ｓ，ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ
ｐＢＩ１２１－ＣａＭＶ３５Ｓ－ＣＢＦ２ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ，ｗｈｉｃｈ ｃｏｕｌｄ ｏｆｆｅｒ ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｄａｔａ ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｔｈｅ
ｃｏｌｄ－ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｇｒａｐｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｇｒａｐｅｓ；ＣＢＦ２ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｃｔｉｖａｔｏｒ；ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ；ｃｌｏｎｉｎｇ；ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
低温在很大程度上遏制了植物的生长发育以及
缩小了它们的种植范围，是影响农业生产最重要的
因素之一（Ｇｉｌｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。我国北方葡萄栽
培主要受冬季低温和春季干旱影响，遇特殊年份，南
方低温胁迫也时常发生，严重影响我国葡萄产业化
的发展（牛锦凤等，２００５）。近年来，在模式植物拟南
芥中发现的ＣＢＦｓ（ＣＲＴ／ＤＲＥｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃｔｏｒｓ）低温
反应途径，受到了分子生物学与基因工程研究者的
极大 关注。ＣＢＦ（Ｃ－ｒｅｐｅａｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ
ｆａｃｔｏｒ／ｄｅ－ｈｙｄｒａｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｆａｃ－
ｔｏｒ，ＤＲＥＢ）基因是植物ＣＢＦ 抗冷途径的枢纽，它
通过ＣＢＦ转录因子调控大量下游抗冷基因的表达
来提高植物抗冷能力（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００４）。目前
ＣＢＦ１ 和ＣＢＦ３ 基因在植物抗寒和抗旱性中的作用
已得到不少研究者的肯定，但对ＣＢＦ２ 基因功能研
究的结果却显得较为复杂 （李新玲等，２０１０）。
Ｖｏｇｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００５）发现：拟南芥里受低温诱导而高
表达的２５个抗寒基因中，其中１９个是受ＣＢＦ２ 转
录因子诱导的，因此认为ＣＢＦ２ 能够高效地诱导下
游抗寒基因的表达；但与上述观点冲突的是，Ｎｏｖｉｌ－
ｌｏ ｅｔ ａｌ．（２００４）研究却发现，ＣＢＦ２ 突变体（即通过
基因工程的方法，使ＣＢＦ２ 基因不能正常表达）中的
ＣＢＦ１、ＣＢＦ３表达量会明显增加，抗寒能力高于三种
基因均能正常表达的植株，因此认为 ＣＢＦ２ 是
ＣＢＦ１、ＣＢＦ３ 的负调控因子。可见，对ＣＢＦ２ 转录因
子更深入的研究是十分必要的。
据相关报道ＣＢＦ１ 为单拷贝或低拷贝数基因，
不含有中断阅读框（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）的内含子；
ＣＢＦ２ 和ＣＢＦ３ 也不含有内含子（Ｇｉｌｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，
１９９８）。本研究以酿酒葡萄“赤霞珠”、抗冻葡萄砧木
“贝达”和山葡萄“北冰红”为研究材料，以葡萄总
ＤＮＡ为模版克隆ＣＢＦ２ 转录因子，并进行生物信息
学分析及表达载体构建，研究ＣＢＦ２ 转录因子在不
同抗寒材料中的差异，为葡萄中其功能的研究提供
理论依据，也为ＣＢＦ２ 转录因子在酿酒葡萄抗寒性
的改良利用方面提供研究基础。
１ 材料与方法
１．１供试材料
１．１．１植物材料及菌种 酿酒葡萄“赤霞珠（Ｃａｂｅｒ－
ｎｅｔ ｓａｕｖｉｇｎｏｎ）”、抗冻葡萄砧木“贝达（Ｂｅｔａ）”和山
葡萄“北冰红（Ｖｉｔｉｓ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）”的幼嫩叶片，－７０℃
保存备用，采自甘肃酒泉紫轩葡萄园；Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α
菌株及植物表达载体ｐＢＩ１２１由甘肃省干旱生境作
物学重点实验室保存。
１．１．２主要试剂和仪器 ＴａｑＰＣＲＭｉｘ、ｐＭＤ１８－Ｔ、
限制性内切酶、克隆时的 Ｔ４ＤＮＡ连接酶、Ｍａｋｅｒ
（２ ０００、５ ０００、１５ ０００ｂｐ）等均购自大连宝生物有限
公司，ＰＣＲ产物回收试剂盒购自爱思进生物技术有
限公司，表达载体构建时的Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自北
京全式金生物技术有限公司。主要仪器有凝胶成像
系统（ＲＨ－５．１），德国 Ｈｅｒｏｌａｂ公司；ＰＣＲ仪（ＰＴＣ－
２００），德国Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ公司。
１．２实验方法
１．２．１植物ＤＮＡ的提取及ＰＣＲ引物设计 以山葡
萄、贝达及赤霞珠的幼叶为材料分别提取它们的基
因组ＤＮＡ。参照ＧｅｎＢａｎｋ上发表的葡萄ＣＢＦ２ 基
因序列（ＤＱ５１７２９７）设计引物，因后续构建载体的需
要，上游引物５ｃ端加ＢａｍＨ酶切位点，下游引物５ｃ
端 加 ＳａｃＩ 酶 切 位 点 （上 游 引 物 Ｐ１：５ｃ－ＣＧ－
ＧＡＴＣＣＴＣＡＣＴＣＡＣＴＣＴＴ ＧＣＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴ－
３ｃ；下 游 引 物 Ｐ２：５ｃ－ＧＧＡＧＣＴＣＣＣＴＴＡＣＣＴ－
ＧＡＡＧＴＣＣＡＴＣＣＡ－３ｃ；酶切位点用画线部分标
出）。引物由北京华大基因有限公司合成。
１．２．２三种葡萄ＣＢＦ２ 基因的克隆、连接转化以及
测序 分别以提取的山葡萄、贝达及赤霞珠的总
ＤＮＡ为模板，Ｐ１和Ｐ２为引物进行ＰＣＲ扩增，程序
３８１期 张哲敏等：三种不同抗冻性葡萄中ＣＢＦ２ 基因的生物信息学分析及植物表达载体构建
为：９５℃预变性３ｍｉｎ；然后９４℃４０ｓ，６０℃／６４℃
（山葡萄、贝达为６０℃，赤霞珠为６４℃）４５ｓ，７２℃
５０ｓ，３５个循环，７２℃延伸１０ｍｉｎ。用１．５％琼脂糖
凝胶电泳检测ＰＣＲ产物，回收目的片段并与克隆载
体ｐＭＤ１８－Ｔ于１６℃水浴中连接过夜，转化ＤＨ５α
大肠杆菌感受态细胞，进行Ａｍｐ抗性筛选，挑取单
菌落活化培养，提取质粒，ＸｂａＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切来
鉴定重组子，分别将其命名为山葡萄／贝达／赤霞珠
ｐＭＤ１８Ｔ－ＣＢＦ２ 并送华大公司测序。
１．２．３三种葡萄ＣＢＦ２ 基因的生物信息学分析 对
山葡萄、贝达及赤霞珠的ＣＢＦ２ 转录因子的生物信
息学分析利用ＮＣＢＩ中的ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ软件进行开
放阅读框识别，对它的编码区进行蛋白质保守结构
域分析（Ｓｃｈａｆｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）；用Ｃｌｕｓｔａｌｘ和ＤＮＡ－
Ｍａｎ Ｖ６．０软件进行氨基酸序列的比对及进化树的
生成，在线（ｈｔｔｐ：／／ｃｎ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）分析蛋白质结
构及理化特性。
１．２．４植物表达载体山葡萄ＰＢＩ１２１－ＣＢＦ２ 的构建
以克隆的山葡萄ｐＭＤ１８－Ｔ－ＣＢＦ２ 质粒为模板、以
Ｐ１和Ｐ２为上口下游引物进行ＰＣＲ扩增，ＰＣＲ反
应体系和反应条件同１．２．２，扩增产物经琼脂糖凝
胶纯化回收后经ＢａｍＨⅠ、ＳａｃⅠ双酶切后，与经同
样双酶切的表达载体ｐＢＩ１２１－ＣａＭＶ３５Ｓ连接，构建
重组表达质粒，经酶切和测序检测，正确的阳性克
隆，命名为ｐＢＩ１２１－ＣａＭＶ３５Ｓ－ＣＢＦ２。
２ 结果与分析
２．１三种葡萄ＣＢＦ２基因的克隆以及重组质粒的鉴定
ＰＣＲ扩增得到的山葡萄、贝达及赤霞珠的
ＣＢＦ２基因片段大小均为１ ０００ｂｐ左右（如图１所
示），与预期结果一致。该片段经回收连接转化后得
到的重组子ｐＭＤ１８Ｔ－ＣＢＦ２ 经ＸｂａＩ和Ｈｉｎｄ ＩＩＩ双
酶切后得到的片段与ＰＣＲ结果相吻合（图２），说明
重组子构建成功。测序结果显示（图３，以山葡萄为
例），来自三种葡萄的ＣＢＦ２ 基因片段的大小同为
９６９ｂｐ，最长编码区为７６２ｂｐ，编码２５３个氨基酸，
中间有５８个氨基酸组成的与ＤＮＡ结合的ＡＰ２结
构域以及ＰＫＫＰＡＧＲＫＫＦＲＦＴＲＨＰ和ＤＳＡＷＲ特
异氨基酸，而ＡＰ２结构域与ＣＯＲ基因启动子中的
ＣＲＴ／ＤＲＥ片段结合，诱导抗寒及抗旱的发生，初步
说明克隆的ＣＢＦ２ 具有诱导抗寒性发生的功能。山
葡萄、贝达及赤霞珠的ＣＢＦ２ 基因与 ＧｅｎｅＢａｎｋ上
公布的ＣＢＦ２ 基因相比对，其核苷酸相似性分别为
９７．９４％、９７．８３％和９６．７％。
图１ ＣＢＦ２基因ＰＣＲ产物电泳
Ｆｉｇ．１ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｆｏｒ ＣＢＦ２ｇｅｎｅ
Ｍ．ＤＬ２０００；泳道１、２、３分别为山葡萄、贝达、赤霞珠ＰＣＲ产物。
Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＬ２０００；Ｌａｎｅ １，２，３ ａｒｅ ｔｈｅ ＰＣＲ
ｐ ｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ｖｉｔｉｓ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ，Ｂｅｔａ，Ｃａｂｅｒｎｅｔ ｓａｕｖｉｇｎｏｎ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
图２ ｐＭＤ１８Ｔ－ＣＢＦ２双酶切电泳
Ｆｉｇ．２ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｏｕｂｌｅ
ｅｎｚｙｍｅ－ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｐＭＤ１８Ｔ－ＣＢＦ２
Ｍ．ＤＬ５０００；泳道１，２，３分别为山葡萄、
贝达、赤霞珠的质粒酶切产物
Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＬ５０００；Ｌａｎｅ １，２，３ ａｒｅ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ－
ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｉｎ Ｖｉｔｉｓ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ，
Ｂｅｔａ，Ｃａｂｅｒｎｅｔ ｓａｕｖｉｇｎｏｎ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
２．２三种葡萄ＣＢＦ２ 基因的生物信息学分析
２．２．１氨基酸序列比对及进化树分析 用Ｃｌｕｓｔａｌｘ
和ＤＮＡＭａｎ Ｖ６．０软件进行氨基酸序列的比对及
进化树的生成，来自山葡萄、贝达及赤霞珠的ＣＢＦ２
基因氨基酸序列的同源性达到９７％，都包含由５８
个氨基酸组成的保守的 ＡＰ２ＤＮＡ 结合域，以及
ＰＫＫＰＡＧＲＫＫＦＲＦＴＲＨＰ和ＤＳＡＷＲ特异氨基酸
序列，但来自山葡萄（北冰红）和贝达的ＣＢＦ２基因
的Ｎ端的７个氨基酸残基与来自赤霞珠的不同（图
４８ 广 西 植 物 ３３卷
４）。由进化树图谱（图５）可以看出，来自山葡萄
ＣＢＦ２ 基因同来自贝达的ＣＢＦ２ 基因的同源性很
高，位于同分支上，相比之下从赤霞珠中克隆得到
ＣＢＦ２ 基因稍远些，位于另一条分支上。
图３ 山葡萄（北冰红）ＣＢＦ２基因测序结果及其推导氨基酸序列
Ｆｉｇ．３ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ＣＢＦ２ｇｅｎｅ ｉｎ Ｖｉｔｉｓ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ
黑体部分为ＣＢＦｓ家族蛋白特征序列ＰＫＫ／ＲＰＡＧＲＸＫＦＸＥＴＲＨＰ和ＤＳＡＷＲ；方框部分为ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ ＤＮＡ结构域；圆圈部分为酶切位点。
Ｔｈｅ ｂｏｌｄ ｐａｒｔ ｉｓ ＰＫＫ／ＲＰＡＧＲＸＫＦＸＥＴＲＨＰ ａｎｄ ＤＳＡＷＲ，ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｔｈｅ ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＢＦｓ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｔｈｅ
ｓｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｆｒａｍｅ ｉｓ ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ；ｓｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｉｒｃｌｅ ｉｓ ｅｎｚｙｍｅ ｃｕｔｔｉｎｇ ｓｉｔｅ．
２．２．２氨基酸组成及其理化性质 据ＰｒｏｔＰａｒａｍ软
件（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｕ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ．
ｈｔｍｌ）预测结果显示：从山葡萄（北冰红）、贝达、赤霞
珠克隆到的ＣＢＦ２ 基因编码的蛋白质的分子式为
Ｃ１２０１－１２１４Ｈ１８９５－１９１９Ｎ３５３－３５９Ｏ３７０－３７５Ｓ９－１１，分子量为２７．４９
～２７．８５ＫＤ；理论等电点为９．３４～９．６７；带负电荷
的氨基酸残基数（Ａｓｐ＋Ｇｌｕ）为２４～２８，带正电荷的
氨基酸残基数（Ａｒｇ＋Ｌｙｓ）为３２～３３，说明碱性氨基
酸在整个ＣＢＦ２ 中占据较多百分含量，而酸性氨基
酸相对含量较低；不稳定系数为５２．５４～６０．１９，均
为不稳定蛋白（标准４０以下为稳定蛋白），理论推导
半衰期大约为 ３０ｈ，脂肪系数平均为 ６２．１３～
６４．８６，含量较高的氨基酸依次为Ａｒｇ（６７～７．９％）、
Ａｓｐ（５．５～６．７％）、Ｇｌｕ（４．０～４．３％）、Ｌｅｕ（５．９～
６．７％）、Ｌｙｓ（５．９～６．３％）、Ｐｒｏ（６．３～７．９％）、Ｓｅｒ
（１５．８～１６．６％）、Ｇｌｙ（４．３～５．５％）、Ｖａｌ（５．５％），
亲水性平均数为－０．５４２～－０．４５２，预测该蛋白均为
亲水性蛋白（表１）。
５８１期 张哲敏等：三种不同抗冻性葡萄中ＣＢＦ２ 基因的生物信息学分析及植物表达载体构建
图４ 三种葡萄ＣＢＦ２基因的氨基酸序列比对
Ｆｉｇ．４ Ａｌｉｇｍｅｎｔ ｏｆ ＣＢＦ２ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｏｆ ｇｒａｐｅｓ
图５ 三种葡萄ＣＢＦ２基因的进化树分析
Ｆｉｇ．５ Ａｎａｓｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｔｒｅｅｓ ｆｏｒ ＣＢＦ２
ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｏｆ ｇｒａｐｅｓ
２．２．３氨基酸序列疏水性／亲水性分析 氨基酸序
列疏水性／亲水性对蛋白质结构和功能预测有一定
作用。由图６和图７显示，抗寒性较弱的赤霞珠
ＣＢＦ２前部（Ｎ－端）有数个疏水性较强的氨基酸，而
抗寒性极强的山葡萄ＣＢＦ２前部（Ｎ－端）有数个亲
水性较强的氨基酸，这可能是导致山葡萄ＣＢＦ２亲
水性（亲水性平均数－０．５４２）强于赤霞珠ＣＢＦ２亲水
性（亲水性平均数－０．４５２）的一个重要原因。山葡萄
表１ 三种葡萄ＣＢＦ２蛋白一级结构分析结果
Ｔａｂｌｅ １ Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＣＢＦ２ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｏｆ ｇｒａｐｅｓ
品种
Ｖａｒｉｅｔｉｅｓ
分子式
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｆｏｒｍｕｌａ
分子量
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｗｅｉｇｈｔ
理论等电点
Ｔｈｅｏｒｅ－
ｔｉｃａｌ ｐＩ
天冬氨酸
＋谷氨酸
Ａｓｐ＋Ｇｌｕ
精氨酸＋
赖氨酸
Ａｒｇ＋Ｌｙｓ
不稳定系数
Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ
ｉｎｄｅｘ
脂肪系数
Ａｌｉｐｈａｔｉｃ
ｉｎｄｅｘ
亲水性平均数
Ｇｒａｎｄ ａｖｅｒａｇｅ
ｏｆ ｈｙｄｒｏｐａｔｈｉｃｉｔｙ
山葡萄（北冰红）
Ｖｉｔｉｓ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ
Ｃ１２１４Ｈ１９１９Ｎ３５９Ｏ３７２Ｓ１１ ２７．８５ ９．６０ ２７ ３５ ６０．１９ ６２．１３ －０．５４２
贝达Ｂｅｔａ Ｃ１２０８Ｈ１９０２Ｎ３５６Ｏ３７５Ｓ１０ ２７．７３ ９．３４ ２８ ３４ ５２．５４ ６２．１３ －０．５１４
赤霞珠
Ｃａｂｅｒｎｅｔ ｓａｕｖｉｇｎｏｎ
Ｃ１２０１Ｈ１８９５Ｎ３５３Ｏ３７０Ｓ９ ２７．４９ ９．６７ ２４ ３３ ５３．０２ ６４．８６ －０．４５２
和赤霞珠的前１５个氨基酸疏水性趋势差异较大，赤
霞珠的疏水性质明显较强。
２．３植物表达载体山葡萄ｐＢＩ１２１－ＣａＭＶ３５Ｓ－ＣＢＦ２
的鉴定
本实验用分别用ＢａｍＨＩ和ＳａｃＩ双酶切带有
３５Ｓ启动子的ｐＢＩ１２１和山葡萄ｐＢＩ１２１－ＣａＭＶ３５Ｓ－
ＣＢＦ２ 纯化质粒。酶切结果显示构建的植物表达载
体山葡萄ｐＢＩ１２１－ＣａＭＶ３５Ｓ－ＣＢＦ２ 酶切后的大片段
与切去ｇｕｓ基因的ｐＢＩ１２１大小相同，而双酶切出的
小片段大小在１ ０００左右，与山葡萄ＣＢＦ２ 基因大
小一致（图８）。进一步对植物表达载体ｐＢＩ１２１－
ＣａＭＶ３５Ｓ－ＣＢＦ２纯化质粒进行测序，结果显示表达
载体ｐＢＩ１２１－ＣａＭＶ３５Ｓ－ＣＢＦ２ 中ＣＢＦ２ 基因与从山
葡萄上克隆的ＣＢＦ２ 基因同源性达到９９．０７％。上
述结果说明来自山葡萄的ＣＢＦ２ 基因已正确插入带
有３５Ｓ启动子的ｐＢＩ１２１中，植物表达载体ｐＢＩ１２１－
ＣａＭＶ３５Ｓ－ＣＢＦ２ 构建成功，其结构如图９所示。
３ 结论与讨论
植物抗寒性的基因表达过程属于数量性状控制
的遗传现象，是多个抗寒基因共同表达作用的结果。
６８ 广 西 植 物 ３３卷
图６ 山葡萄ＣＢＦ２蛋白质疏水性分析
Ｆｉｇ．６ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ Ｖｉｔｉｓ
ａｍｕｒｅｎｓｉｓ ＣＢＦ２ｐｒｏｔｅｉｎ
横坐标为编码的氨基酸顺序；纵坐标为亲／疏水值；“－”表示亲
水性；“＋”表示疏水性。下同。
Ａｂｓｃｉｓｓａ ｉｓ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ；ｏｒｄｉ－
ｎａｔｅ ｉｓ ｔｈｅ ｐｒｏ－ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｖａｌｕｅ；“－”ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ；
“＋”ｒｅｆｅｒｓ ｔｏ ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ．Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ．
图７ 赤霞珠ＣＢＦ２蛋白质疏水性分析
Ｆｉｇ．７ Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ ｐｒｏｆｉｌｅ ｏｆ Ｃａｂｅｒｎｅｔ
ｓａｕｖｉｇｎｏｎ ＣＢＦ２ｐｒｏｔｅｉｎ
图８ 山葡萄ｐＢＩ１２１－ＣａＭＶ３５Ｓ－ＣＢＦ２植物
表达载体和ｐＢＩ１２１的双酶切电泳
Ｆｉｇ．８ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｚｙｍｅ－ｄｉｇｅｓｔｅｄ
ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＢＩ１２１－ＣａＭＶ３５Ｓ－ＣＢＦ２
ｏｆ Ｖｉｔｉｓ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ ａｎｄ ｐＢＩ１２１
Ｍ．ＤＬ１５０００；泳道１为山葡萄ｐＢＩ１２１－ＣａＭＶ３５Ｓ－ＣＢＦ２ 植物表
达载体双酶切产物；泳道２为ｐＢＩ１２１。
Ｍ．Ｍａｒｋｅｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ＤＬ１５０００；Ｌａｎｅ １ ｉｓ ｔｈｅ ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｚｙｍｅ－ｄｉ－
ｇｅｓｔｅｄ ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＢＩ１２１－ＣａＭＶ３５Ｓ－ＣＢＦ２ｏｆ Ｖｉｔｉｓ
ａｍｕｒｅｎｓｉｓ；Ｌａｎｅ ２ｉｓ ｐＢＩ１２１．
如果采用单一的抗寒功能基因进行转基因操作，虽
然该转基因植物的抗寒性有所提高，但效果并不理
想，而且随着植物的世代交替，很有可能在下一代植
物中该功能基因会丢失，从而降低其抗寒性。而
ＣＢＦ基因是多个抗旱基因的上游转录因子，它能通
过与这些抗逆基因中ＤＲＥ调控元件特异性的结合，
使其下游的抗逆基因进行，因此转入ＣＢＦ转录因子
的植物的抗逆性要比转入单一的抗逆功能性基因强。
ＣＢＦ转录因子家族在拟南芥中最先发现，在后来的研
究中，人们又发现ＣＢＦ冷反应途径在开花植物中普
遍存在，而不只是局限于能进行冷驯化的植物，并且
其核心序列高度保守（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。搜索蛋白质
图９ ｐＢＩ１２１－ＣａＭＶ３５Ｓ－ＣＢＦ２表达框架示意图
Ｆｉｇ．９ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｍａｐ ｏｆ ｐＢＩ１２１－ＣａＭＶ３５Ｓ－ＣＢＦ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｆｒａｍｅｗｏｒｋ
和核酸数据库后发现，大量植物中具有潜在的ＣＢＦ
同源基因，这表明在很多双子叶及单子叶植物中都
存在有ＣＢＦ转录因子及类似的抗逆调控机制。所
以在一些经济林木和作物的抗逆性综合改良中，
ＣＢＦ转录因子具有广泛的应用前景和利用价值。
本研究利用抗寒葡萄砧木山葡萄（北冰红）、较
７８１期 张哲敏等：三种不同抗冻性葡萄中ＣＢＦ２ 基因的生物信息学分析及植物表达载体构建
强抗寒砧木贝达及抗寒能力差的营养系赤霞珠品
种，从它们的基因组中分别克隆出ＣＢＦ２ 转录因子，
都包含由５８个氨基酸组成的保守的 ＡＰ２ＤＮＡ结
合域，以及 ＰＫＫＰＡＧＲＫＫＦＲＦＴＲＨＰ和 ＤＳＡＷＲ
特异氨基酸序列，与在其他植物中发现的特征序列
一致（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．，２０００），由此说明克隆的ＣＢＦ２基
因具有转录激活活性。通过三种葡萄的ＣＢＦ２基因
同源性及氨基酸序列理化性质和亲／疏水性的分析，
与ＧｅｎＢａｎｋ上登录的原始序列（ＤＱ５１７２９７）同源性
最低的是赤霞珠，而且其ＣＢＦ２基因Ｎ－端的７个氨
基酸序列与山葡萄（北冰红）和贝达的不同，具有较
强的疏水性。而在实际的农业生产中贝达和山葡萄
（北冰红）能耐－２０℃的低温，而赤霞珠则不能（许宏
等，２００３）。那么，ＣＢＦ２转录因子序列同源性较低
和Ｎ－端氨基酸及其亲／疏水性的差异是否可能与葡
萄品种间抗寒特性的不同有关？尚待于更多的试验
资料来证明。
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ｒｅｇｕｌｏｎ ｔｈａｔ ｄｉｆｆｅｒｓ ｆｒｏｍ ｔｈａｔ ｏｆ ｆｒｅｅｚｉｎｇ ｔｏｌｅｒａｎｔ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｊ，３９（６）：
欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍欍
９０５－９１９
（上接第２４页Ｃｏｎｔｉｎｕｅ ｆｒｏｍ ｐａｇｅ ２４）
鉴定［Ｃ］／／李法曾等．山东植物研究．北京：科学技术出版
社：３５８－３６４
Ｃｈｅｎ Ｗ（陈韦），Ｓｈａｎｇ ＨＷ（商晗武），Ｇａｏ ＹＳ（高永生），ｅｔ ａｌ．
２０１０．Ｔｈｅ ｆｌｏｗｅｒ ａｎｄ ｐｏｌｅｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓｏｌｉｄａｇｏ（一枝黄花属
植物的花及花粉形态）［Ｊ］．Ｇｕｉｈａｉａ（广西植物），３０（１）：５５－５９
Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．１９６８．Ｐｏｌｅｎ Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｓａｌｖｉａ ａｎｄ Ｓｏｍｅ Ｒｅ－
ｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅｒａ［Ｊ］．Ｇｒａｎ Ｐａｌｙｎｏｌ，８（１）：７０－８５
Ｐ．Ｄ摩尔，Ｊ．Ａ韦布．１９８７．花粉分析指南［Ｍ］．李文漪，等
（译）．广西：广西人民出版社：１
Ｓｕｎ Ｑ（孙群），Ｌｉａｎｇ ＺＳ（梁宗锁），Ｌｉ ＳＪ（李绍军），ｅｔ ａｌ．２００４．
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ ｆａｂｒｉｃ ａｎｄ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｓａｌ－
ｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａｓｅｅｄｓ（丹参种子形态结构与吸水萌发特性）
［Ｊ］．Ｃｈｉｎ Ｊ Ｃｈｉｎ Ｍａｔ Ｍｅｄ（中国中药杂志），２９（１０）：９３４－９３７
Ｗａｎｇ ＣＨ（王彩红），Ｗｅｎ ＸＨ（文雪花），Ｌｉ ＬＨ（李连怀），ｅｔ ａｌ．
２００７．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉｏｒｒｈｉｚａｅ Ｂｇｅ．，Ｓ．ｐｒｚｅｗａｌ－
ｓｋｉｉ Ｍａｘｉｍ．ａｎｄ Ｓ．ｕｍｂｒａｔｉｃａｈａｎｃｅ ｓｅｅｄｓ ｂｙ ＳＥＭ（丹参、甘西
鼠尾、荫生鼠尾种子的扫描电镜鉴别）［Ｊ］．Ｊ Ｈｅｂｅｉ Ｍｅｄ Ｕｎｉｖ
（河北医科大学学报），２８（３）：１８６－１８７
Ｙａｎｇ ＤＫ（杨德奎），Ｓｕｎ ＪＴ（孙京田），Ｗａｎｇ ＢＱ（王丙全）．２００３．
Ｐｏｌｅｎ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔａｘｎｏｍｉｃ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ Ｓａｌｖｉａ ｆｒｏｍ
Ｓｈａｎｄｏｎｇ（山东鼠尾草属花粉形态的研究及其在分类上的意
义）［Ｊ］．Ｓｈａｎｄｏｎｇ Ｓｃｉ（山东科学），１６（１）：１５－１６
Ｚｈａｎｇ Ｌ（张利），Ｙａｎｇ ＺＪ（杨在君），Ｈｕａｎｇ Ｘ（黄霞），ｅｔ ａｌ．２００８．
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｌｅａｆ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ ｏｆ Ｓａｌｖｉａ ｍｉｌｔｉ－
ｏｒｒｈｉｚａ ａｎｄ Ｓａｌｖｉａｆｒｏｍ Ｓｉｃｈｕａｎ（丹参及四川鼠尾草属植物叶
表皮微形态研究）［Ｊ］．Ｊ Ｓｉｃｈｕａｎ Ｕｎｉｖ：Ｎａｔ Ｓｃｉ Ｅｄｉｔ（四川大
学学报·自然科学版），４５（３）：６７４－６８０
８８ 广 西 植 物 ３３卷