全 文 ：忍冬科药用植物 DNA条形码通用序列的筛选
刘震 1 , 陈科力 1＊ , 罗焜 1, 2 , 潘宏林 1 , 陈士林 2
(1.省部共建中药资源和中药复方教育部重点实验室 湖北中医学院 , 湖北 武汉 430065;
2.中国医学科学院 北京协和医学院 药用植物研究所 , 北京 100193)
[摘要 ] 目的:从 4条 DNA片段(psbA-trnH, matK, rbcL,和 ITS2)中筛选可用于忍冬科药用植物鉴定的 DNA条形码通用
序列。方法:通过比较各序列的 PCR扩增成功率 、测序效率 、种内和种间变异 、barcodinggap和鉴定成功率等指标评价不同序
列在忍冬科植物中的鉴定能力。结果:对忍冬科 13个属 , 33个物种 , 58个样本进行分析 , ITS2序列在属水平上的鉴定成功率
为 100.0%, 物种水平上的鉴定成功率为 96.6%。结论:ITS2序列可以作为忍冬科植物的 DNA条形码候选序列 , 同时推荐 ps-
bA-trnH序列作为 ITS2序列的补充序列 。
[关键词 ] DNA条形码;忍冬科;ITS2;psbA-trnH;matK;rbcL
[稿件编号 ] 20100402001
[基金项目 ] 国际科技合作项目(2007DFA30990);卫生行业科研
专项(200802043)
[通信作者 ] ＊陈科力 ,教授 ,博士生导师 , Tel:(027)68890106, E-
mail:kelichen@ 126.com
[作者简介 ] 刘震 ,硕士研究生,研究方向为中药资源及其品质研究
忍冬科 Caprifoliaceae植物在中国有 12属 200
余种 ,其中许多为重要的药用植物 ,如接骨木属接骨
木 SambucuswiliamsiHance.及同属多种植物具有
祛风利湿 、舒筋活血之功效 ,我国民间广泛用于治疗
风湿痹痛 、跌打损伤 、骨折等症;忍冬属忍冬 Lonicera
japonicaThunb.和华南忍冬 L.confusaDC等分别为
金银花和山银花的原植物 ,其花蕾具有清热解毒 ,凉
散风热的功效 ,用于热毒血痢 、风热感冒 、温病发热
等症[ 1] ,目前已记载的忍冬属药用植物有 47种 [ 2] ,
荚迷属珊瑚树 ViburnumodoratisimumKer-Gawl.是
优良的观赏和绿化植物 ,其枝叶可用于跌打损伤 、骨
折等 ,该属药用植物湖北记载的就有 21种[ 3] 。因
此 ,对其物种和资源进行鉴定研究 ,对促进该科植物
的开发和利用具有重要意义。
DNA条形码(DNAbarcoding)是近年来国际上生
物多样性研究的热点 ,其核心是选择 1条通用 DNA
序列 ,对物种进行快速 、准确的鉴定。 2003年 Hebert
等对动物界 11个门 13 320个物种的 CO1(cytochrome
coxidasesubunit1)基因序列进行分析 ,发现该序列
的种间变异能较好的区分物种 ,随后 CO1基因被公
认为动物界中标准的 DNA条形码基因[ 4] 。与线粒体
CO1基因在动物条形码研究中的优异表现比较 ,植物
DNA条形码研究进展相对缓慢 。 2009年 CBOL(Con-
sortiumfortheBarcodeofLife)推荐以 rbcL+matK组
成的复合序列作为整个植物界通用的 DNA条形码序
列[ 5] 。陈士林等分析超过 6 000个植物样本后 ,发现
nrDNAITS2序列的扩增成功率较高 ,且物种水平的
鉴定成功率达 92.7%[ 6] 。而众多学者推荐的 psbA-
trnH序列在扩增成功率和物种识别率方面有着优良
的表现 [ 7-9] 。目前 ITS2, psbA-trnH, rbcL, matK, rbcL+
matK这几个候选序列或序列组合由于通用性较好 ,
扩增成功率和物种识别率较高 ,是植物条形码研究中
重点推荐的候选序列。但针对每一个具体的科 、属及
其物种 ,其通用条形码还需要进行深入的选择和验
证。已有学者对不同药用植物科 、属的 DNA条形码
序列进行了深入的考察[ 7, 10-13] ,但还没有对忍冬科的
DNA条形码进行筛选。本试验选取上述 4个热点候
选序列针对忍冬科 5属 15个物种 26个样本进行比
较研究 ,验证各候选序列在该科的鉴定能力 ,为 DNA
条形码技术应用于忍冬科研究提供依据。
1 材料
忍冬科实验材料 15个物种 26份样品采自武
汉 、江西 、广西 ,选取样本新鲜嫩叶硅胶快速干燥 ,并
对所选样品进行凭证标本 、数字影像的采集 ,经湖北
中医学院药用植物教研室潘宏林教授和中科院武汉
植物园张守君工程师鉴定 ,凭证标本或影像资料保
存于湖北中医学院标本馆(表 1)。本文扩展分析应
用的 ITS2序列信息来自 GenBank(表 2)。
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表 1 材料来源
中文名 拉丁名 采集地 经度 纬度 栽培 野生 采样数
猬实 Kolkwitziaamabilis 湖北 114°25′ 30°33′ 栽培 2
忍冬 Lonicerajaponica 江西 115°58′ 29°33′ 野生 1
华南忍冬 L.confusa 广西 108°19′ 22°51′ 栽培 1
水忍冬 L.dasystyla 广西 108°19′ 22°51′ 野生 1
黄褐毛忍冬 L.fulvotomentosa 广西 108°12′ 21°32′ 野生 1
灰毡毛忍冬 L.macranthoides 广西 108°11′ 21°32′ 野生 1
接骨草 Sambucuschinensis 湖北 114°25′ 30°33′ 栽培 2
接骨草 S.chinensis 广西 108°11′ 21°32′ 野生 3
接骨木 S.wiliamsi 江西 115°58′ 29°33′ 野生 2
七子花 Heptacodiummiconioides 湖北 114°25′ 30°33′ 栽培 1
珊瑚树 Viburnumodoratisinum 湖北 114°25′ 30°33′ 栽培 1
珊瑚树 V.odoratisinum 广西 108°19′ 22°51′ 野生 1
三叶荚蒾 V.ternatum 湖北 114°25′ 30°33′ 栽培 2
水红木 V.cylindricum 湖北 114°25′ 30°33′ 栽培 1
阔叶荚蒾 V.lobophylum 湖北 114°25′ 30°33′ 栽培 2
显脉荚蒾 V.nervosum 湖北 114°25′ 30°33′ 栽培 2
直角荚蒾 V.foetidumvar.rectangulatum 湖北 114°25′ 30°33′ 栽培 2
表 2 GenBank数据库获得 ITS2序列具体属种情况
及 GenBank登录号信息
属名 拉丁名 GenBank登录号
六道木属 Abeliachinensis FJ745388
黄锦带属 Diervilarivularis AF078721
黄锦带属 D.sesilifolia AF078723
黄锦带属 D.sesilifolia AY236177
双盾木属 Dipeltafloribunda FJ745389
鬼吹箫属 Leycesteriacrocothyrsos AF265277
鬼吹箫属 L.formosa AF265276
鬼吹箫属 L.formosa AY236172
北极花属 Linnaeaborealis AY236181
毛核木属 Symphoricarposalbus AF265282
毛核木属 S.hesperius EU240667
毛核木属 S.occidentalis EU240668
毛核木属 S.occidentalis FJ217824
毛核木属 S.orbiculatus AF265281
毛核木属 S.orbiculatus AY236174
毛核木属 S.orbiculatus EU240669
莛子藨属 Triosteumangustifolium AF265292
莛子藨属 T.himalayanum AF265286
莛子藨属 T.himalayanum AF265288
莛子藨属 T.himalayanum AF265289
莛子藨属 T.perfoliatum AF265291
莛子藨属 T.pinnatifidum AF265283
莛子藨属 T.pinnatifidum AF265284
莛子藨属 T.pinnatifidum AF265285
莛子藨属 T.sinuatum AF265293
锦带花属 Weigelacoraensis AF078718
锦带花属 W.hortensis AB055081
锦带花属 W.hortensis AB055083
锦带花属 W.hortensis AB055085
锦带花属 W.hortensis AF078713
锦带花属 W.hortensis AF078714
锦带花属 W.maximowiczi AB055087
锦带花属 W.maximowiczi AF078719
锦带花属 W.middendorfiana AF078720
2 方法
2.1 样品 DNA的提取 、PCR扩增和测序 选取硅
胶干燥的植物叶片约 10 mg,用 DNA提取研磨仪
(RetschMM400, Germany)研磨 1 min(30次 /s)后 ,
利用植物 DNA提取试剂盒 (TiangenBiotechCo.,
China)提取总 DNA。 PCR反应体积为 25 μL,体系
内含 MgCl2 2.0 μL(25 mmol· L-1), dNTP2.0 μL
(2.5 mmol· L-1), PCR10×bufer2.5μL, DNA条
形码通用引物各 1.0 μL(2.5 μmol· L-1)(Sangon
Co., China)、聚合酶 1.0 U(BiocolorBioScience＆
TechnologyCo., China)、总 DNA1 μL(约 30 ng)。
PCR反应条件 、通用引物及扩增程序参考陈士林
等[ 6]的研究 ,扩增产物经纯化后 ,使用 ABI3730XL
测序仪(AppliedBiosystemsCo., USA)测序。
2.2 数据处理 测序峰图采用序列拼接软件
CodonCodeAlignerV2.06 (CodonCodeCo., USA)
校对拼接 ,去除低质量序列及引物区 ,所得各序列经
ClustalW 1.83[ 14]进行序列比对 ,使用 MEGA4.0软
件计算 K-2-P距离值 ,通过分析比较序列的种内和
种间变异:①用 3个参数来评估物种不同序列的种
间差异[ 6, 15-16] :物种种间变异;物种平均种间变异
(消除物种采样数目不同造成的误差);物种种间最
小变异。 ②用 3个参数来评估物种不同序列的种内
偏差 [ 16] :物种种内变异;物种种内平均变异(消除物
种采样数目不同造成的误差);物种种内最大变异。
利用 WilcoxonSignedRankTests检验比较在相同样
本量下两两序列种间 、种内变异大小 ,使用 TAXON
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DNA软件 [ 17]分析序列种内 、种间变异并作 barcod-
inggap图 , 采用比对法和最小距离法 [ 18] 计算各
DNA片段的鉴定效率 。
3 结果
3.1 PCR扩增效率和测序成功率 PCR扩增效率
和测序成功率是评价 DNA条形码序列的一个重要
指标 , 在各条候选序列的 PCR扩增效率中 , psbA-
trnH, ITS2, rbcL分别为 96.2%, 92.3%, 88.5%;测
序成功率 psbA-trnH, ITS2, rbcL均为 100%。本实验
使用生物条形码联盟植物工作组 (PlantWorking
GroupoftheConsortiumfortheBarcodeofLife, PWG-
CBOL)建议的 matK引物 ,在忍冬科 26个样本中全
部扩增失败 ,而 matK的 390F/1326R引物在忍冬科
中仅成功扩增 2个物种 。因此在后续研究中无法对
matK序列进行更加深入的考察。
3.2 不同 DNA条形码候选序列种内种间差异分析
理想的 DNA条形码序列应当具有明显的种间
变异 ,同时种内变异足够小。参照陈士林等[ 6]的方法
计算各候选序列的 6个 “阈值 ”以便更直观判断其种
间 、种内的变异。通过对忍冬科各条形码候选序列的
种内变异 、种间变异 、种间最小变异和种内最大变异
分析发现 , ITS2序列具有最大的种间变异 , psbA-trnH
序列次之 ,而 rbcL序列种间变异最小;同时 ITS2序列
种内差异也是最大的 ,而 psbA-trnH序列和 rbcL序列
种内变异都很小。rbcL序列虽然种内变异最小 ,但种
间变异也是最小的 ,不容易区分物种(表 3)。
利用 Wilcoxon检验分析两两序列种间 、种内变
异的差异情况 ,结果表明(表 4, 5):在种间变异上
ITS2序列的变异性大于其他各序列 ,其次是 psbA-
trnH序列。种内变异方面 ITS2序列大于 psbA-trnH
序列和 rbcL序列。此结论也与单一序列比较的结
论相一致 。
表 3 忍冬科 3个候选序列的种间种内差异
Markers ITS2 psbA-trnH rbcL
种间变异 0.040 2±0.025 7 0.021 4±0.016 9 0.005 7±0.003 1
平均种间变异 0.022 9±0.022 0 0.027 5±0.014 5 0.003 8±0.003 2
种间最小变异 0.010 7±0.012 7 0.017 9±0.023 0 0.000 8±0.001 1
种内变异 0.010 4±0.017 4 0.000 8±0.001 1 0.000 5±0.000 7
平均种内变异 0.018 9±0.023 0 0.000 2±0.000 5 0.000 1±0.000 3
种内最大变异 0.019 4±0.022 6 0.000 3±0.000 8 0.000 2±0.000 5
表 4 两两序列种间差异的 Wilcoxon检验
W+ W- 种间变异相关性 , n, P值 结果
ITS2 psbA-trnH W+=135.0, W-=18.0, n=17, P<0.005 6 ITS2 >psbA-trnH
ITS2 rbcL W+=136.0, W-=0.0, n=16, P<0.000 4 ITS2 >rbcL
psbA-trnH rbcL W+=105.0, W-=15.0, n=15, P<0.010 3 psbA-trnH>rbcL
表 5 两两序列种内差异的 Wilcoxon检验
W+ W- 种内变异相关性 , n, P值 结果
ITS2 psbA-trnH W+=113.0, W-=7.0, n=15, P<0.002 5 ITS2>psbA-trnH
ITS2 rbcL W+=113.0, W-=7.0, n=15, P<0.002 6 ITS2>rbcL
psbA-trnH rbcL W+=21.0, W-=0.0, n=6, P<0.014 3 psbA-trnH>rbcL
3.3 忍冬科不同 DNA条形码候选序列 barcoding
gap检验 理想的条形码检测到的种间遗传变异应
明显大于种内遗传变异 ,并在两者之间存在显著差
异 ,形成一个明显的间隔区 ,即 barcodinggap[ 16] 。
利用 TAXONDNA对所选序列进行分析 ,并计算
“barcodinggap”(图 1)。从不同序列种间变异和种
内变异的分布图(图中横坐标表示种间与种内变异
程度 ,纵坐标表示在不同变异值时物种的分布情
况)分析 , 3种 DNA片段的 “barcodinggap”都不明
显 ,但可以看出 psbA-trnH序列和 ITS2序列的种间
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与种内正态分布图有往两边分开的趋势 ,有利于区
分物种;rbcL序列正态分布图整体向种内变异方向
倾斜。
3.4 2种方法(比对法和最小距离法)鉴定的成功
率 本文使用 2种方法来评估 3个 DNA片段的鉴
定效率 ,发现 2种方法得到结果趋于一致:在属的水
平上 3条序列鉴定成功率均为 100%。在种的水平
上 ITS2, rbcL, psbA-trnH的鉴定成功率分别为
91.7%, 82.6%, 75.0%(表 6)。为了进一步验证
ITS2序列在整个忍冬科中的鉴定效率 ,加入了 Gen-
bank中忍冬科其他 8个属共计 58个样本 , 33个物
种进行分析 , ITS2属水平上的鉴定成功率仍为
100%,在物种水平上仅忍冬属的 2个物种之间存在
模糊鉴定 。
4 讨论
4.1 ITS2, psbA-trnH, matK和 rbcL片段作为 DNA
条形码候选片段的比较 rbcL序列具有通用 、易扩
增 、易比对的优点 ,但在种内种间变异的分析中可以
发现其种内变异最小 ,但是种间变异也很小 ,序列较
为保守;matK序列是植物叶绿体 DNA中进化较快
的一条编码区序列 ,也是多位研究者推荐的条形码
序列之一 ,但是 matK序列由于在忍冬科植物中几
乎无法扩增成功 ,因而无法使用 rbcL+matK的复合
序列对忍冬科进行鉴定效率的评价。
陈士林等 [ 6]对药用植物及近缘种的 4 800个物
种 6 600个样本进行研究 ,发现 ITS2序列在物种水
平的鉴定成功率超过 90%,证明 ITS2在药用植物鉴
定中将发挥关键作用 。本实验在研究中发现 , ITS2
在忍冬科物种鉴定方面具有以下优势:ITS2序列长
度较短 ,易扩增 。短序列更有利于获取发生降解的
样本序列 ,这对于 DNA条形码应用于中药材鉴定中
具有重要的意义 ;ITS2序列能够与保守的 5.8S和
表 6 比对法和最小距离法考察 3种 DNA片段的鉴定效率 %
序列 鉴定方法 鉴定成功率 鉴定错误率 模糊鉴定率种水平 属水平 种水平 属水平 种水平 属水平
ITS2 比对法 91.7 100 0 0 8.3 0
最小距离法 91.7 100 0 0 8.3 0
psbA-trnH 比对法 75.0 100 0 0 25.0 0
最小距离法 75.0 100 0 0 25.0 0
rbcL 比对法 82.6 100 0 0 17.4 0
最小距离法 82.6 100 0 0 17.4 0
26S区段形成特定的颈环二级结构[ 19, 20-21] , 这使
ITS2序列的处理和分析更加准确可靠;ITS2序列
具有进化速率快的特点 ,较高的变异程度使其在区
分物种方面能力较强 , ITS2与其他 2个 DNA片段相
比 ,具有最大的种间变异(表 3),并通过 DNABar-
codinggap证明了种间变异和种内变异的显著性差
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异(图 1),这也恰恰是衡量一个 DNA条形码序列成
功与否的关键。 ITS2的鉴定成功率 ,在属的水平上
为 100%,种的水平上为 91.7%,常用药用植物忍冬
L.japonicaThunb.,接骨木 S.wiliamsiHance.与
接骨草 S.chinensisLindl.,濒危植物猬实 K.amabi-
lisGraebn.,七子花 H.miconioidesRehd.等都可以
准确鉴别。
在试验中发现 , ITS2序列 PCR扩增失败和无法
鉴定成功的物种均属于忍冬属 ,该序列无法将极为
相近的灰毡毛忍冬 L.macranthoidesHand.-Mazz和
黄褐毛忍冬 L.fulvotomentosaHsuetSCCheng区分
开 ,但是可以完全区分开荚蒾属 6个近缘种 。对于
GenBank数据库内的锦带花属 4个物种 ,莛子藨属 5
个物种 ,毛核木属 4个物种 , ITS2序列可以全部准
确区分 。然而 , psbA-trnH序列在忍冬属中却具有很
高的扩增效率和鉴定成功率 ,且其种间变异仅次于
ITS2。对于采集到的样本中荚蒾属的 6个近缘种 ,
在区分阔叶荚蒾 V.lobophylumGraebn.和显脉荚
蒾 V.nervosumD.Don, 阔叶荚蒾 V.lobophylum
Graebn.和三叶荚蒾 V.ternatumRehd.时存在模糊
鉴定 。但是对于忍冬属的近缘物种却有很高的
鉴定成功率 。因此初步认为 psbA-trnH序列可以
显著弥补 ITS2在鉴定忍冬属物种水平上的不足 。
忍冬科 psbA-trnH序列在 GenBank数据库中并无
前人的研究数据 ,因此在忍冬科推出 psbA-trnH序
列 ,可以引起分类学家的注意和重视 。目前 , 在
植物界还难以发现一个理想的 DNA片段能区别
所有的物种 。这 2个基因片段在忍冬科物种鉴
定水平上各有所长 ,它们配合应用既能准确区分
物种 ,又能研究系统发生和亲缘关系的远近 , 具
有重要意义 。
4.2 DNA条形码技术应用于忍冬科的展望 由于
采样条件和采集样品数量的限制 ,本研究中所涉及
的物种仅分布在忍冬科 5个属内 ,虽然加入 Gen-
Bank数据后研究所涉及的属包含了忍冬科 15个属
中的 13个 ,但是对一些属内亲缘关系较近的物种的
分析尚不足 ,数据偏少 ,研究还有待在具体的属进一
步深入 。
[致谢 ] 中国科学院武汉植物园张守君工程师协助采
集部分样品并帮助鉴定部分标本。
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LIUZhen1 , CHENKeli1＊ , LUOKun1, 2 , PANHonglin1 , CHENShilin2
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MinistryofEducation, HubeiColegeofTraditionalChineseMedicine, Wuhan430065, China;
2.InstituteofMedicinalPlantDevelopment, ChineseAcademyofMedicalSciences, PekingUnion
MedicalColege, Beijing100193, China)
[ Abstract] Objective:TodeterminethecandidatesequenceswhichcanbeusedasDNAbarcodetoidentifyspeciesinCaprifo-
liaceaefamilybyscreeningoutfromfourdiferentDNAfragmentssequences.Method:PCRamplification, sequencingeficiency, dif-
ferentialintra-andinterspecificdivergences, theDNAbarcodinggapandidentificationeficiencywereusedtoevaluatetheseloci.Re-
sult:TheITS2wasusedasacandidatesequenceofDNAbarcodetoidentifythespeciesinCaprifoliaceaefamily, whoserateofsuccess
inidentificationingeneralevelwas100%andinspecies96.6%, andpsbA-trnHasacomplementarybarcodetoITS2forCaprifoliace-
ae.
[ Keywords] DNAbarcoding;Caprifoliaceae;ITS2;psbA-trnH;matK;rbcL
doi:10.4268 /cjcmm20101906
[责任编辑 吕冬梅 ]
《中国中药杂志 》征订启事
《中国中药杂志》创刊于 1955年 7月 ,是由中国科学技术协会主管 ,中国药学会主办 ,中国中医科学院
中药研究所承办的综合性中药学术期刊 ,全面反映我国中药与天然药物学科领域最新进展与研究动态 ,是中
医药最高科研学术水平的交流平台之一。主要报道该领域新成果 、新技术 、新方法与新思路 ,内容包括栽培 、
资源与鉴定 、炮制 、药剂 、化学 、药理 、不良反应 、临床等。设有专论 、综述 、研究论文 、研究报告 、临床 、学术探
讨 、药事管理 、经验交流 、信息等栏目 。主要读者对象为各级管理部门 、研究院所 、大专院校 、工厂企业以及医
院等从事中医药科研 、管理 、生产 、医院制剂及临床等方面的人员 。本刊现为半月刊 , 144页 ,每期定价 30
元 ,全年定价 720元。国内刊号 11-2272 /R,国际刊号 1101-5302。
《中国中药杂志》在国际国内医药学领域内具有广泛影响 。被美国 Medline数据库 、《化学文摘》(CA)、
《国际药学文摘》(IPA)、《毒物学文摘 》(ToxFile)、俄罗斯 《文摘杂志 》(AJ)、波兰《哥白尼索引 》(IC)、WHO
西太平洋地区医学索引(WPRIM)等权威性专业文摘收录;国内为 “中国科学引文数据库 ”、“中国学术期刊
综合评价数据库”来源期刊 ,中国自然科学核心期刊 ,中国中文核心期刊 ,中国科技核心期刊 ,并被 《中国学
术期刊文摘 》中 、英文版收录。曾荣获第三届国家期刊奖百种重点期刊 、历届国家中医药管理局全国优秀中
医药期刊评比一等奖 ,并获得中国科学技术协会精品科技期刊工程项目 B类资助。
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第 35卷第 19期
2010年 10月
Vol.35, Issue 19
October, 2010