全 文 ：　 Ｇｕｉｈａｉａ　 Ｊｕｌ. ２０１６ꎬ ３６(７):８３２－８３６
ｈｔｔｐ: / / ｊｏｕｒｎａｌ.ｇｘｚｗ.ｇｘｉｂ.ｃｎ
ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｇｕｉｈａｉａ－ｊｏｕｒｎａｌ.ｃｏｍ
ＤＯＩ: １０.１１９３１ / ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１５１２００４
韦艳梅ꎬ周雅琴ꎬ李力ꎬ等. 白及内生真菌多样性研究 [Ｊ]. 广西植物ꎬ ２０１６ꎬ ３６(７):８３２－８３６
ＷＥＩ ＹＭꎬ ＺＨＯＵ ＹＱꎬ ＬＩ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｄｉｖｅｔｓｉｔｙ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｂｌｅｔｉｌｌａ ｓｔｒｉａｔａ [Ｊ]. Ｇｕｉｈａｉａꎬ ２０１６ꎬ ３６(７):８３２－８３６
白及内生真菌多样性研究
韦艳梅ꎬ 周雅琴ꎬ 李　 力ꎬ 谭小明∗
( 西南濒危药材资源开发国家工程实验室ꎬ 广西药用植物园ꎬ 南宁 ５３００２３ )
摘　 要: 白及(Ｂｌｅｔｉｌｌａ ｓｔｒｉａｔａ)是兰科地生型多年生植物ꎬ也是我国传统中药材之一ꎮ 利用菌根技术进行白及
的保护和人工栽培ꎬ需要获得白及可培养的内生真菌ꎮ 该研究以广西野生的白及根和叶为材料ꎬ采用分离培
养法分离内生真菌ꎬ并结合真菌形态特征ꎬ及其核糖体的转录间隔区(ＩＴＳ)序列分析ꎬ确定内生真菌的分类地
位ꎮ 结果表明:从 ２株白及植物 ９０块组织中分离获得 ３７株内生真菌ꎬ鉴定为 １５个分类单元ꎬ由 ９个属组成ꎬ
分属于 ２门 ４纲 ７目 ８科ꎬ包括锤舌菌纲(Ｌｅｏｔｉｏｍｙｃｅｔｅｓ)、座囊菌纲(Ｄｏｔｈｉｄｅｏｍｙｃｅｔｅｓ)和粪壳菌纲(Ｓｏｒｄａｒｉｏｍｙ￣
ｃｅｔｅｓ)ꎬ伞菌纲(Ａｇａｒｉｃｏｍｙｃｅｔｅｓ)ꎮ 从根中分离获得内生真菌 １２ 种ꎬ蜡壳菌属为优势属ꎻ从叶中分离获得内生
真菌 ３种ꎬ刺盘孢属为优势属ꎻ刺盘孢菌属(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ)和蜡壳菌属(Ｓｅｂａｃｉｎａ)真菌的相对多度值均达到
２０％ꎻ４株担子菌均分布于根中ꎬ叶组织中未有分布ꎮ 根组织中内生真菌的多样性指数(Ｈ＝ １.８６３)高于叶组织
(１.０９８)ꎮ 该研究结果及其所分离培养的担子菌类真菌ꎬ为更好地利用菌根技术进行白及等兰科植物资源的
保护与可持续利用奠定了基础ꎮ
关键词: 白及ꎬ 可培养内生真菌ꎬ蜡壳菌属ꎬ 多样性ꎬ 鉴定
中图分类号: Ｑ９４３　 　 文献标识码: Ａ　 　 文章编号: １０００￣３１４２(２０１６)０７￣０８３２￣０５
Ｄｉｖｅｔｓｉｔｙ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｗｉｔｈ Ｂｌｅｔｉｌｌａ ｓｔｒｉａｔａ
ＷＥＩ Ｙａｎ￣Ｍｅｉꎬ ＺＨＯＵ Ｙａ￣Ｑｉｎꎬ ＬＩ Ｌｉꎬ ＴＡＮ Ｘｉａｏ￣Ｍｉｎｇ∗
( Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ
Ｒｅｆｏｒｍ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｇａｒｄｅｎ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｌａｎｔꎬ Ｎａｎｎｉｎｇ ５３００２３ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｂｌｅｔｉｌｌａ ｓｔｒｉａｔａꎬ ａｓ ａｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈｅｒｂａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅꎬ ｉｓ ａ ｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌ ａｎｄ ｐｅｒｅｎｎｉａｌ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｌａｎｔ. Ｉｔ ｉｓ
ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ｉｎ ｔｈｅ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｒ￣
ｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ. ｓｔｒｉａｔａ. Ｔｈｅ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｆｕｎｇａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｏｏｔｓ ａｎｄ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｂ. ｓｔｒｉａｔａꎬ ａｎｄ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｆｕｎｇａｌ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｎｇａｌ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ
(ＩＴＳ) ｏｆ ｒＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｉｒｔｙ￣ｓｅｖｅｎ ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｆｕｎｇａｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ ｆｏｒｔｙ￣ｆｉｖｅ
ｒｏｏｔ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｆｏｒｔｙ￣ｆｉｖｅ ｌｅａｆ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｗｉｌｄ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｂ. ｓｔｒｉａｔａ. Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｔｏ １５ ｔａｘａꎬ ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ ｔｏ
ｎｉｎｅ ｇｅｎｅｒａꎬｅｉｇｈｔ ｆａｍｉｌｉｅｓꎬ ｓｅｖｅｎ ｏｒｄｅｒｓꎬ ｆｏｕｒ ｃｌａｓｓｅｓꎬ ａｎｄ ｔｗｏ ｐｈｙｌａ. Ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｃｌａｓｓｅｓ ａｒｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ Ｌｅｏｔｉｏｍｙｃｅ￣
ｔｅｓꎬ Ｄｏｔｈｉｄｅｏｍｙｃｅｔｅｓꎬ Ｓｏｒｄａｒｉｏｍｙｃｅｔｅｓ ａｎｄ Ａｇａｒｉｃｏｍｙｃｅｔｅｓ. Ｔｗｅｌｖｅ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｒｏｏｔｓꎬ ａｎｄ
Ｓｅｂａｃｉｎａ ｗｅｒｅ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｇｅｎｕｓ. Ｔｈｒｅｅ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｌｅａｖｅｓꎬ ａｎｄ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｗｅｒｅ ｄｏｍｉｎａｎｔ
ｇｅｎｕｓ. Ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅ ｏｆ Ｓｅｂａｃｉｎａ ｏｒ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｗａｓ ２０％. Ｆｏｕｒ ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ ａｌｌ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ
收稿日期: ２０１５￣１２￣０３　 　 修回日期: ２０１６￣０４￣１４
基金项目: 广西自然科学基金(２０１５ＧＸＮＳＦＤＡ１３９０１２)ꎻ广西药用植物园科研基金(桂药基 ２０１４０１)[Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｇｕａｎｇｘｉ(２０１５ＧＸＮＳＦＤＡ１３９０１２)ꎻＲｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄ ｏｆ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｇａｒｄｅｎ(２０１４０１)ꎮ]
作者简介:韦艳梅(１９８３￣)ꎬ女(壮族)ꎬ广西都安人ꎬ硕士ꎬ工程师 /助理研究员ꎬ主要从事园林景观建设、植物栽培研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ) ｗｅｉｙａｎｍｅｉ９９＠ １２６.ｃｏｍꎮ
∗通讯作者: 谭小明ꎬ博士ꎬ副研究员ꎬ主要从事药用植物菌根生物学研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ) ｔｘｍ１９７８＠ １２６.ｃｏｍꎮ
ｌｅａｖｆ ｔｉｓｓｕｅｓ ｂｕｔ ｔｈｅ ｒｏｏｔｓ. Ｔｈｅ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘ ｏｆ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ｉｎ ｒｏｏｔｓ (Ｈ′＝ １.８６３) ｗａｓ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｌｅａｖｅｓ
(Ｈ′＝１.０９８). Ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｔｈｉｓ ｒｅｐｏｒｔ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ｆｕｎｇｉ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｂ. ｓｔｒｉａｔａ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏ￣
ｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｏｓｔ. Ｍｏｒｅｏｖｅｒꎬ ｔｈｅｓｅ Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｃｌｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ａ
ｖａｌｕａｂｌｅ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｓｏｕｒｃｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｓｔａｉｎａｂｌｅ ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｃｈｉｄ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｂｙ ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｂｌｅｔｉｌｌａ ｓｔｒｉａｔａꎬ ｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉꎬ Ｓｅｂａｃｉｎａꎬ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
　 　 白及(Ｂｌｅｔｉｌｌａ ｓｔｒｉａｔａ)为兰科(Ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｅ)白及
属(Ｂｌｅｔｉｌｌａ Ｒｅｉｃｈｂ. ｆ.)地生型多年生植物ꎬ其花色艳
丽ꎬ极具观赏价值ꎬ还是目前我国濒危紧缺的中药材
之一ꎬ其根茎中富含药用成分白及胶质ꎬ具有收敛止
血、清热解毒、消肿生肌等作用(国家药典委员会ꎬ
２０１５)ꎬ疗效确切ꎬ经济价值很高ꎮ 但是ꎬ由于白及
种子无胚乳ꎬ自然条件下难以萌发ꎬ仅靠无性繁殖ꎬ
繁殖系数极低ꎻ加之近年来野生白及栖息地环境恶
化和多年来的乱采乱挖ꎬ导致野生白及资源几近枯
竭ꎬ市场供不应求ꎬ严重限制了其在医药、食品、化状
品及其他方面的应用(刘光斌等ꎬ ２００５)ꎮ 因此ꎬ如
何实现白及资源的保护与资源再生ꎬ是一个重要而
急切的课题ꎮ
研究表明ꎬ所有兰科植物均与内生真菌形成互
惠互利的菌根共生关系ꎬ这种关系在兰科植物的生
活史中扮演着重要作用ꎮ 首先ꎬ菌根真菌能促进兰
科植物种子萌发ꎮ 兰科植物种子仅有原胚ꎬ自身贮
存的营养物质有限ꎬ自然条件下萌发困难ꎬ需依靠真
菌的侵染提供营养才能萌发ꎮ Ｂｅｒｎａｒｄ 首次从兰科
鸟巢兰属(Ｎｅｏｔｔｉａ)植物中发现促进兰科植物种子萌
发的菌根真菌ꎬ并提出了兰科植物种子自然条件下
靠消化菌根真菌才能萌发的经典的共生萌发理论
(Ｓｅｌｏｓｓｅ ｅｔ ａｌꎬ ２０１１)ꎮ Ｔａｎ ｅｔ ａｌ(２０１４)从 １２０ 多种
兰科植物中分离并筛选获得了 １２ 种促进铁皮石斛
种子萌发的菌根真菌ꎬ其中金钗石斛菌根真菌 ＪＣ￣
０２和 ＪＣ￣０５ꎬ可显著促进铁皮石斛种子萌发和幼苗
的生长ꎮ 这些优良菌根真菌的发现ꎬ为今后有效利
用真菌进行田间栽培试验奠定了菌种基础ꎮ 其次ꎬ
菌根真菌能促进兰科植物幼苗生长和发育ꎮ Ｇｕｏ ＆
Ｃａｏ(２０００)率先利用菌根共生技术解决石斛属植物
的资源再生难题ꎬ先后从石斛属植物中发现 ７ 种可
与铁皮石斛幼苗共生的真菌ꎬ对幼苗具有显著促生
作用ꎮ 同时ꎬ菌根真菌也是植物组培苗产生药用成
分的重要诱导因子(Ｓｅｌｏｓｓｅ ｅｔ ａｌꎬ ２０１１)ꎮ
目前ꎬ通过组织培养繁育白及的研究已取得一
定的进展(鲁光耀ꎬ ２０１５)ꎬ但试管苗存在着退化、移
栽成活率低、生长缓慢、活性成分偏低等诸多现实问
题ꎮ 近年来ꎬ国内外针对白及的研究主要集中在化
学、药理、组织培养和引种驯化等方面ꎬ而对于白及
内生真菌分离鉴定及多样性研究的报道较少ꎮ 本研
究通过对白及内生真菌及多样性进行研究ꎬ旨在为
深入研究白及与内生真菌的共生关系提供可利用的
菌种资源ꎬ为在生产实践中有效地利用白及内生真
菌提供理论依据ꎮ
１　 材料与方法
１.１ 材料
１.１.１ 植物材料　 供试材料为 ２株野生白及ꎬ采自广西
桂林市资源县(海拔 １ ３５０ ｍꎻ １１０°６３′ Ｅꎬ２６°０３′ Ｎ)ꎮ
１.１.２ 分离培养基　 采用马铃薯葡萄糖(ＰＤＡ)培养
基分离培养内生真菌ꎮ ＰＤＡ 培养基的配方及制作:
马铃薯 ２００ ｇꎬ洗净后去皮切成小块ꎬ开水煮 ３０ ｍｉｎꎬ
４层纱布过滤ꎬ取滤液加入葡萄糖 ２０ ｇꎬ琼脂 １５ ｇꎬ
加热至完全溶解ꎬ加入蒸馏水定容 １ ０００ ｍＬꎬｐＨ 自
然ꎮ １２１ ℃灭菌 ２０ ｍｉｎꎬ备用ꎮ
１.２ 方法
１.２.１ 内生真菌的分离方法　 选取健康白及植物的
根和叶ꎬ在自来水下冲洗干净ꎬ 切成 １ ｃｍ 的小段ꎮ
在无菌条件下ꎬ先用 ７０％的酒精浸泡 ３０ ｓꎬ再用 ２％
次氯酸钠浸泡消毒 ３~５ ｍｉｎꎬ无菌水冲洗 ３~５次ꎬ去
除残留的次氯酸钠ꎮ 用无菌滤纸ꎬ吸取材料表面的
水分ꎬ然后用手术刀将材料切成 ５ ｍｍ(根)或 ５ ｍｍ ×
５ ｍｍ(叶)ꎬ接种至含有硫酸链霉素(５０ ｍｇ􀅰Ｌ￣１)和
四环素(５０ ｍｇ􀅰Ｌ￣１)的 ＰＤＡ 培养基ꎬ２５ ℃暗培养
７~１５ ｄꎮ 每皿接种组织块 ９块ꎬ根和叶均重复 ５皿ꎬ
每个器官接种 ４５块组织ꎮ
１.２.２ 内生真菌的纯化及保藏　 待组织块边缘长出
真菌菌丝ꎬ及时将菌丝接种至新鲜的 ＰＤＡ培养基上
进行纯化培养ꎻ当菌落长至培养基的 ２ / ３面积时ꎬ根
据菌落的形态特征(生长速度、颜色、气生菌丝有无
等)ꎬ合并相同菌株ꎻ将形态各异纯化后的内生真菌
菌株分为两部分ꎬ一部用于 ４ ℃或－８０ ℃保藏ꎬ另一
部分用于真菌形态鉴定ꎮ
３３８７期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 韦艳梅等: 白及内生真菌多样性研究
表 １　 白及根和叶可培养内生真菌种群组成
Ｔａｂｌｅ １　 Ｃｕｌｔｕｒａｂｌｅ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｒｏｏｔｓ ａｎｄ ｌｅａｖｅｓ ｏｆ Ｂｌｅｔｉｌｌａ ｓｔｒｉａｔａ
门
Ｐｈｙｌａ
纲
Ｃｌａｓｓ
目
Ｏｒｄｅｒ
科
Ｆａｍｉｌｙ
属
Ｇｅｎｕｓ
相对多度
Ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅ
(ＲＢ) (％)
锤舌菌纲
Ｌｅｏｔｉｏｍｙｃｅｔｅｓ
柔膜菌目
Ｈｅｌｏｔｉａｌｅｓ
背芽突霉属
Ｃａｄｏｐｈｏｒａ
６.６７
座囊菌纲
Ｄｏｔｈｉｄｅｏｍｙｃｅｔｅｓ
葡萄座腔菌目
Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａｌｅｓ
球壳孢科
Ｐｈｙｌｌｏｓｔｉｃｔａｃｅａｅ
球座菌属
Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ
６.６７
小丛壳菌目
Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａｌｅｓ
小丛壳菌科
Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａｃｅａ
刺盘孢菌属
Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ
２０.００
子囊菌亚门
Ａｓｃｏｍｙｃｏｔｉｎａ
丛赤壳科
Ｎｅｃｔｒｉａｃｅａｅ
柱孢菌属
Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ
１３.３３
粪壳菌纲
Ｓｏｒｄａｒｉｏｍｙｃｅｔｅｓ
肉座菌目
Ｈｙｐｏｃｒｅａｌｅｓ
丛赤壳科
Ｎｅｃｔｒｉａｃｅａｅ
镰孢菌属
Ｆｕｓａｒｉｕｍ
１３.３３
麦角菌科
Ｃｌａｖｉｃｉｐｉｔａｃｅａｅ
轮枝孢菌属
Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ
６.６７
海球藻科
Ｈａｌｏｓｐｈａｅｒｉａｃｅａｅ
黑团孢霉属
Ｐｅｒｉｃｏｎｉａ
６.６７
担子菌亚门
Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔｉｎａ
伞菌纲
Ａｇａｒｉｃｏｍｙｃｅｔｅｓ
蜡壳菌目
Ｓｅｂａｃｉｎａｌｅｓ
蜡壳菌科
Ｓｅｂａｃｉｎａｃｅａｅ
蜡壳菌属
Ｓｅｂａｃｉｎａ
２０.００
伞菌纲
Ａｇａｒｉｃｏｍｙｃｅｔｅｓ
鸡油菌目
Ｃａｎｔｈａｒｅｌｌａｌｅｓ
胶膜菌科
Ｔｕｌａｓｎｅｌｌａｃｅａｅ
胶膜菌属
Ｔｕｌａｓｎｅｌｌａ
６.６７
１.２.３ 内生真菌的形态学鉴定　 主要参考«真菌鉴定
手册»及其他已发表的文献资料 (魏景超ꎬ１９７９ꎻ
Ｅｌｌｉｓꎬ １９７１ꎻ Ｂａｉｌｅｙ ＆ Ｊｅｇｅｒꎬ １９９２ꎻ Ｎｏｎｔａｃｈａｉｙａｐｏｏｍ
ｅｔ ａｌꎬ ２０１０ꎻ Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌꎬ ２０１０)ꎬ根据宏观的菌落特
征和显微特征ꎬ对分离到的白及内生真菌进行鉴定ꎬ
确定真菌的分类地位ꎮ
１.２.３.１ 显微特征观察　 采用透明胶带粘取菌丝ꎬ置
于表面加有 １ 滴 １０％ ＫＯＨ 的载玻片上ꎬ在生物显
微镜下ꎬ观察分生孢子和孢子梗的大小、形状、颜色、
表面纹饰、产孢方式等ꎬ并进行测量和拍照ꎮ 为了观
察自然生长的菌丝形态ꎬ可以用插片法在 ＰＤＡ培养
基上培养真菌ꎮ
１.２.３.２ 繁殖结构的诱导　 内生真菌大多数不产生
分生孢子ꎬ往往需要诱导产孢ꎮ 本研究采用低温诱
导法、紫外线照射法等培养真菌ꎬ促使真菌产生繁殖
结构和分生孢子ꎬ进行形态学鉴定ꎮ
１.２.４ 内生真菌的分子鉴定　 利用 ＩＴＳ￣ｒＤＮＡ进行内
生真菌分子鉴定ꎮ 参照真菌 ＤＮＡ 提取试剂盒的使
用指南进行总 ＤＮＡ 的提取(Ｅ. Ｚ. Ｎ. ＡＴＭ Ｆｕｎｇａｌ
ＤＮＡ ＫｉｔꎬＯｍｅｇａ ＢｉｏＴｅｋꎬＤｏｒａｖｉｌｌｅꎬＧｅｏｒｇｉａꎬＵＳＡ)ꎻ采
用真菌通用引物 ＩＴＳ１ ( ５′￣ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧ￣
ＣＧＧ￣３′) 和 ＩＴＳ４ ( ５′￣ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＦＧＡＴＡＴＧＣ￣
３′)扩增 ＩＴＳ１ꎬ５.８Ｓ 和 ＩＴＳ２ 全序列ꎮ ５０ μＬ ＰＣＲ 扩
增反应体系:Ｍｉｘ ２５ μＬꎻ引物各 ２ μＬ (５ μｍｏｌ􀅰
Ｌ￣１)ꎻ模板 ２~ １０ μＬꎻｄｄＨ２Ｏ 补足 ５０ μＬꎮ ＰＣＲ 扩增
反应条件:９４ ℃ 预变性 ３ ｍｉｎꎻ９４ ℃变性 ３０ ｓꎻ５５ ℃
退火 ３０ ｓꎻ７２ ℃延伸 ２５ ｓꎻ共 ３０ 个循环后ꎬ７２ ℃再
延伸 ７ ｍｉｎꎬ４ ℃保存ꎮ 取 ５ μＬ ＰＣＲ 扩增产物ꎬ用
０.８％琼脂糖凝胶电泳检测ꎮ 电泳结束后ꎬ在紫外灯
下观察ꎬ有条带的 ＰＣＲ产物送上海生工生物工程公
司测序ꎮ 测序所用引物与扩增反应相同ꎮ 将获得的
目标 ＩＴＳ序列在 ＧｅｎＢａｎｋ数据库中进行网上比对分
析ꎬ利用 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ１.６ 软件进行全序列比对ꎬ并用
ＭＥＧＡ ４.０.２软件进行聚类分析ꎬ构建 ＮＪ 系统发育
树ꎬ对内生真菌进行分子鉴定ꎮ
１.３ 内生真菌多样性分析
本研究采用相对多度和多样性指数度量白及根
和叶组织中内生真菌的丰度ꎮ 内生真菌相对多度可
以反映某种内生真菌在该物种中出现的频率ꎻ多样
性指数则能反映白及内生真菌种群的丰富程度ꎬ用
来分析其物种的多样性ꎮ
相对多度( ｒｅｌａｔｉｖｅ ａｂｕｎｄａｎｃｅꎬＲＢ)是指分离得
到的某种内生真菌菌株数量占该植物内生真菌总菌
株数量的百分率ꎮ
内生真菌的多样性参照香农多样性指数(Ｓｈａｎ￣
ｎｏｎ￣Ｗｉｅｎｅｒ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘꎬＨ′)的公式进行计算ꎬ公
４３８ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
图 １　 基于 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 建立的 ＮＪ系统进化发育树ꎬ显示 １５株白及内生真菌与其他相关类群真菌的系统发育关系
以 Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｓｉｎａｐｉｎａ为外类群ꎮ Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ值≥５０％显示在每个分支的节点上ꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ａｍｏｎｇ ｆｉｆｔｅｅｎ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ｆｒｏｍ Ｂ. ｓｔｒｉａｔａ ａｎｄ ｆｕｎｇｉ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｔａｘａ
Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｓｉｎａｐｉｎａ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｏｕｔｇｒｏｕｐ. Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｖａｌｕｅｓ (≥５０％) ａｒｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ａｌｏｎｇ ｔｏ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｎｏｄｅｓ.
式如下:
Ｈ′＝ －∑ｋｉ＝１Ｐｉ ｌｎ Ｐｉ
式中ꎬｋ代表内生真菌的总分离株数ꎻＰｉ 代表某
种内生真菌占总菌株数的百分比(Ｐｉｅｌｏｕꎬ １９７５)ꎮ
２　 结果与分析
２.１ 白及内生真菌的分离与鉴定
采用组织块分离法从野生白及叶和根中ꎬ分离
获得 ３７株可培养的内生真菌ꎬ经菌落特征和真菌显
微特征的观察ꎬ分为 １５ 个分类单元ꎮ 然而ꎬ这些内
生真菌往往不产生分生孢ꎬ影响了进一步的分类鉴
定ꎮ 因此ꎬ基于 ＩＴＳ￣ｒＤＮＡ序列信息ꎬ以 Ａｒｍｉｌｌａｒｉａ ｓｉ￣
ｎａｐｉｎａ为外类群ꎬ构建白及内生真菌与其他相关真
菌类群的 ＮＪ系统发育树(图 １)ꎮ
通过分析系统发育树ꎬ可将这 １５ 株真菌分为 ９
个属ꎬ涉及 ２门 ４纲 ７目 ８科ꎮ 子囊菌亚门真菌有 ７
种ꎬ担子菌亚门真菌有 ２ 种ꎮ 这些子囊菌包括锤舌
菌纲(Ｌｅｏｔｉｏｍｙｃｅｔｅｓ)、座囊菌纲(Ｄｏｔｈｉｄｅｏｍｙｃｅｔｅｓ)和
粪壳菌纲(Ｓｏｒｄａｒｉｏｍｙｃｅｔｅｓ)ꎮ 其中ꎬ粪壳菌纲的种类
最多ꎮ 刺盘孢菌属(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ)和蜡壳菌属(Ｓｅ￣
ｂａｃｉｎａ)真菌为优势菌群ꎬ均占总分离菌株数的 ２０％
(表 １)ꎮ
２.２ 白及根和叶中内生真菌的分布
４种担子菌均分离于根中ꎬ其中ꎬ蜡壳菌属(Ｓｅ￣
ｂａｃｉｎａ ｓｐ.１)(ＢＳ１１)、Ｓｅｂａｃｉｎａ ｓｐ.２(ＢＳ１２)、Ｓｅｂａｃｉｎａ
ｓｐ.３ ( ＢＳ１３) 等 ３ 种和胶膜菌属 ( Ｔｕｌａｓｎｅｌｌａ ｓｐ.)
(ＢＳ１４)１ 种ꎮ 另外ꎬ２ 种镰孢菌属(Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｐ.１)
５３８７期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 韦艳梅等: 白及内生真菌多样性研究
(ＢＳ７)和 ｓｐ. ２ (ＢＳ８)、１ 种背芽突霉属(Ｃａｄｏｐｈｏｒａ
ｓｐ.) (ＢＳ１)、２ 种刺盘孢菌属(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ. １)
(ＢＳ２)和 Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ.２ (ＢＳ３)、２ 种柱孢菌属
(Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ ｓｐ. １) ( ＢＳ５)、 Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ ｓｐ. ２
(ＢＳ６)和 １ 种轮枝孢菌属(Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ.) (ＢＳ１５)
由根组织中分离获得ꎮ 从叶片分离到 １种刺盘孢菌
属(Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｓｐ. ３) ( ＢＳ３)、１ 种黑团孢霉属
(Ｐｅｒｉｃｏｎｉａ ｓｐ.) (ＢＳ１０)、１ 种球座菌属(Ｇｕｉｇｎａｒｄｉａ
ｓｐ.) (ＢＳ９)ꎮ
２.３ 白及内生真菌多样性
内生真菌的 Ｓｈａｎｎｏｎ￣Ｗｉｅｎｅｒ 多样性指数 Ｈ ＝
１.４８３ꎬ其中ꎬ根组织中内生真菌的 Ｓｈａｎｎｏｎ￣Ｗｉｅｎｅｒ
多样性指数 Ｈ＝ １.８６３８ꎬ叶组织中 Ｓｈａｎｎｏｎ￣Ｗｉｅｎｅｒ多
样性指数 Ｈ＝ １.０９８ꎮ
３　 讨论与结论
对广西野生白及根和叶组织中内生真菌的分离
和鉴定结果表明ꎬ不同组织器官中的内生真菌的数
量和种类及多样性存在较大的差异ꎮ 这种差异性的
出现在以往的研究中得到证实ꎮ 谭小明等(２０１４)
从濒危药用植物八角莲根茎叶中分离到内生真菌以
根中最多ꎮ 而陈佳昕等(２００８)从药用植物茅苍术
叶中分离到 １４ 株内生真菌ꎬ而根和茎各只有一株ꎻ
周雅琴等(２０１５)对广西野生南方红豆杉内生真菌
进行了分离ꎬ从茎中分离获得的内生真菌比根和叶
多ꎮ 这种差异性与不同植物内生真菌对营养需求的
特殊性可能相关ꎻ不同植物生长的宏观因素ꎬ如季
节、年限、干湿等ꎬ以及植物体内微环境如化学成分
组成及植物结构ꎬ也可能是影响植物内生真菌种群
和数量及多样性的重要因子ꎮ
组织块分离法是植物内生真菌多样性研究的方
法之一ꎮ 这一方法可以获得可以培养的内生真菌ꎬ
但由于人工合成培养基的局限性ꎬ不是所有的内生
真菌都能够在人工合成的培养基上生长ꎬ这一类内
生真菌被称为未培养真菌ꎮ Ａｍａｎｎ ｅｔ ａｌ(１９９５)的研
究表明ꎬ自然界中有 ８５％ ~ ９９.９％的内生真菌是无
法在培养基上进行纯培养的ꎮ 近年来ꎬ分子生物学
技术如宏基因组测序方法也常应用于内生真菌多样
性的研究ꎬ让人们能更全面地认识植物内生真菌的
种类和多样性ꎬ当然也包括未培养内生真菌ꎻ但无法
获得可用于培养的内生真菌ꎮ 因此ꎬ组织块分离法
还是目前植物内生真菌研究的主要方法ꎮ
所有兰科植物都与菌根真菌存在密切的共生关
系ꎮ 这些菌根真菌大多属于担子菌ꎮ 在本研究中ꎬ
从根中分离获得 ３种蜡壳菌属真菌和 １种胶膜菌属
(Ｔｕｌａｓｎｅｌｌａ)真菌ꎮ 研究表明ꎬ蜡壳菌属和胶膜菌属
真菌是兰科植物菌根真菌中常见的种类 ( Ｎｏｎ￣
ｔａｃｈａｉｙａｐｏｏｍ ｅｔ ａｌꎬ ２０１０)ꎬ这些真菌有的可以促进
植物种子的萌发ꎬ有的可以促进植物生物量的增加ꎬ
或增强植物的抗逆能力ꎮ 因此ꎬ开展蜡壳菌属和胶
膜菌属真菌与白及植物的共生关系研究ꎬ将是下一
步工作的重点ꎮ
参考文献:
ＡＭＡＮＮ ＲＩꎬ ＬＵＤＷＩＧ Ｗꎬ ＳＣＨＬＥＩＦＥＲ Ｋꎬ ｅｔ ａｌꎬ １９９５.
Ｐｈｙｌｏｇｅｎｔｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎ ｓｉｔｕ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ ｍｉ￣
ｃｒｏｂｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈｏｕｔ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ [ Ｊ]. Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖꎬ ５９(１):
１４３－１６９.
ＢＡＩＬＥＹ ＪＡꎬ ＪＥＧＥＲ ＭＪꎬ１９９２. Ｃｏｌｌｅｃｔｏｔｒｉｃｈｕｍ: ｂｉｏｌｏｇｙꎬ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ
ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ [ Ｍ ]. Ｗａｌｌｉｎｇｆｏｒｄꎬ ＵＫ: ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｐｒｅｓｓ:１－４６.
ＣＨＥＮ Ｊꎬ ＤＯＮＧ ＨＬꎬ ＭＥＮＧ ＺＸꎬ ｅｔ ａｌꎬ２０１０. Ｃａｄｏｐｈｏｒａ ｍａｌｏｒｕｍ
ａｎｄ Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｏｐｓｉｓ ｅｒｉｃａｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ
Ｏｒｃｈｉｄａｃｅａｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ [Ｊ]. Ｍｙｃｏｔａｘｏｎꎬ １１２: ４５７－４６１.
ＣＨＥＮ ＪＸꎬ ＤＡＩ ＣＣꎬ ＬＩ Ｘꎬｅｔ ａｌꎬ２００８. Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
ｆｒｏｍ Ａｔｒａｃｔｙ ｌａｎｃｅａ ａｎｄ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｇ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｈｏｓｔ ｐｌａｎｔｌｅｔ
[Ｊ]. Ｇｕｉｈａｉａꎬ ２８(２): ２５６－２６０. [陈佳昕ꎬ戴传超ꎬ李霞ꎬ等ꎬ
２００８.茅苍术内生真菌的分离鉴定及在组培苗中的回接
[Ｊ].广西植物ꎬ ２８(２): ２５６－２６０.]
ＥＬＬＩＳ ＭＢꎬ １９７１. Ｄｅｍａｔｉａｃｅｏｕｓ ｈｙｐｈｏｍｙｃｅｔｅｓ [ Ｍ]. Ｅｎｇｌａｎｄ:
ＣＡＢＩ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ: １－６０８.
ＧＵＯ ＳＸꎬ ＣＡＯ ＷＱꎬ２０００. Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｍｙｃｏ￣
ｒｈｉｚａｌ ｆｕｎｇｉ ｆｒｏｍ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｃａｎｄｉｄｕｍ ａｎｄ Ｄ. ｎｏｂｉｌｅ [Ｊ]. Ｃｈｉｎ
Ｍ Ｊ Ｃｈｉｎ Ｍａｔ Ｍｅｄꎬ ２５(６): ３３８－３４０.
ＬＩＵ ＧＢꎬＨＵＡＮＧ ＺꎬＨＵＡＮＧ ＣＧꎬｅｔ ａｌꎬ２００５. Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉ￣
ｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｓｍｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｂｌｅｔｉｌｌａ ｓｔｒｉａｔａ ( ｔｈｕｎｂ ) ｒｅｉｃｈｂ. Ｆ
[Ｊ]. Ｄｅｔｅｒｇ ＆ Ｃｏｓｍꎬ２８(８): ２２－２４. [刘光斌ꎬ黄忠ꎬ黄长干ꎬ
等ꎬ２００５. 天然植物白芨胶的功能及在化妆品中的应用
[Ｊ].日用化学品科学ꎬ２８(８): ２２－２４.]
ＬＵ ＧＹꎬＹＡＮＧ Ｘꎬ ＪＩＡＮＧ ＲＢꎬｅｔ ａｌꎬ２０１５. Ｒａｐｉｄ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｂｌｅｔｉｌｌａ ｓｔｒｉａｔａ [Ｊ]. Ｊ Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖ Ｔｒａｄ Ｃｈｉｎ Ｍｅｄꎬ３９(５):
３８３－３９０. [鲁光耀ꎬ杨仙ꎬ蒋瑞彬ꎬ等ꎬ２０１５.白芨组培快速繁
殖体系研究 [Ｊ].浙江中医药大学学报ꎬ３９(５): ３８３－３９０.]
ＮＯＮＴＡＣＨＡＩＹＡＰＯＯＭ ＳꎬＳＡＳＩＲＡＴ ＳꎬＭＡＮＯＣＨ Ｌꎬｅｔ ａｌꎬ２０１０. Ｉ￣
ｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ￣ｌｉｋｅ ｆｕｎｇｉｆｒｏｍ ｒｏｏｔｓ ｏｆ
ｔｈｒｅｅ Ｏｒｃｈｉｄ ｇｅｎｅｒａꎬ Ｐａｐｈｉｏｐｅｄｉｌｕｍꎬ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍꎬ ａｎｄ Ｃｙｍｂｉｄ￣
ｉｕｍꎬ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ Ｃｈｉａｎｇ Ｒａｉ ａｎｄ Ｃｈｉａｎｇ Ｍａｉ ｐｒｏｖｉｎｃｅｓ ｏｆ Ｔｈａｉ￣
ｌａｎｄ [Ｊ]. Ｍｙｃｏｒｒｈｉｚａꎬ ２０: ４５９－４７１.
ＰＩＥＬＯＵ ＥＣꎬ １９７５. Ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ [ Ｍ]. Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ: Ｊｏｈｎ
Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ: １－１６５.
ＳＥＬＯＳＳＥ Ｍ Ａꎬ ＢＯＵＬＬＡＲＤ Ｂꎬ ＲＩＣＨＡＲＤＳＯＮ Ｄꎬ ２０１１. Ｎｏëｌ
Ｂｅｒｎａｒｄ (１８７４－１９１１): Ｏｒｃｈｉｄｓ ｔｏ ｓｙｍｂｉｏｓｉｓ ｉｎ ａ ｄｏｚｅｎ ｙｅａｒｓꎬ
ｏｎｅ ｃｅｎｔｕｒｙ ａｇｏ [Ｊ]. Ｓｙｍｂｉｏｓｉｓꎬ ５４(２): ６１－６８.
ＳＴＡＴＥ ＰＨＡＲＭＡＣＯＰＯＥＩＡ ＣＯＭＭＩＴＴＥＥꎬ ２０１５. Ｔｈｅ ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ
(下转第 ８３１页 Ｃｏｎｔｉｎｕｅ ｏｎ ｐａｇｅ ８３１)
６３８ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷