全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　May２０１４,３４(３):２９４－２９８　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０３．００３
焦淑静,黄现恩,谷青,等．席藻ITS序列拷贝类型及进化关系分析[J]．广西植物,２０１４,３４(３):２９４－２９８
JiaoSJ,HuangXE,GuQ,etal．AnalysesonthetypesofcopyandevolutionaryrelationshipsofITSsequenceofPhormidium[J]．Guihaia,２０１４,３４(３):
２９４－２９８
席藻ITS序列拷贝类型及进化关系分析
焦淑静,黄现恩,谷　青,史全良∗
(苏州大学 医学部基础医学与生物科学学院,苏州２１５１２３)
摘　要:由于协同进化未完成,蓝藻的１６SＧ２３SrDNA基因间隔序列(ITS)存在多种拷贝类型,目前蓝藻ITS
序列的拷贝类型分布以及演化规律尚未研究清楚.该文采用本地采集的席藻属样品,测定其ITS序列,并结
合基因库中已有的席藻ITS序列,对席藻属蓝藻ITS序列拷贝类型及其之间的进化关系进行探讨.结果显
示,席藻属ITS序列的PCR产物有两种情况,即单一条带(仅出现ITSＧIA或ITSＧI型)和两条条带(同时出现
ITSＧIA和ITSＧN型),其中以单一条带的ITSＧIA型最为普遍;在基于ITS序列的系统发生树中,ITSＧIA型和
ITSＧI型均各自聚为一个组群,且ITSＧIA型的组群节点出现较早,表明席藻属ITSＧI型极有可能是由其原来
的ITSＧIA型缺失tRNAAla编码区进化而来,ITSＧIA型应为席藻ITS序列的基本结构.
关键词:席藻;１６SＧ２３SrDNA基因间隔序列;拷贝类型;系统发育;进化关系
中图分类号:Q９４１．２　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０３Ｇ０２９４Ｇ０５
Analysesonthetypesofcopyandevolutionary
relationshipsofITSsequenceofPhormidium
JIAOShuＧJing,HUANGXianＧEn,GUQing,SHIQuanＧLiang∗
(SchoolofBiologyandBasicMedicalSciences,SoochowUnivercity,Suzhou２１５１２３,China)
Abstract:ThecoevolutionoftheITSsequenceshasn＇tbeenfulyaccomplishedleadingtomultipletypesofcopyincyＧ
anobacteria,whilethedistributionruleofITScopyincyanobacteriaareunclear．WeusedPhormidiumstrainspicked
upfromSuzhoudistrictsand１２otherstrainsselectedfromGenebankasthematerialstostudythecharacteristicsand
theevolutionaryrelationshipsamongdiferenttypesofcopy．TheresultsshowedthatthePCRproductofITSof
Phormidiumhadsingleband(i．e．ITSＧIAtypeorITSＧItype)ortwobands(i．e．ITSＧIAandITSＧNtype),andITSＧ
IAwasthemostpopulartypeinthematerialsusedinthisstudy;thephylogenyanalyzedresultsindicatedthatITSＧ
IAtypeandITSＧItypeweredistributedindifferentgroupsrespectively,andtheITSＧIAgroupappearedearlierthan
ITSＧIgroup．ThusweprovedthatITSＧItypewasevolvedfromadeletionoftRNAAlacodingregionofITSＧIAtype,
andITSＧIAtypeshouldbethebasicstructureofITScopyofPhormidium．
Keywords:Phormidium;ITS;thetypeofcopy;phylogeny;evolutionaryrelationship
　　蓝藻的ITS序列具有较丰富的变异位点和信
息位点,进化速率快,受外界环境选择压力小,在序
列长度和组成上都有很高的变异性(Garciaetal．,
１９９６).近年来用ITS序列作为分子标记做近缘蓝
藻的系统进化分析的报道相对增多(Bakeretal．,
２００３;Ferrisetal．,２００３;Karinaetal．,２００９).但
由于协同进化尚未完成,蓝藻的ITS序列存在多种
拷贝类型现象,主要有三种类型(Itemanetal．,
收稿日期:２０１３Ｇ１１Ｇ２７　　修回日期:２０１３Ｇ１２Ｇ０６
基金项目:国家自然科学基金(３１１７１４６)
作者简介:焦淑静(１９８７Ｇ),女,河南永城市人,硕士研究生,主要研究方向为植物资源及进化遗传学,(EＧmail)jiaoshujing１９８８＠１６３．com.
∗通讯作者:史全良,博士,副教授,主要研究方向是植物资源及进化遗传学,(EＧmail)shiquanliang＠suda．edu．cn.
２０００):１６SrRNAＧtRNAIleＧtRNAAlaＧ２３SrRNA(携
带tRNAIle和tRNAAla编码区,简称ITSＧIA类型),
１６SrRNAＧtRNAIleＧ２３SrRNA(只携带tRNAIle编码
区,简称ITSＧI类型),１６SrRNAＧ２３SrRNA(无tRＧ
NA编码区,简称ITSＧN 类型).其中ITSＧIA 和
ITSＧN类型在蓝藻门的大部分种属中普遍存在,且
ITSＧIA类型被认为是最基本的结构(Sarahetal．,
２００１),而ITSＧI类型出现的频率则较小,早期的研
究发现ITSＧI类型仅在Microcystis(Otsukaetal．,
１９９９)、Spirulina(Nelissenetal．,１９９４)OscillatoＧ
riasp．(陈月琴等,１９９９)等属存在,而近年来Taton
etal．(２００６)和 Otakaretal．(２０１１)在南极洲以及
Marquardtetal．(２００７)在西班牙采集的席藻属样品
中也发现该拷贝类型的存在.
目前关于蓝藻中ITS序列各拷贝类型的特点
及进化关系的研究还较少.本文选取在苏州市区采
集的席藻样品测定其ITS序列,并结合基因库上已
有的席藻的ITS序列,探讨席藻属内不同ITS拷贝
类型之间的进化关系,以期对席藻属的ITS拷贝类
型以及不同拷贝类型之间的进化关系有一个更深入
更全面的了解,为进一步验证其在系统分类学中的
作用奠定基础.
１　材料与方法
１．１材料
实验材料如表１所示,其中本实验室的席藻样
品Phormidiumsp．６A１０、Phormidiumsp．７B１０、
Phormidiumsp．７D６、Phormidiumsp．８B８,分别
采集于苏州虎丘区潮湿土壤表面、工业园区河道底
表１　用于ITS序列分析的蓝藻种类列表
Table１　ListofcyanobacteriausedfortheanalysesofITS
种名Species
编号
Code
接收号
AccessionNo．
拷贝类型
Typeofcopy
来源
Source
Phormidiumsp．６A１０ J１ KF６８１５１１ I 本地采集
Phormidiumsp．７B１０ J２ KF７５１３５０ IA 本地采集
Phormidiumsp．７D６ J３ KF６８１５１２ I 本地采集
Phormidiumsp．８B８ J４ KF７５１３５１ IA 本地采集
Phormidiumsp．CCMEE３２７ J５ AM３９８９４５ IA Genbank
Phormidiumsp．OLS１２ J６ AM３９８９６７ IA Genbank
Phormidiumsp．OLS６ J７ AM３９８９７８ IA Genbank
Phormidiumsp．OL７５ J８ AM３９８９６１ IA Genbank
Phormidiumsp．OLsphere
PhormidiumpriestleyiANT．LG２．４
PhormidiumpriestleyiLH６６．１
J９
J１０
J１１
AM３９８９７４
AY４９３６４１
JF２６９１７２
IA
IA
IA
Genbank
Genbank
Genbank
Phormidiumirriguumf．minorETSＧ０２
Phormidiumcf．irriguumCCALA７５９
J１２
J１３
FN８１３３３９
FN８１３３４０
IA
IA
Genbank
Genbank
PhormidiummurrayiiANT．LPE．１ J１４ AY４９３６３０ I Genbank
PhormidiummurrayiiANT．LPE．２
Phormidiumsp．CCAP１４６２Ｇ１１
J１５
J１６
AY４９３６３１
AM３９８９４６
I
I
Genbank
Genbank
Microcoleusvaginatusclone２０５Ｇ４C∗
Microcoleusvaginatusclone２０５Ｇ５D∗
J１７
J１８
AF３６３９３６
AF３６３９３７
IA
IA
Genbank
Genbank
　注:IA＝１６SrRNAＧtRNAIleＧtRNAAlaＧ２３SrRNA,I＝１６SrRNAＧtRNAIleＧ２３SrRNA,标∗的序列为外组群序列.
　Note:IA＝１６SrRNAＧtRNAIleＧtRNAAlaＧ２３SrRNA,I＝１６SrRNAＧtRNAIleＧ２３SrRNA,thesquenceswithsnowflakesymbolareoutgroups．
部、工业园区向阳草坪土壤表面、相城区农业生态园
稻田旁芦苇池塘.另外的１４株蓝藻样品信息来自
Genbank(基因库).
１．２实验方法
１．２．１席藻样品ITS序列的测定　采用EZＧ１０Spin
ColumnGenomicDNAIsolationKit试剂盒进行样
品总DNA提取.以由生工生物工程(上海)股份有
限公司合成的３２２:５′ＧTGAACACACCGCCCGTCＧ
３′,３４０:５′ＧCTCTGTGTGCCTAGGTATCCＧ３′为引
物(Itemanetal．,２０００)进行ITS序列的PCR扩
增,反应在 TakaraTP６００型PCR仪上进行.PCR
反应程序是９５℃５min,９４℃３０s,５７℃４５s,７２
℃１min,３５个循环后,７２℃１０min,４℃保存.扩
增产物经１．４％琼脂糖凝胶电泳后,切取目的条带,
使用UNIQＧ１０柱式DNA胶回收试剂盒纯化后,进
行TA克隆并送至生工生物工程(上海)股份有限公
司进行测序.
以上试剂和试剂盒均购自生工生物工程(上海)
５９２３期　　　　　　　　　　焦淑静等:席藻ITS序列拷贝类型及进化关系分析
股份有限公司.
１．２．２序列分析及系统进化树的构建　采用 Mega
５．０软件(汪琛颖等,２０１１)对序列进行比对、人工调
整及碱基分析;采用PAUP∗４．０b４a软件(SwofＧ
ford,２００３)以最大简约法(maximum parsimony,
MP)和最大似然法(maximumlikelihood,ML)构建
系统发育树.MP分析采用启发式搜索的方式,分
支交换算法设定为树二等分再连接算法(treebisecＧ
tionreconnection);ML分析采用启发式搜索的逐
步加入式算法(stepwiseaddition),分支交换算法设
定为最近邻居互换法 (nearestneighboriＧnterＧ
change,NNI),运算均取其严格一致性树.这两种
树的拓扑结构的节点支持率均由１０００次重复的自
展检验(bootstrap,BP)分析得到 (张青等,２０１０).
２　结果与分析
２．１席藻样品ITS序列扩增及序列测定
本实验室４株席藻样品提取基因组DNA后,
采用特异引物３２２、３４０进行ITS序列的PCR扩增.
图１为PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果,显示其
ITS序列 PCR产物(含有１６SrDNAＧ３′端和２３S
rDNAＧ５′端部分序列)均为单一条带,Phormidium
sp．６A１０和Phormidium sp．７D６的条带大小为
６００bp,Phormidiumsp．７B１０和Phormidiumsp．
８B８的条带大小为７００bp.经过序列测定,PhorＧ
midium sp．６A１０、Phormidium sp．７B１０、PhorＧ
midiumsp．７D６、Phormidiumsp．８B８的ITS序列
大小(去除１６SrDNAＧ３′端和２３SrDNAＧ５′端)分别
为４２９bp、５１３bp、４２４bp、５０８bp,Phormidiumsp．
６A１０、Phormidium sp．７D６的ITS序列仅携带
tRNAIle编码区,为ITSＧI型,而 Phormidium sp．
７B１０、Phormidium sp．８B８则同时携带tRNAIle
andtRNAAla编码区,为ITSＧIA型.４株席藻样品
的ITS序列均已提交至Genbank,Phormidiumsp．
６A１０、Phormidium sp．７B１０、Phormidium sp．
７D６、Phormidium sp．８B８ 的 接 受 号 分 别 为
KF６８１５１１、KF７５１３５０、KF６８１５１２、KF７５１３５１.
２．２席藻属ITS多序列比对分析
考虑到本实验室席藻样品的ITS序列均为单
一拷贝类型,另从基因库甄选１２株具单一拷贝类型
的席藻属的ITS序列(其中９株ITSＧIA型,３株为
ITSＧI型,具体样品信息见１．１中表１).采用MEGA
图１　席藻样品ITSPCR产物电泳分析
M．分子量标准 (１００bpDNA梯度量标);
泳道１Ｇ４分别为J１、J２、J３、J４.
Fig．１　ElectrophoresisofPCRproductsofITSof
Phormidiumsamples　 M．Molecularweightmarker
(１００bpplusDNAladdermarker);Lane１Ｇ４
representedJ１,J２,J３,J４．
５．０软件进行多序列比对以及人工校正,发现席藻
的ITSＧIA型和ITSＧI型序列均出现了Itemanet
al．(２０００)、Sarahetal．(２００１)所描述的保守区域
D１、D１′、D２、D３、tRNAIle、D４、BoxA、D５,ITSＧIA型
的ITS序列具有tRNAAla编码区,而ITSＧI型无此
编码区.
２．３席藻ITSＧIA和ITSＧI型序列之间进化关系研究
以 Microcoleusvaginatusclone２０５Ｇ４C、MiＧ
crocoleusvaginatusclone２０５Ｇ５D 为外组群构建
MP和 ML树.构树的ITS序列的相关信息见１．１
中表１.由于ITSＧIA型和ITSＧI型两种拷贝类型
存在tRNAAla编码区的差异,针对tRNAAla编码区序
列我们采用缺失和插入两种方式进行处理.
图２和图３为采用缺失处理方式得到的 MP和
ML树.基于ITS序列的 MP树(图２)显示,ITSＧ
IA型和ITSＧI型的种类各自聚为一个组,ITSＧIA
型形成组I,ITSＧI型形成组II,且组I的节点较分组
II出现的早.ML树(图３)与 MP树显示了较为一
致的结果,与 MP相同ITSＧIA型种类聚为组I,其
中包括与 MP相同的III、IV、V小组,但在小组III
的内部以及小组III、IV、V之间的位置分布上略有
差异,而ITSＧI型种类聚成的组I结构与 MP树中
完全一致.
将tRNAAla编码区作为插入序列处理,得到的
MP树(图４)与图２结构基本一致,但在组III的内
部分布上略有差异.其 ML树(图５)与图３结构也
６９２ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
图２　采用缺失处理所得 MP树
Fig．２　MPtreebyusingthelacktreatment
(CI＝０．７８１;RI＝０．８３０)
图３　采用缺失处理所得 ML树
Fig．３　MLtreebyusingthelacktreatment
(CI＝０．７６７;RI＝０．８１０)
图４　采用插入处理所得 MP树
Fig．４　MPtreebyusinginsertedtreatment
(CI＝０．７６０;RI＝０．８０５)
大致相同,原来在小分组IV中的Phormidiumsp．
CCMEE３２７与PhormidiumpriestleyiANT．LG２．４
和PhormidiumpriestleyiLH６６．１分开,但仍在所
图５　采用插入处理所得 MP树
Fig．５　MPtreebyusinginsertedtreatment
(CI＝０．７４６;RI＝０．７８５)
有ITSＧIA型种类形成的组I中.
两种处理方式得到的所有系统发育树均显示
ITSＧIA型和ITSＧI型的种类各自聚为一组,ITSＧIA
型为组I,ITSＧI型为组II,且组I的节点较组II出现
的早.结果显示席藻属的ITSＧI型极有可能是由其
原来的ITSＧIA型缺失tRNAAla编码区而来.
３　讨论与结论
NostocPCC７１２０的ITS序列有两种拷贝类型
即ITSＧIA、ITSＧN,SynechocystisPCC６８０３则只有
一种拷贝类型,拷贝类型为ITSＧIA(Itemanetal．,
２０００).史全良等(２００５)对地衣共生念珠藻ITS序
列的研究发现除了出现与NostocPCC７１２０相同的
两种拷贝以外,还发现有一条长度９２０bp的拷贝,
经粟绒(２０１３)进一步研究发现该条带的出现为假阳
性,是其ITSＧIA和ITSＧN条带形成的异源双链,并
认为在协同进化的过程中,蓝藻的不同类型的ITS
序列很可能是其中一种类型的ITS序列之间相互
趋异而形成的异质性排列,即ITSＧN型很可能是由
其ITSＧIA型缺失tRNA编码序列而来,而并未对
ITSＧI型与ITSＧIA型的进化关系进行分析.
以往的研究(Tatonetal．,２００６;Otakaretal．,
２０１１;Marquardtetal．,２００７)显示席藻属ITS序列
的PCR产物有单一条带和多条带两种情况:即单一
条带(仅出现ITSＧIA或ITSＧI)和两条条带(同时出
现ITSＧIA和ITSＧN),其中以单一条带的ITSＧIA
型最为常见.本文结果显示采集于中国苏州的四株
席藻属样品,其ITS序列均为单一条带,但为两种
７９２３期　　　　　　　　　　焦淑静等:席藻ITS序列拷贝类型及进化关系分析
不同的拷贝类型,其中６A１０、７D６的ITS拷贝类型
为ITSＧI型,７B１０、８B８则属于ITSＧIA 型;在基于
ITS序列建立的系统发生树中,ITSＧIA型和ITSＧI
型的种类各自聚为一个组群,且ITSＧIA型的组群
节点较ITSＧI型出现的早,表明席藻属ITSＧI型极
有可能是由其原来的ITSＧIA型缺失tRNAAla编码
区进化而来,ITSＧIA型应为蓝藻ITS的基本结构.
席藻属的ITS序列的分布情况是较为复杂的,其
ITS序列的缺失机理还有待于进一步研究.
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