全 文 ：广 西 植 物 Guihaia Jun．2015，35(3)：442—446 http：／／journa1．gxzw．gxib．cn
DOI：10．11931／guihaia．gxzw201404034
刘瑞娟，蔡振嫒，车国冬．测定植物胞内游离钠离子的研究进展 ]．广西植物，2015，35(3)：442—446
I iu R1，Cai ZY，Che GD．Progress of the study on determination of free sodium in plant cels[J]．Guihaia，2015，35(3)：442-446
测定植物胞 内游离钠离子的研究进展
刘瑞娟 ，蔡振媛 ，车国冬
(1．中国科学院高原生物适应与进化重点实验室，西宁 810001；2．中国科学院西北高原生物研究所，西宁 810001)
摘 要：植物耐盐机制的研究一直是植物抗性研究的焦点。近年来 ，随着生物学不断发展和新荧光标记技术
的运用，胞内钠离子测定逐渐应用于植物盐胁迫研究中。该文论述了以下三方面问题 ：(1)分别介绍了 SBFI、
Sodium Green和 CoroNa Green三种钠离子荧光指示剂：SBFI是一种双激发波长指示剂，其激发波长是 340
nm／380 nm，发射波长是 500 nm；Sodium Green和 CoroNa Green是单波长指示剂 ，其激发波长分别是 507 nm
和 492 nm，发射波长分别是 532 nm和 516 nm；(2)比较了酯导入 、酸导入、电穿孔和显微注射等几种常见荧
光指示剂载入胞内方法的优缺点，重点介绍了一种无损伤低温抑制酯酶法 ：先将荧光指示剂在缓冲液中低温
(4℃)处理 2 h，随后 回到常温(2O℃)在不含荧光指示剂的缓冲液中孵育 2 h；(3)阐述了胞 内离子浓度计算公
式 ，包括单波长测定公式 、双波长比率测定公式 。
关键词 ：细胞 内游离 Na ；植物 ；荧光指示剂；低温酯导入；离子浓度计算
中图分类号：Q942；Q2 33 文献标识码 ：A 文章编号：1000 3142(2015)03—0442 05
Progress of the study on determination of
sodium in plant cellst ree Ol
LIU Rui-Juan ，CAI Zhen-Yuan 。CHE Guo-Dong。
(1．Key Laboratory of Adaptation and Evolution of Plateau Biota，Northwest Institute of Plateau Biology，
Chinese Academy o厂Sciences，Xining 810001，China；2．Northwest Institute oy Plateau Biology，
Chinese Aeademy oy 5(iences，Xining 810001，China)
Abstract：The mechanism of salt tolerance in plants had been the focus of plant resistance research in the past
years．As the development of biology and application of new fluorescent labeling technologies，determination of intra—
cellular free sodium had been gradualy applied to the study of salt tolerance in plants．This review discussed three
points as follows：(1)Introduction of three fluorescent indicators of intracellular free sodium ：SBFI，Sodium Green
and CoroNa Green．SBF1 was a kind of fluorescent indicator for excitation ratio measurements，its emission ratio de—
teeted at 500 nm when excited at 340／380 nm．Sodium Green and CoroNa Green were fluorescent indicators that
lacked a significant shift in emission or excitation wavelength upon binding to Na。．Sodium Green and CoroNa Green
could be detected at 532 nm and 516 nm when excited at 507 nm and 492 nm respectively；(2)Compared the advan—
tages and disadvantages of the protocols of loading the fluorescent indicators into cells，including AM esters of the flu—
orescent probes，acid loading，electroporation and microinjection．A non-invasive loading of acetoxymethyl ester under
low temperature was introduced：loading the fluorescent indicator into cels by incubating the cells in solution at 4。C
for 2 h followed by 2 h incubation in the dye-free solution at 20℃ ；(3)The measurement of the internal sodium con～
centration in cells was illustrated．The equation for measurement of fluorescence intensity that lacked a significant
shift in emission or excitation wavelength was：[N＆ ]一K (F-F⋯)／(F⋯ -F)．Fluorescence intensity(F)was
收 稿 日期
基 金项 目
作者简介
通讯作者
2014-05—26 修回日期：2014-07—20
中国科学院(仪器设备功能开发)技术创新项 目(2014年)
刘瑞娟(1981一)，女，甘肃成县人，硕士，工程师，从事植物分子生物学与细胞生物学新技术应用研究 ，(E-mail)Rjliu@nwipb．cas．cn
车国冬 ，硕士，工程师，研究方向为天然药物化学，fE～mail)gdche@nwipb．cas．cn
3期 刘瑞娟等 ：测定植物胞 内游离钠离子的研究进展 443
targeted fluorescence intensity．F⋯ was appropriate mixtures of low Na ，and F⋯ was appropriate maximum of high
Na ．The equation for measurement of fluorescence intensity ratio was：[[N ]一 K Q(R— R⋯)／(R⋯ 一
R)．The ratio of fluorescence intensity(R)was the ration F1／F2 of the fluorescence intensity．F⋯ was the ratio of
appropriate mixtures of low Na ，and F⋯ was the ratio of appropriate maximum of high Na ．
Key words：intracellular free sodium；plants；fluorescent indicators；ester loading under low temperature；calculating
the ion concentration
钠是植物体 内必需的一种微量元 素，被植 物吸
收后，运输过程及到达所需部位后，其化学形态会发
生不同程度 的变化 ，并通 过这些变化来实现不同的
功能(罗红艺等，2002)。胞 内钠除大部分与生物配
体结合以配合物的形式存在外，还有小部分是以自
由离子形式存在的。本文就着眼于这一小部分游离
钠离子测定的相关研究 。
在动物胞内游离钠离子功能上 ，电压依赖性钠
离子通道对可兴奋细胞完成正常的生理活动起到非
常重要 的作用 ，如可兴奋细胞 电信号的产生和传导 。
随着研究的深入 ，电压依赖性钠离子通道在非兴奋
细胞中存在 的证据也不断增加 ，如神经胶原细胞和
纤维原细胞等(Black et a1．，1996)。植物 中细胞 内
游离钠离子研究主要集中在盐胁迫机制研究上。与
动物细胞相反，大多数植物细胞中高浓度钠离子会
抑制植物正常的生理活动和生长发育。钠离子的毒
性是盐胁迫的一个重要方面，在器官和组织水平研
究较多，但 由于直接测定活细胞中游离离子较难 ，在
细胞水平研究较少 。本文从现有钠离子荧光指示剂
种类、荧光指示剂导入胞内方法和胞内离子浓度计
算三个方面进行简要综述。
1 Na+荧光指示剂
荧光测定法是采用荧光指示剂与胞 内离子特异
结合，结合后荧光指示剂的光学性质发生变化，在一
定波长的激发光下能够发 出特定波长的荧光，荧光
的强弱与溶液中的离子浓度成一定的相关性，因此
通过测量其荧光强度就能够实现对胞内离子浓度的
测量 。常见的钠离子荧光指示剂有 以下几种 ：
1．1 SBFI
最早 出现的 Na 荧光指示剂是 SBFI，是一类 以
冠醚为 分 子 骨 架 的钠 离 子 的荧 光 指 示 剂。尽 管
SBFI对 目标离子钠离子 的选择效率低于钙离子指
示剂 (如 fura一2)对钙离子的结合率 ，但是对 于一般
生理条 件 下胞 内的钠 离 子测 定 已足够 (Minta et
以￡．，1989)。SBFI结合离子 的光谱反应 能进行 比率
测定 ，并与广泛使用的钙离子胞内测定指示剂 fura一
2的光学滤 片一样 ，因此能测 fura一2的仪器就能测
定 SBFI(Negulescu et a1．，1990)，使 SBFI的应用具
有较广范围。
在动物上，SBFI主要被用来测定不同组织胞内
的钠离子水平或钠离子流 向。植物 中，Halperin et
al。(2003)应用 SBFI来测定拟南芥根毛胞内的钠离
子浓度 ，分别得到了 0、30、60和 90 mmol·L。不同
浓度 NaC1溶液处理下拟南芥根毛胞内钠离子的浓
度值，展示了 SBFI在植物活体细胞胞质内钠离子
动力学活性测定上 的应用价值。此外，也有报道应
用 SBFI测定水稻胞质中钠离子浓度。通过测定耐
盐型与盐敏感 型水稻株系中各 自胞质内钠离子的浓
度 ，来分析钠离子在细胞水平的摄人和隔离机制 ，以
进一 步说 明植 物 耐盐 胁迫 的机 理 (Kader et a1．，
2005)。
1．2 Sodium Green
2005年前后 ，又 出现 了一种 Na 荧光指示剂一
Sodium Green，与 SBFI相 比，Sodium Green具有以
下优点：(1)Sodium Green的激发波长是 488 nm，
可以在激 光 共 聚焦 显微 镜 和 流式 细 胞仪 上 使 用
(Bkaily et a1．，I999)；(2)较长的吸收波长降低 了对
细胞的毒害；(3)具有更短的载人时间和更强的荧光
强度。但其缺点是作为单 波长荧光指示剂 ，检测得
到的离子浓度没有双波长指示剂检测所得结果精确
(Amorino et Z．，1995)。
Duan et n ．(2007)利用 Sodium Green荧光指
示剂对液泡中Na 的积累进行检测，发现盐胁迫导
致株系细胞 中荧光强度 明显升高，意味着 Na 的积
累量增加 。说 明转入 的 TsVP 基 因确 实提高 了液
泡膜逆浓度梯度转运离子 的能力 。此外 ，在荧光寿
命测量方面也有应用 ，比如利用 Sodium Green监测
HeLa细胞 中的 Na。离子浓度(Despa et a1．，2000)，
但在植物研究上目前还未见此类报道。
1．3 CoroNa Green
CoroNa Green是一种改 良的绿色荧光 Na 指
示剂 ，由荧光素分子串联具有选择性能与 Na 结合
444 广 西 植 物 35卷
表 1 测定胞内钠离子常见荧光指示剂
Table 1 Commonly used fluorescent indicator of determination intracelular sodium
的冠醚组成 ，与 Na。结合后荧光强度高 ，而波长偏
移小(Martin et＆Z．，2005)。CoroNa Green分子量
比 Sodium Green分子量小一半 以上 (分子量分别
是 586和 1 668)，较小体积使它更容易渗透进入细
胞 ，在相同条件下 ，2O 细胞能被 CoroNa Green渗
透而 Sodium Green进入 的细胞不足 3 (Meier et
“Z．，2006)。CoroNa Green激发波长是 492 nm，位
于激光共聚焦显微镜 的氩激光器激发波段 ，因此非
常适用于激光共聚焦显微镜 。此外 ，在流式细胞仪
(毕莹等，2012)、多功能酶标仪(袁建辉等 ，2011)和
荧光显微镜等仪器上也能检测 CoroNa Green。
Kavitha et 0Z．(2012)应用 CoroNa Green测定
不同耐盐水稻品种根胞质 中钠离子浓度 ，发现盐敏
感水 稻 IR20比耐盐 水稻 Pokkali根 原 生 质体 中
Na 积累多，进一步的研究表明不同耐盐水稻 品种
在其根细胞 中含有类似 的 阳离子通道 。Zhang et
。Z．(2012)在研究脂肪酸去饱和酶 FAD2与植物盐
胁迫抗性 中，利用 CoroNa Green指示剂测定胞 内
Na。，得 到缺失突变体 fad2根细胞胞 质中积 累较
多 Na 的结果 ，综合其它实验说 明在种子萌发和早
期生长过程中，拟南芥脂肪酸去饱和酶 FAD2在耐
盐胁迫 中发 挥 了必 不可少 的作 用。此 外，王晓玲
(2009)报道利用 CoroNa Green研究 Na ／K。一AT—
Pase抑制剂对 中华补血草 的生长情况及其根尖 中
Na。的 含 量 和 分 布 的 影 响。也 有 利 用 CoroNa
Green检验 质膜 H一一ATPase，NKCC和 Na。／H。
antiporter的活性受到抑制时，是否会导致二色补血
草中 Na。的分泌受到抑制从而更 多地 积累在盐腺
细胞 中的研究 (丁烽，2O10)。
2 荧光指示剂导入胞 内方法
与动物细胞相比，植物细胞具有坚韧的细胞壁、
较大的液泡和存在细胞膨压等特点 ，使得指示剂导
入细胞相对困难，报道过有 以下几种成功导入细胞
的方法 ：酯导入 、酸导入 、电穿孔和显微注射等 。
酸导入是在弱酸性条件下 ，指示剂处于不带电
荷的非解离状态 ，有可能透过细胞膜 ；但对于多数植
物细胞酸导人效果不好。电穿孔其原理是在微一毫
秒的瞬间施以每厘米数千伏强度 的电脉冲 ，引起细
胞膜 自修复性穿孔，从而使指示剂进入细胞；但这种
方法是一种具有 损伤性 的导入方法 ，局 限性较 大。
显微注射适用于一个或几个细胞的注射及单细胞测
量 ，它能将几乎所有的指示剂迅速导入胞内；但对于
仪器设备和仪器操作技能都有较高的要求 ，不适用
于一般实验室进行植物胞 内离子测定实验(孙天恩
等，1996)。
与上述几种方法相 比，酯导入法具有适用范 围
广、导入效率高和应用 门槛较低的优点，在 当前植物
胞内离子测定上被普遍采用。在酯导入法 中荧光指
示剂一般以酯化的形式 (AM 脂 ，乙酰基甲甲酯)导
人胞内，其原理主要是脂化形式容易透过质膜进入
细胞内，虽然其 自身不 发荧 光，且 不与胞 内离子结
合，但进人细胞后可以被胞质中的酯酶分解成游离
酸形式 ，从而恢复对胞 内离子的选择性 ，与胞内离子
结合后而发荧光。但应用于植物细胞却存在 困难 ，
植物细胞细胞壁中存在着脂酶 ，酯化形式指示剂在
进入细胞前就会被水解(Brownlee et“Z．，l988)。
鉴于此 ，初期一般 以植物各组织的原生质体作
为荧光指示剂载人对象。从较早报道将钙离子指示
剂 Indo一1和 fura一2成功导人大麦糊粉层原 生质体
(Bush et n Z．，1987)开始 ，在绿豆下胚轴 、胡 萝 卜根
韧皮部 、蚕豆叶肉、小 白菜下胚轴 、水稻花药愈伤组
织 、水稻叶片、水稻根毛 、鸢尾花粉 、烟草叶片和小麦
叶片(周 平等，1995；Halperin et a1．，2003；Duan et
3期 刘瑞娟等 ：测定植物胞内游离钠离子的研究进展 445
a J．，2007；党磊等 ，2002)等细胞原生质体 中均实现
了不同荧光指示剂的导人。但是使用原生质体作为
受体材料也存在一些问题 ，如在实验过程 中原生质
体容易破裂，给测定过程带来不稳定因素。原生质
体是一植物细胞非正常状态 ，失去细胞原有 的形态
特征后 ，无法准确判断离子分布的原始和确切位置。
随着科学技术的发展 ，出现 了一种采用低温抑
制酯酶方法成功使脂化形式荧光指示剂进入小麦根
尖细胞的方法 。此方法 的原理是在低温条件下细胞
壁中的酯酶活性受到抑制，无法水解酯化型探针，但
荧光指示剂扩散进入细胞内的过程受低温影响并不
大。先以低温 (4 oC)处理 2 h，待植物细胞 内积累一
定量的荧光指示剂，再 回到常温 (20 oC)孵育 2 h，使
细胞 内脂酶活性回升，从而将 进入胞 内的荧光指示
剂水解成离子形式而与钙离子结合，在一定波长激
发下检测荧光从而获得胞 内离子浓度值 (Zhang et
az．，1998)。利用此方法研究报道的有在百合花药、
蚕豆叶片、蚕豆茎维管束薄壁组织、砂梨花药、拟南
芥叶片、甜菜叶片等 中成功导入了钙离子荧光指示
剂 (尚忠林 等 ，2001；徐 国华等 ，2003；孙 清 鹏 等，
2004；余晓丛等，2013)，但钠离子荧光指示剂应用此
方法的报道较少 ，可能 由于不 同植物 的不 同荧光指
示剂载人效率差别较大，具体做某种植物材料时 ，希
望通过优化处理条件来使低温导入法在钠离子荧光
指示剂上得到推广。
3 胞内离子浓度计算
荧光测定法是通过测定荧光强度来反映细胞 中
离子浓度 的，而连接荧光信号和离子浓度 的关键转
换参数就是离子荧光指示剂的离解平衡常数 (Kd)，
它的单位为纳摩尔(nmo1)。Kd受很多环境因素的
影响，包括温度，pH值，离子强度以及指示剂和蛋
白质的相互作用等。
3．1单波长测定
荧光方法测定 中，荧光指示剂在 与反应物结合
后 ，仅有荧光强度的变化 ，而最大荧光激发和发射波
长均无变化。像这种利用单一波长下荧光强度的变
化进行 的测定就是单波长测定。
单波长测定胞内钠离子浓度计算公式如下：
— F
[Na ]：K }
』 ’max 』 ’
式中，F为实验所测得的荧光强度，F⋯和 F
分别为胞内无 Na 和 Na 饱和时所测得 的荧光强
度。F⋯和 F⋯ 的获得是胞内钠离子计算的难点，
首先必须找到能使胞内钠离子螯合掉和达到饱和的
试剂。目前 ，报道获得 F 的试剂有羰基氰化物间
氯苯腙(CCCP)和 Na。。阻断剂 TTX，获得 F⋯ 的试
剂 有 短 杆 菌 肽 (gramicidin)和 Na 激 动 剂
Veratrdine(Lo et a1．，2006；毕莹等 ，2012)。
单波长测量时，由于待测细胞厚度、试剂的绝对
浓度、光程长或仪器的绝对灵敏度等测量条件的微
小变化都会引起测量值的误差，使单波长指示剂没
有双波长指示剂测量结果精确 。 目前，单波长指示
剂主要应用于离子 的动态变化 ，离 子分布特点的测
定 ，而在离子定量方面 的应用则受 到了一定 的限制
(郭神等，2003)。上述的 Sodium Green和 CoroNa
Green就是单波长钠离子荧光指示剂 ，只能进行单
波长测定。
3．2双波长 比率测定
荧光方法测定中 ，荧光指示剂在与反应物结合
后 ，出现激发或发射光谱移位的探针 ，可使用在两个
不 同波长测定的荧光强度 比率进行测定，称为双波
长 比率测量 。
比率法测定胞内钠离子浓度计算公式如下：
R～R～ [N
a一]一K Q ——
』 ㈣ 一 』
式 中，R 为实验中在两个不同波长位置所测得
的荧光强度 比，R⋯和 R 分别为无 Na 和 Na。饱
和时所测得的荧光强度 比，Q 为选取 R 定义中处于
分母的波长时无 Na 和 Na 饱和时所测得 的荧光
强度比。
由于双波长 比率法是利用两波长处荧光强度之
比而不是绝对荧光强度来 进行胞 内离子 浓度的计
算 ，故能有效减少待测细胞厚度 、试剂 的绝对浓度、
光程长或仪器 的绝对灵 敏度等测量条件 造成的误
差。有应用钠离子双激发波长指示剂 SBFI测定不
同水稻品种在不同盐处理下各 自胞 内钠离子浓度的
报道(Kader et a1．，2005)。
4 问题 与展望
胞内离子测定中钙离子测定技术最为成熟 ，钙
离子指示剂 种类多，适用于不 同浓度范 围、pH 值 、
灵敏度和仪器的情况(王永祥等，2006)。与此相比，
胞内钠离子指示剂种类较少，选择余地不大，具体要
446 广 西 植 物 35卷
测定某种胞内钠离子浓度时，不一定能找到合适的
钠离子荧光指示剂 。此外 ，胞 内测定对仪器要求较
高，要依赖于激光共聚焦显微镜或流式细胞仪等大
型仪器 ，应用受限。
随着研究 的深入 ，植物胞 内钠离子在植物抗性
以及钠离子通道研究中扮演着越来越重要的角色，
胞内钠离子定位 、定性与定量测定 的需求会越来越
多 ，期望合成出一批适应性广的钠离子荧光指示剂。
另一方面 ，随着有机化学、无机化学和材料学等学科
的发展，出现了许 多新标记技术 ，为新型钠离子荧光
指示剂合成提供了可能性。如一种新型的荧光探针
量子点 ，与传统有机探针相 比，具有多 目标检测 、发
光寿命长、光化学稳定性高和毒性低等优点(陈介南
等，2010)。新型钠离子荧光指示剂的出现必将推动
植物胞内钠离子研究的进展 。
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