全 文 ： Ｇｕｉｈａｉａ Ｊｕｎ. ２０１６ꎬ ３６(６):６９８－７０６
ｈｔｔｐ: / / ｊｏｕｒｎａｌ.ｇｘｚｗ.ｇｘｉｂ.ｃｎ
ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｇｕｉｈａｉａ－ｊｏｕｒｎａｌ.ｃｏｍ
ＤＯＩ: １０.１１９３１ / ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１６０１０２８
包曙光ꎬ魏情情ꎬ刘智康ꎬ等. 拟南芥醛还原酶编码基因 Ａｔ３ｇ０４０００表达模式分析及过量表达转基因植株获得 [Ｊ]. 广西植物ꎬ ２０１６ꎬ ３６(６):６９８－７０６
ＢＡＯ ＳＧꎬ ＷＥＩ ＱＱꎬ ＬＩＵ ＺＫꎬ ｅｔ ａｌ. Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅ Ａｔ３ｇ０４０００ ａｎｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｐｌａｎｔｓ [Ｊ]. Ｇｕｉｈａｉａꎬ ２０１６ꎬ ３６(６):６９８－７０６
拟南芥醛还原酶编码基因 Ａｔ３ｇ０４０００表达模式
分析及过量表达转基因植株获得
包曙光ꎬ 魏情情ꎬ 刘智康ꎬ 聂 祥ꎬ 门淑珍∗
( 南开大学 生命科学学院 植物生物学和生态学系ꎬ 天津 ３０００７１ )
摘 要: 植物体内的 αꎬβ￣不饱和活性醛类化合物对植物细胞具有毒害作用ꎬ清除这些 αꎬβ￣不饱和活性醛类化
合物对于植物细胞维持正常的生命活动至关重要ꎮ 前人研究报道通过体外酶活测定和异源瞬时表达鉴定拟
南芥 Ａｔ３ｇ０４０００基因编码的蛋白为 ＮＡＤＰＨ依赖的叶绿体醛还原酶(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＮＡＤＰＨ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｉｃ
ａｌｄｅｈｙｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓꎬ ＡｔＣｈｌＡＤＲｓ)ꎬ推测其在清除叶绿体中长链(≥５)αꎬβ￣不饱和醛类物质中具有重要的功能ꎮ
该研究主要构建了拟南芥 Ａｔ３ｇ０４０００ 基因的表达模式分析载体 ＰｒｏＡｔ３ｇ０４０００:ＧＵＳ、亚细胞定位分析载体
Ａｔ３ｇ０４０００￣ＥＧＦＰ 和过量表达载体 Ａｔ３ｇ０４０００￣ＯＥꎬ并获得了转基因拟南芥ꎬ并通过实时定量 ＰＣＲ 分析了
Ａｔ３ｇ０４０００基因在拟南芥不同组织中的转录水平ꎮ 结果表明:拟南芥 Ａｔ３ｇ０４０００ 基因在幼苗中的转录水平最
高ꎬ在莲座叶、茎生叶、花序和角果中均有较高的转录水平ꎻ而在根部和茎秆中的转录水平较低ꎮ 通过对
ＰｒｏＡｔ３ｇ０４０００:ＧＵＳ转基因植株的 ＧＵＳ染色分析可知ꎬＡｔ３ｇ０４０００ 基因在子叶、莲座叶和萼片的维管组织和保
卫细胞中均有较强的表达ꎬ在根的维管组织中有较弱的表达ꎮ 通过共聚焦显微镜对 Ａｔ３ｇ０４０００￣ＥＧＦＰ 转基因
植株的观察和分析发现ꎬＡｔ３ｇ０４０００不是定位于叶绿体中ꎬ而是定位在细胞质和细胞核中ꎮ 该研究结果为深入
研究拟南芥醛还原酶编码基因 Ａｔ３ｇ０４０００的功能奠定了基础ꎮ
关键词: 拟南芥ꎬ αꎬβ￣不饱和醛ꎬ 醛还原酶ꎬ Ａｔ３ｇ０４０００ꎬ 表达模式ꎬ 过量表达
中图分类号: Ｑ９４３.２ 文献标识码: Ａ 文章编号: １０００￣３１４２(２０１６)０６￣０６９８￣０９
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｌｄｅｈｙｄｅ
ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅ Ａｔ３ｇ０４０００ ａｎｄ
ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｎｔｓ
ＢＡＯ Ｓｈｕ￣Ｇｕａｎｇꎬ ＷＥＩ Ｑｉｎｇ￣Ｑｉｎｇꎬ ＬＩＵ Ｚｈｉ￣Ｋａｎｇꎬ ＮＩＥ Ｘｉａｎｇꎬ ＭＥＮ Ｓｈｕ￣Ｚｈｅｎ∗
( Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｃｏｌｏｇｙꎬ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｎａｎｋａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｔｉａｎｊｉｎ ３０００７１ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｒｅａｃｔｉｖｅ ａｌｄｅｈｙｄｅꎬ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ αꎬβ￣ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ａｒｅ ｔｏｘｉｃ ｔｏ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ. Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅꎬ ｅｌｉｍｉｎａ￣
ｔｉｏｎ ｏｆ αꎬβ￣ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｉｓ ｖｉｔａｌ ｆｏｒ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌｓ ｔｏ ｍａｉｎｔａｉｎ ｎｏｒｍａｌ ｌｉｆｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ. Ｉｎ ｐｒｅｖｉｏｕｓ ｒｅｐｏｒｔｓꎬ ｔｈｅ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ Ａｔ３ｇ０４０００ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ａ ＮＡＤＰＨ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｉｃ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ
(ＡｔＣｈｌＡＤＲｓ) ｂｙ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｓｓａｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｅ ｉｎ ｓｐｉｄｅｒｗｏｒｔ ｃｅｌｌｓ. Ａｎｄ ｉｔ ｗａｓ ｐｒｏｐｏｓｅｄ
收稿日期: ２０１６￣０１￣１８ 修回日期: ２０１６￣０３￣０４
基金项目: 国家自然科学基金(３１５７０２４７ꎬ ９１４１７３０８ꎬ ９１０１７００９ꎬ ３１４６０４５３)ꎻ天津市自然科学基金(１２ＪＣＺＤＪＣ２３２００)ꎻ国家基础学科人才培养基
金南开大学生物学人才培养基地(Ｊ１１０３５０３) [Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ (３１５７０２４７ꎬ ９１４１７３０８ꎬ ９１０１７００９ꎬ ３１４６０４５３)ꎻ
ｔｈｅ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｉａｎｊｉｎ (１２ＪＣＺＤＪＣ２３２００)ꎻ Ｆｕｎｄｓ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂａｓｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｅｒｓｏｎｎｅｌ Ｔｒａｉｎｉｎｇ (Ｊ１１０３５０３)]ꎮ
作者简介: 包曙光(１９８５￣)ꎬ男(蒙古族)ꎬ内蒙古通辽市人ꎬ博士研究生ꎬ主要从事植物分子生物学研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ) ｍｉｎｄａｇｕａｎｇ３９０６＠ １２６.ｃｏｍꎮ
∗通讯作者: 门淑珍ꎬ博士ꎬ教授ꎬ博士生导师ꎬ主要从事植物固醇的研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ) ｓｈｕｚｈｅｎｍｅｎ＠ ｎａｎｋａｉ.ｅｄｕ.ｃｎꎮ
ｔｏ ｐｌａｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ αꎬβ￣ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ａｌｄｅｈｙｄｅｓ ｗｉｔｈ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ５ ｃａｒｂｏｎｓ (Ｃ≥５) ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ. Ｔｏ ｆｕｒｔｈｅｒ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｈｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ Ａｔ３ｇ０４０００ ｇｅｎｅꎬ ｗｅ ｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｌａｎｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ＰｒｏＡｔ３ｇ０４０００:ＧＵＳ ｆｏｒ ａｎａｌｙ￣
ｓｉｓ ｏｆ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎꎬ ａ Ａｔ３ｇ０４０００￣ＥＧＦＰ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｆｕｓｉｏｎ ｆｏｒ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓꎬ ａｎｄ ３５Ｓ:
Ａｔ３ｇ０４０００ ｆｏｒ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ａｔ３ｇ０４０００ ｇｅｎｅ. Ｗｅ ａｌｓｏ ｕｓｅｄ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ
Ａｔ３ｇ０４０００ ｇｅｎｅ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ａｔ３ｇ０４０００
ｇｅｎｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ａｌｌ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｔｉｓｓｕｅｓ. Ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ Ａｔ３ｇ０４０００ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｓｅｅｄｌｉｎｇｓꎬ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｏｆ Ａｔ３ｇ０４０００ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｗｅｒｅ ａｌｓｏ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｒｏｓｅｔｔｅ ｌｅａｆꎬ ｃａｕｌｉｎｅ ｌｅａｆꎬ ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ａｎｄ ｓｉｌｉｑｕｅꎬ ｗｈｉｌｅ ｉｎ ｒｏｏｔ ａｎｄ ｓｔｅｍ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ Ａｔ３ｇ０４０００ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｖｅｒｙ ｗｅａｋ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＧＵＳ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｉｎ
ＰｒｏＡｔ３ｇ０４０００: ＧＵＳ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｉｎ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ
ａｎａｌｙｓｉｓ. Ｓｔｒｏｎｇ ＧＵＳ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｇｕａｒｄ ｃｅｌｌｓ ｏｆ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎꎬ ｒｏｓｅｔｔｅ ｌｅａｆ ａｎｄ ｓｅｐａｌꎬ ａｎｄ ｗｅａｋ
ＧＵＳ ｓｔａｉｎｉｎｇ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｖａｓｃｕｌａｒ ｔｉｓｓｕｅｓ ｏｆ ｒｏｏｔ. Ｔｏ ａｎａｌｙｚｅ ｔｈｅ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｔ３ｇ０４０００ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｅｄ
ｐｒｏｔｅｉｎꎬ ｔｈｅ Ａｔ３ｇ０４０００￣ＥＧＦＰ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｗａｓ ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｂｙ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ
Ａｔ３ｇ０４０００ ｇｅｎｅ ｅｎｃｏｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｎｏｔ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔꎬ ｂｕｔ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｃｙｔｏｐｌａｓｍ ａｎｄ ｎｕｃｌｅｕｓ. Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｐｒｏ￣
ｖｉｄｅｓ ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ Ａｔ３ｇ０４０００ ｇｅｎｅ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓꎬ αꎬβ￣ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ ａｌｄｅｈｙｄｅꎬ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅꎬ Ａｔ３ｇ０４０００ꎬ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎꎬ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
活性氧族(Ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓꎬＲＯＳ)是植物
有氧代谢过程中重要的副产物ꎬ对于植物生长发育
过程起双重功效:低浓度 ＲＯＳ 可以促进植物的生长
发育ꎬ高浓度 ＲＯＳ 对植物有氧化胁迫作用(Ｂｏｌｗｅｌｌ
ｅｔ ａｌꎬ１９９５ꎻ林植芳和刘楠ꎬ２０１２ꎻ田敏等ꎬ２００５)ꎮ 正
常情况下ꎬ植物体内 ＲＯＳ产生和清除处于平衡状态
不会对细胞造成伤害ꎮ 当外在或内在因素破坏了生
物体内 ＲＯＳ含量的动态平衡状态时ꎬ生物体内过多
的 ＲＯＳ将会损伤生物大分子ꎬ主要包括对蛋白质的
损伤作用、对 ＤＮＡ和糖类的氧化损伤及脂质过氧化
(Ｐｏｔｉｋｈａ ｅｔ ａｌꎬ １９９９ꎻ Ｈａｌｌｉｗｅｌｌꎬ ２００６ꎻ张文玲等ꎬ
２０００ꎻ李冰冰等ꎬ２００５)ꎮ 当植物遭受到外界生物或
非生物胁迫时ꎬ ＲＯＳ 含量会迸发 ( Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌꎬ
２００１ꎻＦａｔｈ ｅｔ ａｌꎬ２００２)ꎮ ＲＯＳ 中的单线态氧和羟基
自由基能与细胞膜组分中的多聚不饱和脂肪酸发生
作用引发脂质的过氧化反应ꎬ产生大量含有羰基的
中间产物(Ｂｕｒｃｈａｍꎬ１９９８)ꎮ 不饱和羰基化合物会
扰乱细胞内的代谢平衡造成氧化胁迫ꎬ从而引起对
细胞的毒害ꎮ 其中醛类物质能破坏膜的完整性ꎬ引
起细胞毒害(Ｅｓｔｅｒｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌꎬ１９９１ꎻＭｉｌｌａｒ ＆ Ｌｅａｖｅｒꎬ
２０００ꎻＹａｍａｕｃｈｉ ＆ Ｓｕｇｉｍｏｔｏꎬ２０１０)ꎮ 活性醛参与了
植物逆境胁迫下对细胞的毒害作用ꎬ影响植物正常
的生长发育(Ｍａｎｏ ｅｔ ａｌꎬ２００５ꎻＹｉｎ ｅｔ ａｌꎬ２０１０)ꎮ 清
除植物体内过多的活性醛类物质将会提高植物抵抗
逆境的能力ꎮ Ｃｈｅｎ ＆ Ｍｕｒａｔａ(２００２)发现甜菜碱乙
醛脱氢酶 ＢＡＤＨ 能使细胞在干旱和高盐等逆境胁
迫下维持渗透平衡从而提高植物抗逆性ꎮ 张海玲等
(２０１０)发现转乙醛脱氢酶基因(ＡＬＤＨ)番茄的抗逆
性明显高于对照ꎬ转基因植物体内的活性醛类物质
所造成的氧化胁迫明显下降ꎮ Ｍａｎｏ ｅｔ ａｌ(２００５)在
烟草中过量表达拟南芥的 ２￣烯醛还原酶基因(２￣
ＡＬＫＥＮＡＬ ＲＥＤＵＣＴＡＳＥꎬＡＥＲ)明显减少强光诱导的
氧化胁迫ꎬ提高植物抗逆性ꎮ 吴茜等(２０１５)在烟草
中过量表达拟南芥 ＡＥＲ 基因明显提高了烟草抗旱
能力ꎮ αꎬβ￣不饱和活性醛类物质可以通过与氨基反
应形成希夫碱化合物(Ｓｃｈｉｆｆ ｂａｓｅａｄｄｕｃｔｓ)ꎬ对细胞造
成毒害(Ｙａｍａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌꎬ２００８)ꎮ 因此ꎬ去除植物体
内 αꎬβ￣不饱和的活性醛类物质有助于植物解除活
性醛造成的氧化损伤ꎮ
哺乳动物细胞中去除 αꎬβ￣不饱和活性醛的代
谢途径已有报道 ( Ｕｃｈｉｄａꎬ ２００３ꎻ Ｙａｍａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌꎬ
２０１１)ꎬ包括(１)醛脱氢酶ꎬ氧化醛类物质转变为羧
酸盐类化合物(Ｓｅｌｌｉｎ ｅｔ ａｌꎬ１９９１)ꎻ(２)醛￣酮还原酶ꎬ
催化 醛 转 变 为 醇 类 物 质 ( Ｋｏｌｂ ｅｔ ａｌꎬ １９９４ꎻ
Ｂｕｒｃｚｙｎｓｋｉ ｅｔ ａｌꎬ ２００１)ꎻ ( ３) 谷胱甘肽￣Ｓ￣转移酶
(ＧＳＴ)途径(Ｈａｒｔｌｅｙ ｅｔ ａｌꎬ１９９５)ꎻ(４)ＮＡＤＰＨ 依赖
的链烯基氧化还原酶ꎬ催化含有 αꎬβ￣不饱和的活性
醛类物质的氢化作用(Ｄｉｃｋ ｅｔ ａｌꎬ２００１)ꎮ 关于植物
体内去除不饱和活性醛类物质代谢途径的研究相对
较少ꎮ Ｙａｍａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ ( ２０１１)在拟南芥中筛选到
ＮＡＤＰＨ 依赖的链烯基氧化还原酶 Ａｔ１ｇ２３７４０ꎮ 此
外ꎬ还在拟南芥中分别筛选到 ＮＡＤＰＨ 依赖且定位
于细胞质的醛还原酶(Ａｔ２ｇ２４１９０ 和 Ａｔ３ｇ６１２２０)和
定位于叶绿体的一个醛－酮还原酶(Ａｔ２ｇ３７７７０)及 ２
个醛还原酶 ( Ａｔ１ｇ５４８７０ 和 Ａｔ３ｇ０４０００ )ꎮ 其中ꎬ
Ａｔ３ｇ０４０００具有去除长链(≥５)αꎬβ￣不饱和醛和饱
９９６６期 包曙光等: 拟南芥醛还原酶编码基因 Ａｔ３ｇ０４０００表达模式分析及过量表达转基因植株获得
和醛的醛还原酶活力ꎬ并以紫鸭跖草(Ｔｒａｄｅｓｃａｎｔｉａ
ｒｅｆｌｅｘａ)叶片为材料利用瞬时转化技术鉴定拟南芥
醛还原酶 Ａｔ３ｇ０４０００ 定位于叶绿体ꎮ 然而ꎬ关于
Ａｔ３ｇ０４０００表达模式的分析和在拟南芥稳定表达株
系中亚细胞定位模式的研究尚未见有报道ꎮ 本研究
通过实时定量 ＰＣＲ 检测了 Ａｔ３ｇ０４０００ 基因在拟南
芥不同组织的转录水平ꎮ 构建了 Ａｔ３ｇ０４０００ 基因的
启动子与 ＧＵＳ报告基因的融合载体ꎬ并且获得了转
基因拟南芥 ＰｒｏＡｔ３ｇ０４０００:ＧＵＳꎮ 通过 ＧＵＳ 染色分
析了拟南芥醛还原酶 Ａｔ３ｇ０４０００ 的表达模式ꎮ 构建
了 Ａｔ３ｇ０４０００ 全长基因( －９２７ ~ ＋９３３)与 ＧＦＰ 基因
融合的亚细胞定位分析载体ꎮ 以 Ａｔ３ｇ０４０００￣ＥＧＦＰ
转基因拟南芥作为材料ꎬ检测了拟南芥醛还原酶
Ａｔ３ｇ０４０００在拟南芥体内的亚细胞定位模式ꎮ 另
外ꎬ构建了拟南芥醛还原酶 Ａｔ３ｇ０４０００ 过量表达载
体ꎬ并且获得了纯合的过量表达转基因拟南芥ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 植物材料
所用的拟南芥(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ)为哥伦比
亚型(Ｃｏｌ￣０)ꎬ种子由本实验室保存ꎮ 拟南芥培养在
人工气候室内ꎬ温度设定为 ２２ ℃ꎬ湿度设定为
６０％ꎬ设定光照为 １６ ｈ、８ ｈ 黑暗ꎮ 分别采集野生型
拟南芥的根、幼苗、莲座叶、茎生叶、茎秆、花序和角
果用于 Ａｔ３ｇ０４０００ 基因表达模式的分析ꎮ 采集四周
龄的野生型和过量表达植株的莲座叶用于过量表达
植株的转录水平分析ꎮ 植物材料采集后立即于液氮
中速冻ꎬ－８０ ℃冰箱冻存备用ꎮ
１.２ 主要试剂
ＲＮＡ 提取试剂盒、反转录试剂盒和 ＳＹＢＲ®
Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ试剂盒均购自 ＴａＫａＲａ 生物公司ꎮ
引物订购和测序反应均由华大生物有限公司完成ꎮ
限制性内切酶购自 Ｔｈｅｒｍｏ 公司ꎮ 其它试剂购自上
海生工生物有限公司ꎮ
１.３ 主要方法
１.３.１ ＲＮＡ提取和 ｃＤＮＡ的合成 拟南芥总 ＲＮＡ 的
提取按照 ＴａＫａＲａ 生物公司 ＲＮＡ 提取试剂盒说明
书进行ꎮ 取 ２ μｇ不同组织的的总 ＲＮＡ用于反转录
反应ꎬ合成的 ｃＤＮＡ于－２０ ℃保存备用ꎮ
１.３.２ Ａｔ３ｇ０４０００ 基因的启动子、开放阅读框和全长
基因( － ９２７ ~ ＋ ９３３)的克隆 通过拟南芥数据库
(ｗｗｗ. ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ. ｏｒｇ)获得 Ａｔ３ｇ０４０００ 基因的完整
信息ꎮ 选取起始密码子(ＡＴＧ)上游 ９２７ ｂｐ 作为该
基因的启动子ꎮ 采用 Ｐｒｅｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５.０ 软件设计
Ａｔ３ｇ０４０００ 基因的启动子、开放阅读框和全长基因
序列(－９２７~ ＋９３３)的特异引物ꎬ附加所需的限制性
内切酶位点(表 １)ꎮ 以 ３周龄拟南芥莲座叶的 ＤＮＡ
为扩增 Ａｔ３ｇ０４０００ 基因启动子和全长基因( －９２７ ~
＋９３３)的模板ꎮ 以幼苗总 ＲＮＡ反转录合成的 ｃＤＮＡ
为扩增 Ａｔ３ｇ０４０００基因开放阅读框的模板ꎮ
１.３.３ 表达载体构建和拟南芥转化 通过酶切连接
的方法分别构建了 Ａｔ３ｇ０４０００ 表达模式分析载体、
亚细胞定位分析载体和基因过量表达载体(图 ２)ꎮ
(１)利用 ＫｐｎⅠ和 ＳｐｅⅠ限制性内切酶对扩增得到的
Ａｔ３ｇ０４０００ 基因的启动子产物和 ｐＧｒｅｅｎ Ⅱ￣０２２９￣
ＧＵＳ载体进行酶切反应ꎮ 通过 Ｔ４ 连接酶的连接作
用将 Ａｔ３ｇ０４０００ 基因的启动子序列连接到 ｐＧｒｅｅｎ
Ⅱ￣０２２９￣ＧＵＳ载体中ꎬ获得了 Ａｔ３ｇ０４０００基因表达模
式的分析载体 ＰｒｏＡｔ３ｇ０４０００:ＧＵＳꎮ (２)利用 ＫｐｎⅠ
和 ＳｐｅⅠ限制性内切酶将扩增得到的 Ａｔ３ｇ０４０００ 全
长基因( －９２７ ~ ＋９３３)产物和 ｐＧｒｅｅｎⅡ￣０２２９￣ＥＧＦＰ
载体进行酶切反应ꎮ 通过 Ｔ４ 连接酶的连接作用将
Ａｔ３ｇ０４０００全长基因( － ９２７ ~ ＋ ９３３)连接到 ｐＧｒｅｅｎ
Ⅱ￣０２２９￣ＥＧＦＰ 载体中ꎬ获得了 Ａｔ３ｇ０４０００ 基因亚细
胞定位的分析载体 Ａｔ３ｇ０４０００￣ＥＧＦＰꎮ (３)利用 Ｘｂａ
Ⅰ和 ＳｐｅⅠ限制性内切酶对扩增得到的 Ａｔ３ｇ０４０００
基因的开放阅读框产物和过量表达载体 ｐＢＡ００２ 分
别进行酶切反应ꎮ 通过 Ｔ４ 连接酶的连接作用将
Ａｔ３ｇ０４０００基因的开放阅读框序列连接到过量表达
载体 ｐＢＡ００２ 中ꎬ获得了带有 ＣａＭＶ３５Ｓ 启动子的过
量表达植物载体 Ａｔ３ｇ０４０００￣ＯＥꎮ
将测序正确的 Ａｔ３ｇ０４０００基因表达模式分析载
体、亚细胞定位分析载体和过量表达载体分别转入
农杆菌菌株 Ｃ５８Ｃ１ 中ꎮ 采用花苞浸泡法将 ３ 个表
达载体分别转化到拟南芥中ꎮ
１.３.４ Ａｔ３ｇ０４０００基因过量表达植株转录水平分析
提取 ４周龄的野生型和过量表达植株莲座叶的总
ＲＮＡ且反转录为 ｃＤＮＡꎮ 用半定量 ＲＴ￣ＰＣＲ 方法鉴
定过量表达植株中 Ａｔ３ｇ０４０００基因的转录水平ꎮ
１.３.５ Ａｔ３ｇ０４０００基因表达模式和蛋白质亚细胞定位
的分析 (１) ＰｒｏＡｔ３ｇ０４０００:ＧＵＳ 植株的 ＧＵＳ 染色
分析:将 ＰｒｏＡｔ３ｇ０４０００:ＧＵＳ转基因植株的不同组织
分别置入配置好的 ＧＵＳ 染色液中ꎬ３７ ℃保温过夜ꎮ
将染色好的植物组织置于固定液(乙醇 ∶ 乙酸 ＝
３ ∶ １)中固定脱色 ２ ｈꎬ然后用透明剂进行透明处理ꎮ
００７ 广 西 植 物 ３６卷
表 １ 本文中用到的引物
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ 用途 Ｕｓｅ
Ａｔ３ｇ０４０００￣Ｆ１￣ＫｐｎⅠ ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＧＣＧＡＧＣＴＣＴＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＣ 克隆启动子
Ｃｌｏｎｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｅｒ
Ａｔ３ｇ０４０００￣Ｒ１￣ＢａｍＨⅠ ＣＴＣＧＧＡＴＣＣＡＣＴＧＴＴＡＧＧＴＡＧＡＴＴＴＴＡＣＴＡＴＡ 克隆启动子
Ｃｌｏｎｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｅｒ
Ａｔ３ｇ０４０００￣Ｆ２￣ＸｂａⅠ ＴＴＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＣＡＴＣＡＧＴＴＴＣ 克隆开放阅读框序列
Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ
Ａｔ３ｇ０４０００￣Ｒ２￣ＳｐｅⅠ ＧＣＧＡＣＴＡＧＴＴＴＡＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＴＡＧＣＣ 克隆开放阅读框序列
Ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ
Ａｔ３ｇ０４０００￣Ｆ３￣ＫｐｎⅠ ＣＧＧＧＧＴＡＣＣＧＣＧＡＧＣＴＣＴＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＣ 克隆全长基因(－９２７~ ＋９３３)
Ｃｌｏｎｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ(￣９２７~ ＋９３３)
Ａｔ３ｇ０４０００￣Ｒ３￣ＢａｍＨⅠ ＣＡＧＧＧＡＴＣＣＧＧＣＴＧＣＣＧＣＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＴＡＧＣ 克隆全长基因(－９２７~ ＋９３３)
Ｃｌｏｎｉｎｇ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ(￣９２７~ ＋９３３)
Ａｔ３ｇ０４０００￣Ｆ４ ＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＣＡＴＣＡＧＴＴＴＣ 转录水平分析
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ
Ａｔ３ｇ０４０００￣Ｒ４ ＴＴＡＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＴＡＧＣＣ 转录水平分析
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ
Ａｔ３ｇ０４０００＿ｑＦ ＴＧＣＴＡＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＡＡＴＡＧＧ 实时定量 ＰＣＲ
Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ￣ＰＣＲ
Ａｔ３ｇ０４０００＿ｑＲ ＡＧＣＣＧＴＧＴＡＴＧＡＧＣＣＡＴＡＧＴＴＴ 实时定量 ＰＣＲ
Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＲＴ￣ＰＣＲ
ＡＣＴＩＮ２￣ｑＦ ＴＧＧＧＡＴＧＡＡＣＣＡＧＡＡＧＧＡＴＧ 内参基因
Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ
ＡＣＴＩＮ２￣ｑＲ ＡＡＧＡＡＴＡＣＣＴＣＴＣＴＴＧＧＡＴＴＧＴＧＣ 内参基因
Ｈｏｕｓｅｋｅｅｐｉｎｇ ｇｅｎｅ
Ａｔ３ｇ０４０００￣Ｆ５ ＧＣＧＡＧＣＴＣＴＴＣＣＴＣＧＧＴＧＡＣ 鉴定 ＰｒｏＡｔ３ｇ０４０００:ＧＵＳ转基因植株
Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰｒｏＡｔ３ｇ０４０００:ＧＵＳ
ＧＵＳ￣Ｒ ＡＣＣＡＡＣＧＣＴＧＡＴＣＡＡＴＴＣＣＡＣ 鉴定 ＰｒｏＡｔ３ｇ０４０００:ＧＵＳ转基因植株
Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰｒｏＡｔ３ｇ０４０００:ＧＵＳ
Ａｔ３ｇ０４０００￣Ｆ４ ＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＣＧＴＣＡＴＣＡＧＴＴＴＣ 鉴定 Ａｔ３ｇ０４０００￣ＥＧＦＰ 转基因植株
Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｔ３ｇ０４０００￣ＥＧＦＰ
ＥＧＦＰ￣Ｒ ＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＴ 鉴定 Ａｔ３ｇ０４０００￣ＥＧＦＰ 转基因植株
Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｔ３ｇ０４０００￣ＥＧＦＰ
３５Ｓ￣Ｆ ＣＣＡＣＧＴＣＴＴＣＡＡＡＧＣＡＡＧＴＧ 鉴定 Ａｔ３ｇ０４０００￣ＯＥ转基因植株
Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｔ３ｇ０４０００￣ＯＥ
Ａｔ３ｇ０４０００￣Ｒ４ ＴＴＡＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＴＴＡＧＣＣ 鉴定 Ａｔ３ｇ０４０００￣ＯＥ转基因植株
Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｔ３ｇ０４０００￣ＯＥ
注: 下划线标识引入的酶切位点ꎮ Ｎｏｔｅ: Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅ ｉｓ ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ.
将透明好的植物材料置于显微镜下观察和拍照ꎮ
(２)Ａｔ３ｇ０４０００ 基因的实时定量 ＰＣＲ 分析:以拟南
芥的不同组织总 ＲＮＡ 反转录得到的 ｃＤＮＡ 作为模
板ꎬ以持家基因 ＡＣＴＩＮ２ 基因为内参ꎬ进行实时定量
ＰＣＲ 反 应ꎮ 用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５. ０ 软 件 设 计
Ａｔ３ｇ０４０００基因的特异引物作为扩增引物(表 １)ꎮ
扩增程序如下:预变性 ９４ ℃ ２ ｍｉｎꎻ 变性 ９４ ℃ １０
ｓꎬ退火 ６０ ℃ １０ ｓꎬ延伸 ７２ ℃ ２０ ｓꎬ４０个循环ꎮ 每个
反应进行 ３ 次技术重复ꎮ (３) Ａｔ３ｇ０４０００ 蛋白的亚
细胞定位分析:以转基因拟南芥 Ａｔ３ｇ０４０００￣ＥＧＦＰ
的 Ｔ２代幼苗的子叶作为实验材料ꎬ置于共聚焦显微
镜下观察和拍照ꎮ
２ 结果与分析
２.１ 拟南芥 Ａｔ３ｇ０４０００ 基因的启动子、开放阅读框和
全长基因(－９２７~ ＋９３３)的克隆及转基因植株的获得
根据拟南芥数据库中的基因信息ꎬＡｔ３ｇ０４０００
基因的开放阅读框为 ８１６ ｂｐꎬ 编码了 ２７２ 个氨基
酸ꎮ 以野生型拟南芥的 ＤＮＡ 为模板ꎬ通过 ＰＣＲ 扩
增分别获得 Ａｔ３ｇ０４０００ 基因的启动子和全长基因
(－９２７~ ＋９３３)的扩增产物(图 １)ꎮ 以野生型拟南
芥幼苗总 ＲＮＡ 反转录得到的 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ通过
ＰＣＲ扩增获得 Ａｔ３ｇ０４０００基因开放阅读框的扩增产
１０７６期 包曙光等: 拟南芥醛还原酶编码基因 Ａｔ３ｇ０４０００表达模式分析及过量表达转基因植株获得
物(图 １)ꎮ 用酶切连接的方法分别构建 Ａｔ３ｇ０４０００
基因的表达模式分析载体 ＰｒｏＡｔ３ｇ０４０００:ＧＵＳ、亚细
胞定位分析载体 Ａｔ３ｇ０４０００￣ＥＧＦＰ 和过量表达载体
Ａｔ３ｇ０４０００￣ＯＥ(图 ２:Ａ、Ｂ、Ｃ)ꎮ 通过花苞浸泡法分
别获得 ３个表达载体的转基因植株ꎬ并利用 ＰＣＲ对
所获得的转基因植株进行鉴定ꎬ获得了转基因阳性
植株(图 ２:Ｄ、Ｅ、Ｆ)ꎮ
图 １ 拟南芥醛还原酶编码基因 Ａｔ３ｇ０４０００ 启动子、
全长基因(－９２７~ ＋９３３)和开放阅读框 ＰＣＲ 扩增产物
的凝胶电泳结果 Ｍ. ＤＮＡ分子量标准ꎻ Ａ. Ａｔ３ｇ０４０００启动
子的扩增产物ꎻ Ｂ. Ａｔ３ｇ０４０００全长基因(－９２７~ ＋９３３)的扩增产
物ꎻ Ｃ. Ａｔ３ｇ０４０００基因开放阅读框的扩增产物ꎮ
Ｆｉｇ. １ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｐｒｏｍｏｔｅｒꎬ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
(－９２７ － ＋ ９３３) ａｎｄ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ａｌｄｅｈｙｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅ Ａｔ３ｇ０４０００ ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ
ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ｍ. ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ Ａ. ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ
Ａｔ３ｇ０４０００ ｐｒｏｍｏｔｅｒꎻ Ｂ. ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ａｔ３ｇ０４０００ ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
(－９２７－＋９３３)ꎻ Ｃ. ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ Ａｔ３ｇ０４０００ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ.
２.２ Ａｔ３ｇ０４０００基因表达模式的分析
为检测 Ａｔ３ｇ０４０００ 基因的表达模式ꎬ分别以野
生型拟南芥的根、幼苗、莲座叶、茎生叶、茎秆、花和
角果为材料ꎬ对拟南芥不同组织中 Ａｔ３ｇ０４０００ 基因
的表达水平进行实时定量 ＰＣＲ检测ꎮ 由图 ３ 可知ꎬ
Ａｔ３ｇ０４０００ 基因在所有检测组织中均有表达ꎬ但表
达水平明显不同ꎮ Ａｔ３ｇ０４０００ 基因在幼苗中的表达
水平最高ꎬ在莲座叶、茎生叶、花序和角果中也均有
较高的表达水平ꎻＡｔ３ｇ０４０００ 基因在茎秆中的表达
水平最低ꎬ在根中的表达水平也较低(图 ３)ꎮ
为了进一步检测 Ａｔ３ｇ０４０００基因在不同组织表
达的特异性ꎬ通过 ＧＵＳ 组织化学染色法分析了
ＰｒｏＡｔ３ｇ０４０００:ＧＵＳ 转基因植株的不同组织中
Ａｔ３ｇ０４０００基因的表达情况ꎮ 分别将 ＰｒｏＡｔ３ｇ０４０００:
ＧＵＳ转基因植株的不同组织材料置于 ＧＵＳ 染色液
中 ３７ ℃ 保温过夜ꎮ 通过显微镜观察发现ꎬ
ＰｒｏＡｔ３ｇ０４０００:ＧＵＳ 转基因植株的幼苗、莲座叶、花
序中都有染色ꎮ 在幼苗的整个子叶中都有强的染
色ꎬ尤其在维管组织和保卫细胞中ꎬ而在根部维管组
织中染色较弱ꎻ在莲座叶维管组织和保卫细胞中有
强的染色ꎻ在花序中仅在萼片的维管组织和保卫细
胞中有强的染色(图 ４)ꎮ
２.３ Ａｔ３ｇ０４０００蛋白亚细胞定位的分析
为了检测 Ａｔ３ｇ０４０００ 蛋白的亚细胞定位模式ꎬ
以 Ａｔ３ｇ０４０００￣ＥＧＦＰ 转基因拟南芥幼苗的子叶为材
料分析 Ａｔ３ｇ０４０００ 的亚细胞定位模式ꎮ 通过共聚焦
显微镜观察可知ꎬＡｔ３ｇ０４０００ 并不定位于叶绿体中ꎬ
而是定位在细胞质和细胞核中(图 ５)ꎮ
２.４ Ａｔ３ｇ０４０００基因过量表达植株的获得及相对转
录水平分析
为了研究 Ａｔ３ｇ０４０００基因在拟南芥的生长发育
过程中的作用ꎬ采用酶切连接的方法构建了
Ａｔ３ｇ０４０００基因的过量表达载体 Ａｔ３ｇ０４０００￣ＯＥ(图
２:Ｃ)ꎮ 通过农杆菌介导法将测序正确的过量表达
载体转入拟南芥中并获得了 Ａｔ３ｇ０４０００￣ＯＥ 转基因
拟南芥的 Ｔ１ 代种子ꎮ 由于过量表达载体 ｐＢＡ００２
中有除草剂抗性基因ꎬ因此采用除草剂筛选获得了
Ｔ１代抗性植株ꎮ 通过 ＰＣＲ 进行基因型鉴定进一步
获得了转基因阳性植株(图 ２:Ｆ)ꎮ 将不同转基因株
系的 Ｔ２代拟南芥种子播种于土中ꎬ用除草剂进行筛
选ꎮ 选择抗性苗与非抗性苗比例为 ３ ∶ １ 分离的株
系作为继续筛选的材料ꎮ 通过除草剂的筛选获得了
纯合的 Ａｔ３ｇ０４０００￣ＯＥ 转基因单拷贝株系ꎮ 为了检
验转基因植株中 Ａｔ３ｇ０４０００ 转录水平的变化ꎬ采用
半定量 ＲＴ￣ＰＣＲ分析了转基因植株中 Ａｔ３ｇ０４０００ 的
相对转录水平ꎬ表明转基因株系 Ａｔ３ｇ０４０００￣ＯＥ￣１ ＃、
５＃ 和 ２２ ＃中 Ａｔ３ｇ０４０００ 基因的表达量均明显的高
于野生型(图 ６)ꎮ 这表明获得的纯合 Ａｔ３ｇ０４０００￣
ＯＥ￣１ ＃、５ ＃和 ２２ ＃株系是 Ａｔ３ｇ０４０００ 基因过量表达
转基因株系ꎮ
３ 讨论
植物体内的有氧代谢过程会产生活性氧ꎬ此外
当植物受到外界环境胁迫时也会有活性氧在细胞中
大量累积(Ａｓａｄａꎬ１９９９ꎻＴｈａｎｎｉｃｋａｌ ＆ Ｆａｎｂｕｒｇꎬ２０００ꎻ
薛鑫等ꎬ２０１３)ꎮ 活性氧的过量积累会造成植物体
内脂质的过氧化ꎬ 从而引起大量醛的累积(Ｂｕｒｃｈａｍꎬ
２０７ 广 西 植 物 ３６卷
图 ２ 拟南芥醛还原酶编码基因 Ａｔ３ｇ０４０００载体构建示意图和转基因植株 ＰＣＲ鉴定结果 Ａ. 表达模式分析载体构建示意
图ꎻ Ｂ. 亚细胞定位载体构建示意图ꎻ Ｃ. 过量表达载体的构建示意图ꎻ Ｄ. ＰｒｏＡｔ３ｇ０４０００:ＧＵＳ 转基因拟南芥 ＰＣＲ鉴定结果ꎬ１－９、１１－１４ 和
１６＃为转基因阳性植株ꎻ Ｍ: ＤＮＡ分子量标准ꎻ Ｐ. 阳性对照ꎻ Ｎ. 阴性对照ꎻ Ｅ. Ａｔ３ｇ０４０００－ＥＧＦＰ 转基因拟南芥 ＰＣＲ鉴定结果ꎬ１－６、８－１１和
１３－１６为转基因阳性植株ꎻ Ｍ: ＤＮＡ分子量标准ꎻ Ｐ. 阳性对照ꎻ Ｎ. 阴性对照ꎻ Ｆ. Ａｔ３ｇ０４０００￣ＯＥ 转基因拟南芥 ＰＣＲ鉴定结果ꎬ１－２５和 ２７－
３１＃为转基因阳性植株ꎻ Ｍ. ＤＮＡ分子量标准ꎻ Ｐ. 阳性对照ꎻ Ｎ. 阴性对照ꎮ
Ｆｉｇ. ２ Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｄｉａｇｒａｍｓ ｏｆ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｖｅｃｔｏｒ ａｎｄ ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ａｌｄｅｈｙｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ
ｇｅｎｅ Ａｔ３ｇ０４０００ Ａ. Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｄｉａｇｒａｍ ｏｆ ｔｈｅ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎ ｏｆ ｔｈｅ Ａｔ３ｇ０４０００ ｇｅｎｅꎻ Ｂ. Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｄｉａｇｒａｍ ｏｆ ｔｈｅ
ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｆｏｒ ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｏｆ ｔｈｅ Ａｔ３ｇ０４０００ ｇｅｎｅꎻ Ｃ. Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ ｄｉａｇｒａｍ ｏｆ ｔｈｅ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒ Ａｔ３ｇ０４０００ ｇｅｎｅ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ. Ｄ. ＰＣＲ
ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＰｒｏＡｔ３ｇ０４０００:ＧＵＳ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓꎬ １－９ꎬ １１－１４ ａｎｄ １６ ＃ ａｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓꎻ Ｍ. ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｐ. Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ
Ｎ. Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｅ. ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ａｔ３ｇ０４０００￣ＥＧＦＰ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓꎬ １－６ꎬ ８－１１ ａｎｄ １３－１６ ＃ ａｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓꎻ Ｍ. ＤＮＡ ｍａｒｋ￣
ｅｒꎻ Ｐ. Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｎ. Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｆ. ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ Ａｔ３ｇ０４０００￣ＯＥ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓꎬ １－２５ ａｎｄ ２７－３１ ＃ ａｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓꎻ
Ｍ. ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ Ｐ. Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｎ. Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ.
图 ３ 拟南芥 Ａｔ３ｇ０４０００基因在拟南芥不同组织的表达水平
Ｆｉｇ. ３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ａｔ３ｇ０４０００ ｇｅｎｅ
ｉｎ ｖａｒｉｏｕｓ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｉｓｓｕｅｓ
１９９８)ꎮ 在逆境胁迫下植物体内醛的过量积累是引
起植物伤害的重要因素之一(Ｍａｎｏ ｅｔ ａｌꎬ２００５ꎻＹｉｎ
ｅｔ ａｌꎬ２０１０)ꎮ 清除植物体内过量累积的醛类物质有
利于解除植物所受到的毒害和提高抗逆性(张海玲
等ꎬ２０１０ꎻ吴茜等ꎬ２０１５)ꎮ 植物体内的 αꎬβ￣不饱和
的活性醛是一类对细胞产生毒害的醛类物质(Ｙａｍ￣
ａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌꎬ２０１１)ꎮ 因此清除植物体内的 αꎬβ￣不饱
和的活性醛有利于解除细胞受到的毒害ꎮ Ｙａｍａｕｃｈｉ
ｅｔ ａｌ(２０１１)通过体外酶活测定实验和瞬时表达技术
鉴定了 Ａｔ３ｇ０４０００是一个 ＮＡＤＰＨ 依赖的定位于叶
绿体的拟南芥醛还原酶ꎮ 然而ꎬ本研究通过实时定
量 ＰＣＲ检测和 ＧＵＳ 染色分析可知:Ａｔ３ｇ０４０００ 基因
不仅在拟南芥的子叶、莲座叶和萼片中有表达ꎬ而且
在根部也有明显的表达ꎮ 因此推测:Ａｔ３ｇ０４０００ 基
因可能并不仅仅定位于叶绿体ꎮ
本研究主要构建了拟南芥醛还原酶编码基因
Ａｔ３ｇ０４０００ 的表达模式分析载体、亚细胞定位载体
和过量表达载体ꎮ 通过农杆菌介导的转化方法分别
获得了转基因的拟南芥植株ꎮ ＧＵＳ 染色分析和实
时定量 ＰＣＲ 检测的结果都表明 Ａｔ３ｇ０４０００ 基因在
拟南芥的根部有表达ꎮ 尽管 Ａｔ３ｇ０４０００ 在拟南芥根
部表达的水平较低ꎬ然而表达模式的分析结果却暗
示着 Ａｔ３ｇ０４０００ 并不仅仅定位在叶绿体ꎮ 为了确定
Ａｔ３ｇ０４０００ 基因的亚细胞定位ꎬ采用酶切连接的方
法将 Ａｔ３ｇ０４０００全长基因( －９２７ ~ ＋９３３)与绿色荧
光蛋白(ＧＦＰ)编码基因融合构建了亚细胞定位表达
载体 Ａｔ３ｇ０４０００￣ＥＧＦＰꎮ 以 Ａｔ３ｇ０４０００￣ＥＧＦＰ 转基因
拟南芥幼苗的子叶作为观察材料分析了 Ａｔ３ｇ０４０００
亚细胞定位模式ꎮ 本研究表明ꎬＡｔ３ｇ０４０００ 并不定
位于叶绿体中ꎬ而是定位于细胞质和细胞核ꎮ
Ｙａｍａｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ(２０１１)是以紫鸭跖草为材料采用
瞬时表达技术证明 Ａｔ３ｇ０４０００ 定位于叶绿体ꎮ 他们
用于亚细胞定位的表达载体中的启动子为 ＣａＭＶ３５Ｓ
启动子ꎬ 而且只选择了 Ａｔ３ｇ０４０００Ｎ 端的 １２４个氨基
３０７６期 包曙光等: 拟南芥醛还原酶编码基因 Ａｔ３ｇ０４０００表达模式分析及过量表达转基因植株获得
图 ４ ＰｒｏＡｔ３ｇ０４０００:ＧＵＳ 转基因植株的 ＧＵＳ染色分析 Ａ. ５ ｄ龄幼苗ꎻ Ｂ. 幼苗子叶的放大图ꎻ Ｃ. 幼苗子叶的局部放大图ꎬ显示
保卫细胞ꎻ Ｄ. 幼苗根部的放大图ꎻ Ｅ. ３ ｄ龄黑暗培养的幼苗子叶ꎻ Ｆ. １６ ｄ龄的拟南芥ꎻ Ｇ. 完全伸展的莲座叶ꎻ Ｈ. 花序ꎻ Ｉ. 花ꎮ
Ｆｉｇ. ４ ＧＵＳ ｓｔａｉｎｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＰｒｏＡｔ３ｇ０４０００:ＧＵＳ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ Ａ. Ｆｉｖｅ￣ｄａｙ￣ｏｌｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇꎻ Ｂ. Ｍａｇｎｉｆｉｅｄ ｆｉｇｕｒｅ ｏｆ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｃｏｔｙｌｅ￣
ｄｏｎꎻ Ｃ. Ｍａｇｎｉｆｉｅｄ ｆｉｇｕｒｅ ｏｆ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎꎬ ｈｉｇｈｌｉｇｈｔ ｔｈｅ ｇｕａｒｄ ｃｅｌｌｓꎻ Ｄ. Ｍａｇｎｉｆｉｅｄ ｆｉｇｕｒｅ ｏｆ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｒｏｏｔꎻ Ｅ. Ｔｈｒｅｅ￣ｄａｙ￣ｏｌｄ ｓｅｅｄｌｉｎｇ ｕｎｄｅｒ ｄａｒｋ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔꎻ Ｆ. Ｓｉｘｔｅｅｎ￣ｄａｙ￣ｏｌｄ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓꎻ Ｇ. Ｆｕｌｌｙ ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｒｏｓｅｔｔｅ ｌｅａｆꎻ Ｈ. Ｉｎｆｌｏｒｅｓｃｅｎｃｅꎻ Ｉ. Ｆｌｏｗｅｒ.
酸与 ＧＦＰ 形成融合蛋白ꎮ 本研究中用于亚细胞定
位分析的载体中的启动子为 Ａｔ３ｇ０４０００ 基因的自身
启动子ꎬ而且采用 Ａｔ３ｇ０４０００ 完整蛋白与 ＧＦＰ 形成
融合蛋白ꎬ并以稳定转化的转基因拟南芥作为观察
材料ꎮ 因此ꎬ本研究中的亚细胞定位分析结果更具
准确性和科学性ꎮ 本研究表明ꎬＡｔ３ｇ０４０００不是拟南
芥叶绿体醛还原酶(ＡｔＣｈｌＡＤＲｓ)ꎬ而是拟南芥细胞质
醛还原酶 ( Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＮＡＤＰＨ￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ
ＡＤＲｓꎬ ＡｔＣｙｔＡＤＲｓ)ꎮ 另外ꎬＡｔ３ｇ０４０００ 定位于细胞
核也暗示着该酶可能存在着其它的功能ꎮ
４０７ 广 西 植 物 ３６卷
图 ５ Ａｔ３ｇ０４０００的亚细胞定位分析 Ａ. Ａｔ３ｇ０４０００－绿色荧
光蛋白信号ꎻ Ｂ. 叶绿体自发荧光信号ꎻ Ｃ. Ａ和 Ｂ图叠加后图像ꎮ
Ｆｉｇ. ５ Ａａｎｌｙｓｉｓ ｏｎ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｔ３ｇ０４０００
ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ. Ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｉｇｎａｌꎻ Ｂ. Ａｕｔｏ￣ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ｓｉｇｎａｌ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔꎻ Ｃ. Ｍｅｒｇｅｄ ｉｍａｇｅ.
为了更深入研究 Ａｔ３ｇ０４０００ 的功能ꎬ本研究虽
获得了纯合的 Ａｔ３ｇ０４０００ 过量表达转基因拟南芥ꎬ
但在正常生长条件下过量表达植株与野生型相比未
展现出明显的区别ꎮ 对于拟南芥醛还原酶编码基因
Ａｔ３ｇ０４０００的功能分析还需要进一步研究才能掌握
该基因在植物抗逆中的作用ꎮ 本文为进一步研究拟
南芥醛还原酶在植物抗逆中的功能奠定了基础ꎮ
参考文献:
ＡＳＡＤＡ Ｋꎬ １９９９. Ｔｈｅ ｗａｔｅｒ￣ｗａｔｅｒ ｃｙｃｌｅ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔｓ: ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ
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Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌꎬ ５０:６０１－６３９.
图 ６ Ａｔ３ｇ０４０００￣ＯＥ 转基因植株中 Ａｔ３ｇ０４０００基因的
转录水平分析 Ａｔ３ｇ０４０００￣ＯＥ￣１＃、５＃ 和 ２２＃为 Ａｔ３ｇ０４０００ 的
过量表达株系ꎻＡＣＴＩＮ２作为内参基因ꎮ
Ｆｉｇ. ６ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ａｔ３ｇ０４０００ ｇｅｎｅ Ａｔ３ｇ０４０００￣
ＯＥ￣１＃ꎬ ５＃ ａｎｄ ２２＃ ｗｅｒｅ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｉｎｅｓ ｏｆ Ａｔ３ｇ０４０００. ＡＣＴＩＮ２
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