全 文 ：八角科观赏植物茎尖培养技术的研究
方向明，赵后斌，刘文倩，郑必平，谈建中* (苏州大学建筑与城市环境学院园艺系，江苏苏州 215123)
摘要 ［目的］探讨八角科观赏植物组织培养及快繁技术体系。［方法］以八角科植物“孩儿莲”的顶芽为研究对象，以 MS培养基为基本
培养基，调查了培养基组成及抗褐化剂对顶芽茎尖存活和生长发育的影响。［结果］春季萌动初期的顶芽是八角科植物“孩儿莲”组织
培养的最适外植体材料;灭菌条件以 0． 1%HgCl2 溶液处理 6 min为宜，而常规酒精表面消毒会影响外植体存活;适宜的初代培养基为改
良 MS(改良大量元素与有机成分)+1倍量抗褐化剂 +2． 0 mg /L 6-BA +0． 5 mg /L NAA，继代培养基为改良 MS(改良无机成分与有机成
分)+1倍量抗褐化剂 +2． 0 mg /L 6-BA +0． 1 mg /L NAA。［结论］该研究结果为“孩儿莲”组培快繁技术的建立奠定了试验基础。
关键词 八角科植物;“孩儿莲”;茎尖培养;无菌体系;组织褐化
中图分类号 S688;R282． 2 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2012)10 －05755 －03
Research on Primary Culture of Shoot Tip Explants of Illciaceae Ornamental Plants
FANG Xiang-ming et al (Department of Horticulture，School of Architecture and Urban Environment，Soochow University，Suzhou，Jiangsu
215123)
Abstract ［Objective］This study aimed to establish a technology system for tissue culture and rapid propagation of Illciaceae ornamental
plants． ［Method］Effects of medium components and anti-browning agents on the survival and growth of shoot tips were investigated by using
apical buds of Illciaceae plants“Haierlian”as experiment material and MS as basic medium． ［Result］The results showed that apical buds at
the early germination period in spring were the most suitable explants for tissue culture of Illciaceae plant“Haierlian”． Sterilization with 0． 1%
HgCl2 for 6 min had achieved the best effect，while conventional surface-sterilization with alcohol would affect the survival of explants． The op-
timal medium for primary culture was MS-D (with modifications in major elements and organic components)+ anti-browning agents (1 time of
the amount)+ 2． 0 mg /L of 6-BA + 0． 5 mg /L of NAA． The optimal subculture medium was MS-F(with modifications in inorganic and organic
components)+ anti-browning agents (1 time of the amount)+ 2． 0 mg /L of 6-BA + 0． 1 mg /L of NAA． ［Conclusion］This study has laid a
foundation for the establishment of tissue culture and rapid propagation technology system for“Haierlian”．
Key words Illciaceae plant;“Haierlian”;Shoot tip culture;Sterile system;Tissue browning
基金项目 苏州市农业科技攻关项目(SNY201001)。
作者简介 方向明(1982 －) ，男，山东临沂人，硕士，研究方向:园林植
物资源与生物技术，E-mail:woshiwoneng@ 163． com。* 通讯
作者，教授，博士生导师，从事园林植物生物技术研究，E-
mail:szutjz@ hotmail． com。
收稿日期 2012-01-19
八角科(Illiciaceae)植物为单属科植物，常绿乔木或灌
木，枝叶具有香气，春季开红花，具有较高的观赏价值［1 －3］。
但其果实大多有毒，如莽草、红茴香和地枫皮的果实都具有
一定毒性［4］，以致目前在园林绿化中尚少应用。有报导认为
在江浙地区分布的八角科植物中存在不结果实的类型，如在
苏州地区存在一种“孩儿莲”［5］，尚未观察到其结果的现象，
从而可以避免人畜误食果实而造成中毒的不良影响［6］，故用
该类八角科植物作为观赏植物的新树种，在城市绿化和庭院
美化中具有较高的应用价值。
八角科植物自然生长喜阴湿环境，多生长于林间溪水
边，主要靠种子繁殖。但上述八角科植物类型由于不结果
实，缺少种子，无法进行播种育苗，以致资源匮乏，栽培规模
也难以扩大，且有关八角科观赏植物的无性繁殖方法如嫁
接、扦插、组培快繁等方面的研究目前也尚少报导。因此，该
研究以“孩儿莲”顶芽为供试材料，探讨了外植体状况、培养
基种类及附加成分对茎尖培养效果的影响，以建立适合于八
角科观赏植物的组培快繁技术体系。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 试验材料。“孩儿莲”成年植株取自苏州大学该课
题组试验基地(苏州市三山岛)。分别选择未萌动芽和萌动
芽为外植体材料，其中未萌动芽是指春季 2 ～ 3 月份的叶芽，
芽体完整、饱满;萌动芽是指春季刚开始萌发的叶芽，芽体细
长，幼叶叶尖由芽鳞伸出，但叶片尚未展开(图 1)。
1． 1． 2 培养基。
1． 1． 2． 1 初代培养基。以 MS的组成成分为基本培养基，
并添加不同浓度的抗褐化剂、6-BA和 NAA。其中 MS-A 为:
MS +1倍量抗褐化剂 +2． 0 mg /L 6-BA +0． 5 mg /L NAA;MS-
B为:改良 MS(调节大量元素含量)+ 1倍量抗褐化剂 + 2． 0
mg /L 6-BA +0． 5 mg /L NAA;MS-C为:改良 MS(调节无机成
分)+1倍量抗褐化剂 + 2． 0 mg /L 6-BA + 0． 5 mg /L NAA;
MS-D为:改良 MS(调节无机成分与有机成分)+ 1 倍量抗褐
化剂 + 2． 0 mg /L 6-BA + 0． 5 mg /L NAA。各培养基均添加
3%蔗糖和 0． 6%琼脂粉，调节 pH至 5． 6 ～5． 8。
1． 1． 2． 2 继代培养基。在继代培养阶段，分别参考 MS-C
和 MS-D培养基的基本组成，并添加不同浓度的 6-BA 和
NAA，其中 MS-E为:改良 MS(改良无机成分)+ 1 倍量抗褐
化剂 + 2． 0 mg /L 6-BA + 0． 1 mg /L NAA;MS-F 为:改良 MS
(改良无机成分与有机成分)+ 1 倍量抗褐化剂 + 2． 0 mg /L
6-BA +0． 1 mg /L NAA。各培养基中均加入 3%蔗糖和 0． 6%
琼脂粉，调节 pH至 5． 6 ～5． 8。
1． 1． 2． 3 培养基的附加成分。在培养基中添加抗褐化剂，
添加量分别为 0倍量(对照区)、1 倍量、2 倍量，观察各不同
处理的外植体培养过程中的褐化情况。
1． 2 方法
1． 2． 1 外植体的灭菌处理及切取。未萌动芽灭菌处理:在
顶芽萌动之前，将带有叶芽(包括顶芽和腋芽)的枝条剪成 3
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2012，40(10):5755 － 5757，5785 责任编辑 王春艳 责任校对 李岩
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2012.10.196
～4 cm左右，用洗涤剂洗涤 20 min，再用流水冲洗 2 h左右，
转入超净工作台。按 3 种处理方法(表 1)对供试材料进行
灭菌处理，最后再用无菌水清洗 5 ～ 6次，置于滤纸上吸干多
余水分后，在芽下部 1 ～ 3 mm处切取芽体作为外植体，接种
于相应的培养基。
萌动芽灭菌处理:取带有萌动芽的枝条将其剪成 3 ～ 4
cm，剪掉老叶，用洗涤液洗涤 5 min，流水洗涤 5 min，转入超
净工作台中，切下萌动的芽，用 0． 1% HgCl2溶液分别灭菌处
理 3 min、6 min和 9 min，最后再用无菌水清洗 5 ～ 6次，用灭
菌滤纸吸干水分，剥掉芽外层的其余芽鳞，在芽体下部切取
芽体作为外植体，接种于对应的培养基。
1． 2． 2 培养条件。接种后，置于光照培养箱中培养，温度为
25 ±1 ℃，每天光照 12 h，光强为 2 000 lx。
1． 2． 3 调查内容。经一定时间培养后，对不同处理的外植
体材料，检测其污染率、褐化率、成活率、出愈率及生长状况。
其中，污染率 = 污染的外植体数 /接种的外植体总数 ×
100%;褐化率 =褐化外植体数 /接种的外植体总数 × 100%;
成活率 =存活的外植体总数 /接种外植体总数 × 100%;出愈
率 =下部切口产生愈伤组织的外植体数 /接种的外植体总数
×100%。生长状况分为良好、中等、较差 3个等级。
2 结果与分析
2． 1 外植体种类及灭菌处理方法对初代培养效果的影
响 “孩儿莲”当年生枝条中可分为 2 ～ 3个不同生长时期，
每个时期各长 1节新枝条。春季 3月中上旬开始发芽，长出
第 1节枝条，到 5 月下旬，第一节枝条顶部的数片叶子成熟
后，新枝条的顶芽再次萌发，开始第 2节枝条的生长;每次待
顶端叶片成熟后才能开始下一节生长。第 2节生长时期为 6
月中上旬 ～7下旬;第 3节生长时期自 8月中上旬开始，直至
10月中旬。在生长过程中，由于叶片不断成熟，革质化也会
越来越严重，用该时期的叶片作为外植体材料进行组织培养
不利于营养吸收产生愈伤组织，故试验选取顶芽作为组织培
养的外植体材料(图 1)。
图 1 八角科植物“孩儿莲”的未萌动芽(A)和萌动芽(B)
在植物组织培养过程中，外植体灭菌处理是最为关键的环
节。一般认为在消毒灭菌不彻底的情况下，由表面杂菌引起的
污染通常发生在初代培养的 2 ～3 d内，而在初期 3 ～5 d内未
发现污染，此后却不断出现各种特征的污染情况，多数是由内
生细菌引起的污染［7］。从该试验结果来看，处理区Ⅰ的外植体
污染是从接种后第 5 d开始出现，处理Ⅱ、Ⅲ外植体污染是从第
6 d开始，并且在此后 2 ～ 3 d内污染率都明显上升，说明未萌
动芽材料培养过程中所出现的污染基本为内源性污染。
由表 1可知，随着灭菌时间的延长，外植体污染率明显
下降，但其褐化率却显著增加，分别为 22． 2%、46． 9%和
55． 9%，成活率分别为 2． 8%，6． 2%和 2． 9%，这表明若采用
未萌动芽作为茎尖培养的供试材料，其严重的内生菌污染与
极低的成活率是很难建立起无菌技术体系的。因此，可以认
为“孩儿莲”的未萌动芽不适于作为组培快繁的外植体材料。
在上述试验的基础上，采用萌动芽为外植体材料，探讨了
不同灭菌时间对离体培养效果的影响，结果如表 2、图 2所示。
由于萌动芽在洗涤过程中会有一部分芽鳞被洗掉而露
出幼叶，在用 75%酒精进行表面消毒处理时，幼叶的叶绿体
易受到破坏，直接导致外植体在接种后数小时内便很快褐
化。但在省去酒精处理环节、直接用 0． 1% HgCl2处理时，褐
化率有所降低。其中当 HgCl2 灭菌时间为 3 min时，外植体
表 1 灭菌处理方法与未萌动芽初代培养效果的关系
分区
接种
数∥个
酒精处
理时间∥s
升汞处理
时间∥min
污染
率∥%
褐化
率∥%
成活
率∥%
Ⅰ 36 5 10 75． 0 22． 2 2． 8
Ⅱ 32 10 13 46． 9 46． 9 6． 2
Ⅲ 34 15 15 41． 2 55． 9 2． 9
注:调查时间为初代培养 4周后。
表 2 灭菌处理方法与萌动芽初代培养效果的关系
分区
接种
数∥个
升示处理
时间∥s
污染
率∥%
褐化
率∥%
成活
率∥%
Ⅰ 12 3 100 0 0
Ⅱ 12 6 8． 3 0 91． 7
Ⅲ 12 9 0 50 16． 7
注:调查时间为初代培养 4周后。
的污染率为 100%;当灭菌时间为 9 min时，未观察到污染现
象，但在培养过程中出现了芽体生长点或叶片褐化的现象
(图 2)。因此，从降低污染率和褐化率、提高存活率的要求
来看，采用 0． 1% HgCl2溶液处理 6 min的灭菌条件比较适合
于“孩儿莲”萌动芽无菌体系的建立。
6575 安徽农业科学 2012 年
注:A、B分别表示外植体生长点褐化和外植体叶片褐化。
图 2 升汞灭菌时间对外植体存活及生长的影响
2． 2 培养基成分对萌动芽初代培养效果的影响 培养基
组成对初代培养效果的影响如表 3、图 3 所示，在 MS-A、MS-
B培养基中，外植体的生长状况都比较差，褐化率达 90%以
上;而在 MS-C、MS-D培养基中外植体生长良好，其比率占到
80%以上，且褐化率均较低，明显优于培养基 MS-A和 MS-B。
同时，在 MS-A、MS-B和 MS-C 等 3 种培养基上，外植体的下
部切口都产生了愈伤组织，只有培养基 MS-D的外植体不产
生愈伤组织，可以认为MS-D的组成成分比较适合作为萌动
表 3 培养基种类与萌动芽初代培养效果的关系
培养基
接种
数∥个
出愈
率∥%
外植体生长状况及比率∥%
良好 中等 较差
MS-A 28 100 0 57． 1 42． 9
MS-B 26 100 0 84． 6 15． 4
MS-C 21 100 85． 7 14． 3 0
MS-D 22 0 90． 9 9． 1 0
注:调查时间为初代培养 4周后;外植体生长状况:较差是指外植体叶
片褐化较多;中等是指外植体叶片出现斑点状褐化;良好是指外植
体叶片绿色，无褐化斑点。
注:A、B、C、D分别表示培养基 MS-A、MS-B、MS-C和 MS-D。
图 3 不同培养基组成对初代培养外植体存活与生长的影响
芽的初代培养基，其原因可能是降低了无机盐浓度，减少了
酚类物质的外溢，从而减轻了褐化现象［8］。
2． 3 继代培养基成分对试管苗培养效果的影响 将初代培
养的外植体转移到MS-E和MS-F 2种培养基上继续培养，结果
显示在MS-F培养基上的外植体萌芽率较高，大约是培养基
MS-E的 10倍左右(表 4);并观察到了顶芽的生长发育，外植
体叶片开始伸长生长，最终表现成熟叶片的特征(图4) ，下部
(下转第 5785页)
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29 －31．
(上接第 5757页)
愈伤组织也继续膨大，培养效果明显优于MS-E培养基。
表 4 培养基种类与试管苗继代培养效果的关系
培养基
接种
数∥个
萌芽
率∥%
叶片生
长状况
愈伤组织
生长状况
MS-E 12 8． 30 叶片嫩绿，基本
不生长 基部愈伤组织未见膨大
MS-F 12 83． 30 叶片绿色，生长至成熟
基部愈伤组织继续膨大，
体积增加 1． 5 ～2倍左右
注:调查时间为继代培养 4周后。
2． 4 抗褐化剂对外植体褐化及生长状况的影响 在离体
培养过程中，“孩儿莲”的外植体极易褐化，故对抗褐化剂的
添加效果进行了比较分析，结果发现不加抗褐化剂或用量过
多，外植体都会出现不同程度的褐化(表 5)。当不添加抗褐
化剂时，外植体的下部切口几乎全部褐化，继而蔓延到整个
外植体;当添加 2 倍量的抗褐化剂时，外植体本身褐化率明
显降低，但仍有近一半的外植体下部切口会褐化，并严重影
响其生长发育;当添加 1 倍量的抗褐化剂时，外植体的下部
切口与外植体本身的褐化现象都很少。因此，1 倍量抗褐化
剂对减轻外植体褐化比较适宜。
3 讨论
该研究以八角科观赏植物“孩儿莲”的未萌动芽和萌动
芽为材料，就外植体种类、灭菌处理方法、培养基组成以及抗
褐化剂等对茎尖培养效果的影响进行了比较试验。与未萌
动芽相比，萌动芽的灭菌处理方法比较简单，污染率较低，是
建立“孩儿莲”无菌培养体系比较理想的外植体材料。但由
于芽体较为幼嫩，在消毒灭菌操作过程中，应注意流水冲洗
时间不宜过长，应控制在 3 ～ 5 min以内，否则易使叶片受到
损伤，接种后叶片边缘即开始褐化，并逐渐蔓延到整个叶片;
其次，可省去 75%酒精灭菌环节，否则叶片表皮细胞及叶绿
素易遭破坏;用 0． 1% HgCl2 溶液灭菌时，时间也不宜过长，
超过 7 ～8 min时，将伤害萌动芽的生长点。
注:A、B分别为培养基 MS-E和 MS-F。
图 4 不同培养基组成对试管苗继代培养效果的影响
表 5 抗褐化剂添加量与外植体初代培养效果的关系
抗褐化剂
接种数
个
褐化率∥%
下部切口 茎叶部位
生长状况
1倍量 15 0 13． 3 好
2倍量 15 46． 7 20 差
对照 15 100 100 中
在“孩儿莲”萌动芽初代培养的早期(接种后 10 d 前
后) ，MS-A等 4种培养基上的外植体叶片都能正常展开、呈
绿色，生长良好;但在接种后第 10 ～20 d内，不同培养基的培
养效果开始出现较大差异，即在MS-A培养基上，叶片褐化最
为严重，MS-B 培养基次之，MS-C、MS-D 培养基上则几无褐
化，叶片外观嫩绿，并不断展开幼叶。通过继代培养基的进
一步比较试验，结果筛选到了比较适合的培养基条件，既可
减轻外植体叶片的褐化程度，也能保持其良好的生长状态。
在组织培养过程中，“孩儿莲”外植体的切口处因多酚氧
化酶的作用而产生褐色物质，渗入到培养基中，影响外植体
生长，甚至蔓延到整个外植体。在该试验中，通过选择合适
的外植体种类、采用适当的灭菌方法、降低培养基中无机盐
浓度以及添加适量抗褐化剂等技术处理，可以有效地抑制褐
化现象的发生，这为建立八角科观赏植物的离体快繁技术体
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