全 文 ：研究报告
Research Report
十字花科黑腐病菌中一个与HR反应相关的小 RNA的鉴定
李良贤 1 肖波 1 黄晓韵 1 唐东阶 1,2*
1广西大学生命科学与技术学院,南宁, 530005; 2亚热带农业生物资源保护利用国家重点实验室,南宁, 530005
*通讯作者, tangdj@gxu.edu.cn
摘 要 十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campertris, 简称 Xcc)可以引起寄主植物萝卜、白
菜、芥菜等十字花科植物的黑腐病，也可以引起非寄主植物辣椒的高敏反应(hypersensitive response, HR)。
最近的研究发现，在一些动植物病原细菌中，除蛋白外，小 RNA也在致病和 HR反应中起关键的作用。但
是，到目前为止，小 RNA是否在 Xcc的致病和 HR反应中起重要作用尚不清楚。在前期工作中，我们采用
RNA深度测序(RNA-Seq)方法，在 Xcc中鉴定了五百多个候选小 RNA，但它们的功能还不清楚。在本研究
中，我们对小 RNA sRXcc52的生物学功能进行了研究，结果发现，小 RNA sRXcc52的过量表达株(OE52)在辣
椒上引起 HR反应的时间比带有一个空的过量表达载体质粒的野生型菌株(WT/pBBad)的时间提前了 2 h。
这个结果表明，sRXcc52与 Xcc的 HR反应有关。我们的结果为深入研究小 RNA在 Xcc的 HR反应中的作
用打下了基础。
关键词 十字花科黑腐病菌,小 RNA,过量表达, HR反应
Identification of a HR-related Small RNA in Xanthomonas campestris
pathovar campestris
Li Liangxian 1 Xiao Bo 1 Huang Xiaoyun 1 Tang Dongjie 1,2*
1 College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning, 530005; 2 State Key Laboratory for Conservation and Utilization of
Subtropical Agro-bioresources, Nanning, 530005
* Corresponding author, tangdj@gxu.edu.cn
DOI: 10.13417/j.gab.034.001443
Abstract Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) causes black rot disease on cruciferous plants such as
turnip and triggers hypersensitive response (HR) on the nonhost plant pepper. Recent studies have been shown that,
in addition to protein, small RNA (sRNA) plays a key role in the pathogenesis and HR of some animal and plant
pathogenic bacteria. However, up to date, whether sRNA is involved in the pathogenesis and HR of Xcc is till
unclear. In a previous work, we identified more than 500 sRNAs in Xcc by RNA-seq. In this work, we
investigate the biological function of the sRNA sRXcc52 and found that the over-expression strain (OE52) of this sRNA
displays an enhanced HR on the nonhost plant pepper compare to the wild type strain containing a empty
over-expression vector (wt/pBBad), indicating that sRXcc52 is involved in the HR ofXcc. Our results provided the first
step towards the understanding of the role of sRNA in HR of Xcc.
Keywords Xcc, Small RNA, Over-expression, Hypersensitive
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(31260019)资助
基因组学与应用生物学，2015年，第 34卷，第 7期，第 1443-1450页
Genomics and Applied Biology, 2015, Vol.34, No.7, 1443-1450
十字花科黑腐病菌，又名野油菜黄单胞菌致病
变种(Xanthomonas campestris pathovar campestris, 下
文简称为 Xcc)，是引起白菜、甘蓝、拟南芥、萝卜等十
字花科植物黑腐病的病原菌，是研究植物与病原菌
相互作用的重要模式菌种之一。Xcc除了能够感染
寄主植物萝卜、白菜、芥菜等十字花科植物引起黑腐
病外，还可以引起非寄主植物辣椒等的高敏反应(hy-
persensitive response, HR)。研究表明，Xcc的致病和
HR反应都由编码Ⅲ型分泌系统的 hrp基因簇决定
(Büttner and Bonas, 2010)。为了在基因组水平上全面
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
揭示 Xcc致病的分子机制，长期以来，人们对 Xcc
进行了广泛深入的研究，目前，已经测定了 Xcc
ATCC33913 (da Silva et al., 2002)、Xcc8004 (Qian et
al., 2005)和 Xcc B100 (Vorh觟lter et al., 2008)等 6 个
Xcc菌株的全基因组序列，鉴定了许多致病相关基
因和一些致病生化因子，使人们对 Xcc 的致病系
统和致病调控机理有了较深入的了解(Büttner and
Bonas, 2010)。
小 RNA (small RNA, sRNA)，也叫非编码 RNA
(non-coding RNA)，是细菌细胞中存在的一类相对于
mRNA来说分子比较小(细菌的 mRNA平均长度约
1 000 nt,而绝大多数细菌小 RNA大小在 50~300 nt
之间)，通常不编码蛋白质，但具有独立功能的 RNA
分子，它们在细胞的各种生理过程中发挥着非常重要
的作用(Gottesman, 2005; Mattick and Makunin, 2006)。
已有证据表明，小 RNA在人和动物病原微生物的致
病过程中起非常重要的作用 (Toledo-Arana et al.,
2007)。值得注意的是，尽管目前人们已经在人和动
物病原细菌中发现了大量与致病相关的小 RNA，但
对小 RNA在植物病原细菌致病和 HR过程中的作
用还知之甚少。为了了解 Xcc基因组中编码小 RNA
的数量，在前期工作中，我们课题组采用 RNA深度
测序(RNA-seq)的方法，对 Xcc 8004 菌株(Xcc8004)
在MMX基本培养基中生长的对数期表达的小 RNA
进行了鉴定，发现了五百多个候选小 RNA，但这些
小 RNA的生物学功能尚不清楚。本研究中，我们采
用过量表达方法对小 RNA sRXcc52的生物学功能进
行了研究，结果发现，与携带有一个空的过量表达载
体质粒(pBBad18k)的野生型菌株(WT/pBBad)相比，
小 RNA sRXcc52的过量表达株(OE52)在辣椒上引起
HR反应的时间提前了 2 h，证明 sRXcc52 与 Xcc 的
HR反应有关。
1结果与分析
1.1 sRXcc52过量表达株 OE52的构建
sRXcc52 长度为 68 nt，编码它的基因位于基因
XC1450与 XC1451的间隔区，转录方向为正向，转录
起始位点为 1747942，转录终止位点为 1748009，转
录方向为正向(图 1)。XC1450编码胞外丝氨酸蛋白
酶(extracellular serine protease)；XC1451 编码依赖于
TonB的受体蛋白(TonB-dependent receptor) (Qian et
al., 2005)。
目前鉴定小 RNA生物学功能的方法主要有缺
失和过量表达两种方法。本研究中，我们决定采用过量
表达来研究 sRXcc52的生物学功能。为了获得 sRXcc52
的过量表达株，我们首先根据 Xcc8004基因组序列
设计引物 sR52F (CCGGAATTCGCTGGTCCTCGAT
CGGCTCCCCT)和 sR52R(CCCAAGCTTCAACCC
GACGTGACTGACAT)用于扩增 68 bp的 sRXcc52编
码序列以及 sRXcc52基因的转录终止序列(sRXcc52基
因下游 100 bp)。接着将 PCR扩增获得的 168 bp的
DNA 片段克隆在过量表达载体质粒 pBBad18K
(Sukchawalit et al., 1999)的 EcoRⅠ/HindⅢ位点上，获
得重组质粒 pBsR52。接着，通过三亲本结合的方法，
将重组质粒导入野生型的 Xcc8004中，获得 sRXcc52
的过量表达株，经验证后命名为 OE52。同时，我们将
pBBad18K空载体导入到野生型 Xcc8004中，获得过
量表达株表型分析的对照菌株 wt/pBBad。
为了证明过量表达株 OE52 中，目标小 RNA
sRXcc52确实以经过量表达，我们提取了过量表达株
OE52和对照菌株 wt/pBBad 的总 RNA进行半定量
RT-PCR来检测和比较 sRXcc52在这两个菌株中的表
达水平。RT-PCR结果显示，sRXcc52在 OE52中的表
达量远远高于其在 wt/pBBad 中的表达量(图 2)，说
明过量表达株已经构建成功。
1.2 sRXcc52过量表达对生长没有影响
为了了解 sRXcc52是否与 Xcc的生产繁殖有关，
我们检测和比较了过量表达株 OE52 和对照菌株
wt/pBBad在基本培养基MMX和丰富培养基 NYGB
图 1 sRXcc52在 Xcc8004基因组上的位置
注:两侧的浅灰色箭头表示 sRXcc52基因上下游注释的编码蛋
白基因;箭头内部的数字表示该基因编号;中间的黑色箭头表
示 sRXcc52基因;旁侧数字表示 sRXcc52与上下游基因的距离;竖
线上方数字表示 sRXcc52的转录起始位点和终止位点
Figure 1 Genetic organization of the sRXcc52 locus in Xcc8004
genome
Note: The two light gray arrows represent the up- and down-stream
protein-coding genes of sRXcc52, respectively; The number inside
the arrow is the gene ID number; The middle black arrow repre-
sents the sRXcc52 gene, and the flanking number indicates the spa-
cer to the up- and down-stream gene; The number above the ver-
tical line indicates the transcription start and stop site of sRXcc52;
respectively
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十字花科黑腐病菌中一个与 HR反应相关的小 RNA的鉴定
Identification of a HR-related Small RNA in Xanthomonas campestris pathovar campestris
中的生长曲线。由于 sRXcc52克隆在过量表达载体中
的一个受阿拉伯糖诱导的启动子后面，sRXcc52的过量
表达需要阿拉伯糖诱导(Sukchawalit et al., 1999)。因
此，在生长曲线鉴定时，培养基中要加入 0.02%的 L-
阿拉伯糖。生长曲线鉴定按“材料与方法”中描述的方
法进行。结果显示，无论是在基本培养基MMX还是
在丰富培养基 NYGB中过量表达株 OE52和对照菌
株 wt/pBBad的生长曲线基本重合(图 3)，证明这两个
菌株的生产没有显著差别，说明 sRXcc52在 Xcc的生
产繁殖中没有作用或者只有微弱的作用。
1.3 sRXcc52 过量表达增强了 Xcc 引起非寄主植物
HR反应的能力
为了了解 sRXcc52在致病和 HR中的作用，我们
比较了过量表达株 OE52 和对照菌株 wt/pBBad 在
寄主植物萝卜(R. sativus L. var. radiculus Pers.) (品种
满身红)上的致病力和在非寄主植物辣椒 ECW10R
(Capsicum annuum cv. ECW-10R)上引起 HR反应的
能力。致病和 HR检测按‘实验材料和方法’中描述
的方法进行。致病力检测实验结果显示，在接种后
10 d，接种过量表达株 OE52的萝卜叶片的平均病斑
长度为 15.97 mm，接种对照菌株 wt/pBBad的萝卜叶
片的平均病斑长度为 17.16 mm (图 4)。统计分析结
果显示，这两个病斑长度没有显著差异，说明 sRXcc52
在 Xcc的致病中没有作用或者只有微弱的、在我们
的实验条件下检测表达的作用。HR反应检测结果显
示，接种过量表达株 OE52的辣椒叶片在接种后 8 h
就出现 HR反应斑，而此时接种对照菌株 wt/pBBad
的辣椒叶片没有观察到任何症状；直到接种后 10 h
的时候，接种对照菌株 wt/pBBad的辣椒叶片才出现
弱 HR反应症状，而此时接种过量表达株 OE52的辣
椒叶片的 HR反应症状已经很重了(图 5)。这些结果
图 2 sRXcc52表达的半定量 RT-PCR检测
注:将 OE52和 wt/pBBad在 NYGB培养基中培养过夜,然后
按照 10%的接种量转接至新的 NYGB培养基中培养 16 h后加
入终浓度为 0.02%的 L-阿拉伯糖诱导培养2 h,然后收集细胞
并提取总 RNA进行半定量 RT-PCR;半定量 RT-PCR用 Fer-
mentas公司的 First strand cDNA synthesis试剂盒按厂家的说
明书进行(检测 sRXcc52的引物为 sR52F (CCGGAATTCGCTGG
TCCTCGATCGGCTCCCCT)和 sR52R (CCCAAGCTTCAACC
CGACGTGACTGACAT),检测 16S rRNA的引物为 16SF: GC
CTAACACATGCAAGTCGAACGGC和 16SR: AATATTCCC
CACTGCTGCCTCCCG);取 10μL半定量 RT-PCR产物用 1.5%
的琼脂糖凝胶进行电泳检测
Figure 2 Test of sRXcc52 expressing levels by semi-quantitative
RT-PCR
Note: OE52 andWT/pBBad were grown in NYGB for sixteen ho-
urs, and then 0.02% L-Arabinose (final concentration) was added
into the culture and continued cultured for two hours, and cells
were collected and total RNA were isolated; The RNA was used
for semi-quantitative RT-PCR; Semi-quantitative RT-PCR were
performed using the First strand cDNA synthesis kit according to
Manufacturers instructions; The primers used for the semi-quanti-
tative RT-PCRwere: sR52F (CCGGAATTCGCTGGTCCTCGA
TCGGCTCCCCT) and sR52R (CCCAAGCTTCAACCCGACGT
GACTGACAT) (for sRXcc52), and 16SF (GCCTAACACATGCA
AGTCGAACGGC) and 16SR (AATATTCCCCACTGCTGCCT
CCCG) (for 16S rRNA); 10μLRT-PCR product was analyzed usi-
ng 1.5% agarose gel electrophoresis
图 3 过量表达株 OE52 和对照菌株 wt/pBBad 在 NYGB 和
MMX培养基中的生长曲线
注:生长曲线鉴定在细菌生长鉴定仪器 Bioscreen C中,按厂
家的操作说明书进行;具体的实验流程在“材料与方法”中有
较详细的描述
Figure 3 Growth curves of over-expression strain OE52 and the
control strain in NYGB and MMX medium
Note: Growth curves were done by using the bacteria growth test-
ing equipment Bioscreen C following Manufacturers instruc-
tions; See‘Materials and Methods’for more detail
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基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
说明，OE52激发辣椒叶片的 HR反应的时间提前约
2 h而且强度加强，证明 sRXcc52在 Xcc的 HR中起重
要作用。
1.4 sRXcc52 的过量表达不影响 Xcc 的胞外酶和胞外
多糖的产量和活性
胞外酶(主要是胞外蛋白酶,胞外淀粉酶和胞外
胞外纤维素酶)和胞外多糖 EPS (extracellular polysa-
ccharide)是 Xcc的重要致病因子。为了弄清 sRXcc52
是否参与这些致病因子的合成过程，我们检测和比
较了过量表达株 OE52 和对照菌株 wt/pBBad 的胞
外蛋白酶、胞外淀粉酶和胞外胞外纤维素酶的活性
以及胞外多糖 EPS的产量。胞外酶活性和胞外多糖
产量的检测按“材料与方法”中描述的方法进行。检
测结果显示，过量表达株 OE52和对照菌株 wt/pB-
Bad的胞外蛋白酶、胞外淀粉酶和胞外胞外纤维素
酶的活性以及胞外多糖 EPS的产量没有明显的差异
(图 6)，说明 sRXcc52不参与这些致病因子的产生过程
或者不起主要作用。
1.5 sRXcc52过量表达不影响 Xcc 的游动性和生物膜
形成
研究表明，细菌的运动性和生物膜形成有关联，
而且都与致病有关。为了明确 sRXcc52在 Xcc的运动
和生物膜形成过程中的作用，我们检测和比较了过
量表达株 OE52 和对照菌株 wt/pBBad 的运动能力
和生物膜形成情况。细胞运动能力和生物膜形成的
检测按“材料与方法”中描述的方法进行。检测结果
显示，过量表达株 OE52和对照菌株 wt/pBBad的运
动能力和生物膜形成能力没有明显差异(图 7)，说明
sRXcc52在 Xcc的细胞运动和生物膜形成过程中没有
作用或者只有微弱作用。
图 4过量表达株 OE52和对照菌株 wt/pBBad的致病力检测
注: OE52和WT/pBBad在 NYGB培养基中培养 16 h后加入
终浓度为 0.02%的 L- 阿拉伯糖进行诱导2 h, 再用含有
0.02% L- 阿拉伯糖的NYGB培养基统一调菌液 OD600值为
0.001,然后用剪叶法接种到萝卜叶片上, 28℃恒温室中避光
保湿 1 d后正常光照培养 10 d后量取病斑的长度,并用软件
Spss 18进行统计学分析
Figure 4 Virulence assay of the over-expression strain OE52 and
the control strain wt/pBBad
Note: OE52 and WT/pBBad were grown in NYGB for sixteen
hours, and then 0.02% L-arabinose (final concentration) was a-
dded into the culture and continued cultured for two hours; The
cell density of the culture was adjusted to OD600=0.001 and the
culture were inoculated into turnip leaves by leaf-clipping; After
maintenance in 100% humidity for 24 h, the inoculated plants
were maintained in greenhouse, and lesion length was measured
10 days post-inoculation; Data were statistical analyzed using
SPSS 18 software
图 5 过量表达株 OE52 和对照菌株 wt/pBBad 的 HR 反应检
测
注:将WT/pBBad和 OE52接种于 NYGB培养基中培养 16 h
后加入终浓度为 0.02%的 L- 阿拉伯糖进行诱导, 继续培养
2 h后用含有 0.02%的 L-阿拉伯糖的PBS缓冲液将它们的
菌体密度调至 OD600=0.01;然后用无菌无针头的注射器将大
约 50 μL菌液从辣椒苗背面压渗进叶肉组织内;接种后的辣
椒置于室温光照条件下生长并持续观察和拍照
Figure 5 HR assay of the over-expression strain OE52 and the
control strain wt/pBBad
Note: OE52 and WT/pBBad were grown in NYGB for sixteen
hours, and then 0.02% L-arabinose (final concentration) was added
into the culture and continued cultured for two hours; The cell
density of the culture was adjusted to OD600=0.001 using PBS
buffer containing 0.02%L-arabinose (final concentration) and appr-
oximately 50 μL bacterial culture was infiltrated into the abaxial
leaf surface of pepper plants using a blunt end plastic syringe; The
inoculated plants were maintained in a greenhouse and HR
symp toms were observed and photographed continually 6 hours
post-inoculation
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2讨论
10年前，由于没有有效的方法，细菌小 RNA的
鉴定曾经是一个难题，但是近年来，随着基于第二代
测序技术的 RNA深度测序(RNA-seq)技术成功用于
细菌小 RNA的鉴定(Croucher and Thomson, 2010)，细
菌小 RNA的鉴定变得比较容易，因此大量的细菌小
RNA随之被鉴定出来。但是，由于以下原因：(1)编码
小 RNA的基因很小，因此在进行化学诱变和转座子
随机插入突变时不容易突变；(2)由于编码小 RNA的
基因没有读码框结构，因此它们是抗移码突变的；(3)
小 RNA的功能往往是负作用而且是微效的，因此缺
失突变不容易检测到表现型的变化；(4)小 RNA的
基因通常位于编码蛋白的基因的间隔区，甚至和编
码蛋白的基因重叠，因此它们的缺失会影响到其它
基因；使得小 RNA的功能鉴定成了难题。因此，在已
经鉴定的八百多个细菌小小 RNA中，只有少数小
RNA的功能已被阐明(Waters and Storz, 2009; Li et al.,
2013)。此外，尽管小 RNA在人和动物病原细菌致病
过程中的重要作用已经得到充分的了解，可是小
RNA在植物病原细菌的致病过程和 HR反应中所起
的作用还知之甚少。小 RNA sRXcc52是我们之前采用
RNA深度测序(RNA-Seq)方法在 Xcc8004中发现的
五百多个候选小 RNA之一。为了明确 sRXcc52的生
物学功能，在本研究中，我们构建了 sRXcc52的过量表
达株(OE52)并进行了一系列的表型分析，结果发现，
过量表达株 OE52在辣椒上引起 HR反应的时间比
带有一个空的过量表达载体质粒的野生型菌株
(WT/pBBad)的时间提前了 2 h，强度也明显增强。这
些结果说明，sRXcc52 在 Xcc 的 HR 反应中有重要作
用。我们的结果为深入研究小 RNA在 Xcc的 HR反
应中的作用提供了很好的材料。
研究表明，不管是在真核还是原核生物中，大多
数小 RNA在细胞生理过程中的具体作用主要是调
控基因的表达，所以小 RNA 也被称为调控 RNA
图 6过量表达株 OE52和对照菌株 wt/pBBad的胞外酶和胞
外多糖平板检测
注: OE52和WT/pBBad在 NYGB培养基中培养 16 h后加入
终浓度为 0.02%的 L-阿拉伯糖诱导2 h, 然后用含有 0.02%
的 L- 阿拉伯糖的NYGB 培养基将菌体调菌液 OD600 值为
1.0,用移液器吸取 2 μL菌液接种到含有 0.04%的 L-阿拉伯
糖以及 0.1%可溶性淀粉, 0.5%羧甲基纤维素, 1%脱脂牛奶或
者含有 2%葡萄糖的 NYGA平板上,置于 28℃培养箱中倒置
培养; EPS和不同胞外酶检测平板的后期处理按“材料与方
法”中描述的方法进行
Figure 6 Plate assay of extracellular enzyme activity and EPS
production of the over-expression strain OE52 and the control
strain wt/pBBad
Note: OE52 and WT/pBBad were grown in NYGB for sixteen
hours, and then 0.02% L-arabinose (final concentration) was added
into the culture and continued cultured for two hours; The cell
density of the culture was adjusted to OD600=1.0 and two micro-
liters of the culture was spotted onto NYG plates containing 0.04%
L-arabinose (final concentration) and 0.1% starch, 0.5% sodium
carboxymethyl cellulose, 1.0% milk, or 2% glucose and incubated
at 28℃; See‘Materials and Methods’for more detailed informa-
tion about the EPS and extracellular enzymes meansurments
图 7过量表达株 OE52和对照菌株 wt/pBBad的运动能力和
生物膜形成检测
注: OE52和WT/pBBad在 NYGB培养基中培养 16 h后加入
终浓度为 0.04%的 L-阿拉伯糖诱导2 h;然后将菌液浓度调
至 OD600=1.0, 接着用移液枪吸取 2 μL菌液点在含有 2%葡萄
糖和 0.04%L-阿拉伯糖的软琼脂NYGA平板上(0.03%琼脂粉),
静置培养 2 d后取出观察结果并照相
Figure 7 Test of cell motility and biofilm formation of the
over-expression strain OE52 and the control strain
Note: OE52 and WT/pBBad were grown in NYGB for sixteen
hours, and then 0.02% L-Arabinose (final concentration) was ad-
ded into the culture and continued cultured for two hours; The
cell density of the culture was adjusted to OD600=1.0 and two mi-
croliters of the culture were spotted onto NYG plates containing
2% glucose and 0.3% agar; After incubated at 28℃ for 2 days the
plates were observed and photographed.
十字花科黑腐病菌中一个与 HR反应相关的小 RNA的鉴定
Identification of a HR-related Small RNA in Xanthomonas campestris pathovar campestris 1447
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
(regulatory RNA) (Waters and Storz, 2009)。小 RNA
调控基因表达的机制主要有两种：一是(绝大多数小
RNA)通过碱基配对方式与靶标 mRNA结合从而影
响靶标 mRNA的翻译或 /和稳定性；二是(少数几个
小 RNA)通过与调控蛋白(如 CsrA/RsmA)或 RNA聚
合酶结合从而影响靶标蛋白的活性(Waters and Storz,
2009)。因此，我们推测 sRXcc52过量表达导致 HR反应
提前和增强的原因是某个(些)与 HR有关的基因(如
hrp基因)受 sRXcc52调控。为此，我们使用 microRNA
靶标预测软件 sRNAtarget 2.0对 sRXcc52的直接调控
靶标进行了预测，结果发现，有 6个已知的与 HR有
关的基因(分别是: hrpB1, hrpB6, hrpD5, hrpE, hrpW
和 hrpG)可能是 sRXcc52 的靶标。因此，很有可能
sRXcc52通过调控这些 hrp基因的表达来影响 HR反
应。但 sRXcc52是否真的调控这些 hrp基因的表达还
需要进一步的验证。
3材料与方法
3.1菌株和质粒
本实验使用的菌株和质粒如表 1所示。
3.2细菌的培养
大肠杆菌的培养：液体培养：将大肠杆菌按照
1%的接种量接种到含有相应抗生素的 LB培养基中
(每升培养基含 10.0 g胰蛋白胨, 5.0 g酵母提取物,
10.0 gNaCl, 1.0 g葡萄糖, pH 7.0)，置于 37℃、200 r/min
摇床培养 12~15 h。固体平板培养：将大肠杆菌接种
于含有相应抗生素的 LA平板上(LB+1%琼脂粉)，置
于 37℃恒温培养箱中培养 12~18 h。
黄单胞菌的培养：液体培养：挑取适量平板培养
的新鲜黄单胞菌接种到含有相应抗生素的 NYGB丰
富培养基(每升培养基含 5.0 g蛋白胨, 3.0 g酵母粉,
20.0 g甘油, pH=7.0)或基本培养基 MMX (每升培养
基含 5.0 g葡萄糖, 1.0 g柠檬酸三钠, 2.0 g硫酸铵,
4.0 g磷酸氢二钾, 6.0磷酸二氢钾, 0.2 g七水硫酸镁,
pH=7.0)中，然后置于 28℃、200 r/min 摇床培养(在
NYGB中培养 16~18 h;在MMX中培养 72 h左右)。
固体平板培养：用接种环挑取适量黄单胞菌以划线
法接种到含有适量抗生素的 NYGA或MMX平板上
(含 1%琼脂粉)，然后置于 28℃恒温培养箱中培养(在
NYGA中培养 1~2 d;在MMX中培养 3~4 d)。
菌株和质粒
Strains and plasmids
大肠杆菌
Escherichia coli
DH5α
ED8767
DH5α/pBsRXCC52
十字花科黑腐病菌
Xcc
Xcc8004
Wt/PBBad
OE52
质粒
Plasmid
PRK2073
pBBad18K
pKsBXCC52
特征
Relevant characteristics
Φ80, Δ (lacZ) M15, gyrA96, recA1,endA1, thi-1, hsdR17
RecA, met,含有帮助质粒 pRK2073, Spcr
RecA, met, contains the helper plasmid pRK2073, Spcr
DH5α中含有 pBsRXCC52质粒, Kmr , Gmr
DH5α containing plasmid pBsRXCC52, Kmr , Gmr
十字花科黑腐病菌野生型菌株, Rifr
Xcc wild type strain, Rifr
Xcc8004带有 pBBad18K质粒, Kmr, Rifr
Xcc8004 containing plasmid pBBad18K, Kmr, Rifr
Xcc8004带有 pBsRXCC52质粒, Kmr, Rifr
Xcc8004containing plasmid pBsRXCC52, Kmr, Rifr
帮助质粒, Tra+, Mob+, ColEl, Spcr
Helper plasmid, Tra+, Mob+, ColEl, Spcr
L-阿拉伯糖诱导表达载体, Kmr
Arabinose-induced expression vactor, Kmr
sRXCC52基因序列克隆在 pBBad18K的多克隆位点上, Kmr
sRXCC52 cloning into the MCS of pBBad18K, Kmr
来源或参考文献
Source or reference
Gibco BRL company
实验室保存
Laboratory storage
本工作
This work
Daniels et al., 1984
本工作
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本工作
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Leong et al., 1982
实验室保存
Laboratory storage
本工作
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表 1本实验所用菌株和质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
1448
3.3三亲结合
将新鲜的供体菌、受体菌和帮助菌从平板上转
接于 10 mL含相应抗生素的液体培养基中，大肠杆
菌置于 37℃、200 r/min摇床培养 12~15 h，黄单胞菌
置于 28℃、200 r/min摇床培养 16~18 h，然后分别离
心收集受体菌 1.5 mL菌液并用生理盐水洗 2次；收
集帮助菌 0.75 mL并用生理盐水洗 1次；收集供体
菌 1.5 mL。接着将三种菌体混合于同一 EP管内，用
NYGB 培养基洗一次后将混合的菌体用 NYGB 悬
浮均匀，离心 1 min，去掉上清，留少量液体重悬菌
体。最后用移液器吸取混匀的菌体并点在不加任何
抗生素的 NYGA平板上的硝酸纤维素膜上，待液体
吸干后置于 30℃温箱中倒置培养，1~2 d后将硝酸
纤维素膜连同菌体一同取下放入一干净无菌的 EP
管中，加入适量的 NYGB，将菌体从膜上洗下并吹打
混匀，然后取适量菌液涂布在含有相应抗生素的筛
选平板上，28℃温箱倒置培养 2~4 d后筛选结合子。
3.4生长检测
采用Bioscreen C细菌生长测定仪对 Xcc菌株在
NYGB和MMX培养基中的生长曲线进行测定。首
先挑取适量待测菌株接种到含有适量抗生素的培养
基中，置于 28℃、200 r/min摇床中培养 14~18 h后将
菌体密度调 OD600=1.0，再按照 1%的接种量分别接种
到含有终浓度为 0.02%的 L-阿拉伯糖的NYGB培
养基中。或离心收集菌体并用 MMX培养基洗涤菌
体两次后统一调菌液 OD600=1.0，再按照 10%的接种
量分别接种到含有终浓度为 0.02%的 L-阿拉伯糖的
MMX培养基中。将上述接种好的菌液各取 300 μL
放入 Bioscreen C专用培养板中(每个菌重复 3次)，
然后放入仪器 Bioscreen C中进行生长曲线测定。接
种于 NYGB培养基的菌液设定程序为每 4 h测定一
次 OD600值，一直测定到 72 h时 OD600值开始降低为
止。接种于 MMX培养基的菌液设定程序为每 12 h
测定一次 OD600值，一直测定到 168 h时 OD600值开始
降低为止，最后将测定结果用统计学方法作曲线图分
析，以测定时间为横坐标，以 OD600为纵坐标作图。
3.5致病力检测
本实验选取满身红萝卜(Raphanus sativus L. var.
radiculus Pers.)作为实验植株。选取 5叶期，生长基本
一致的植株进行致病性检测。测定并稀释过夜培养
的待测菌株与对照菌株的 OD600=0.001。采用剪叶法
进行接种，选择植株的第三、四张叶子，用灭过菌的剪
刀浸入菌液中蘸取适量菌液，然后在距离叶尖 1~2 cm
的位置垂直于中脉缓慢剪下叶尖，剪的时候稍微停
顿几秒，让菌液充分接触叶片伤口。通过剪叶接种后
需要避光保湿 24 h，置于 28℃的温度下培养 10 d，然
后摘取接种过的萝卜叶片，测量萝卜叶片的病斑长
度并照相保存实验结果。
3.6 HR反应检测
HR反应检测使用的非寄主植物为辣椒 ECW-10R
(Capsicum annuum cv. ECW-10R)，植株栽种至成株
期并选取 6~8叶龄的全展叶进行 HR反应检测。首
先用磷酸缓冲液将过夜培养的待测菌株稀释至
OD600=0.01。用 1 mL无针头的无菌注射器吸取菌液
并将菌液缓慢压渗到辣椒叶背面的叶肉内，然后将
接种后的辣椒苗置于光照下培养，6 h 后开始每隔
1 h来观察记录并照相保存实验结果。
3.7胞外酶检测
胞外淀粉酶的平板检测方法：测定并统一把过夜
培养的实验菌株 OD600值调为 1.0，用移液器小心吸取
2μL上述菌液，点在含有 0.1%淀粉的 NYGA平板上，
待平板晾干后倒置于 28℃温箱培养 24 h后，用 1:100
的 I2/KI (0.08 MI2, 3.2 MKI)溶液染色 10 min，然后用
70%乙醇清洗，观察记录并照相保存结果。
胞外纤维素酶的平板检测方法：测定并统一把
过夜培养的实验菌株 OD600值调为 1.0，用移液器小
心吸取 2 μL上述菌液，点在含 0.5%羧甲基纤维素的
NYGA培养板上，等菌液被吸干后再放置于 28℃温
箱中倒置培养 24 h左右，然后用 0.1%刚果红溶液对
上述平板进行染色，时间为 30 min，慢慢倒掉并用
1 mol/L NaCl 脱色两次(每次 20 min)后观察记录并
照相保存结果。
胞外蛋白酶的平板检测方法：测定并统一把过
夜培养的实验菌株 OD600值调为 1.0，用移液器小心吸
取 2 μL上述菌液，点在含有 1%脱脂牛奶的 NYGA
平板上，待平板晾干后倒置于 28℃温箱培养 48 h，取
出平板观察记录并照相保存结果。
3.8胞外多糖检测
胞外多糖的平板检测方法：测定并统一把过夜
培养的实验菌株 OD600值调为 1.0，用移液器小心吸
取 2 μL上述菌液，点在含有 2%葡萄糖的 NYGA平
板上，待平板晾干后倒置于 28℃温箱培养 48 h后，
取出置于室温下见光培养 2~3 d，观察记录并照相保
存结果。
十字花科黑腐病菌中一个与 HR反应相关的小 RNA的鉴定
Identification of a HR-related Small RNA in Xanthomonas campestris pathovar campestris 1449
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
3.9运动能力检测
测定并统一把过夜培养的实验菌株 OD600值调
为 1.0，用移液器小心吸取 2 μL上述菌液，点在含有
0.3%琼脂粉的 NYGA平板上，点样完毕切勿移动平
板，室温下静置培养 2~3 d后观察记录并照相。
3.10分子操作和试剂来源
细菌基因组总 DNA的提取、细菌质粒 DNA的
提取，细菌总 RNA的提取均参考相应试剂盒的使用
说明书进行提取，DNA进行限制性内切酶酶切、连
接、纯化的过程参考相应试剂盒的使用说明书，实验
使用的引物由华大基因公司合成，实验的 DNA测序
也是送给华大基因公司完成。实验过程使用的限制
性内切酶、EX Taq 酶、pfu 酶、T4 连接酶等购自
Promega公司，DNA纯化试剂盒购自天根公司，质粒
提取试剂盒购自 BioFlux。
作者贡献
唐东阶和李良贤是本研究的实验设计和实验研
究的执行人；肖波和黄晓韵参与部分实验；唐东阶和
李良贤完成数据分析，论文初稿的写作；唐东阶是项
目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论
文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金项目(31260019)资助。
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