全 文 ：　 Ｇｕｉｈａｉａ　 Ａｕｇ. ２０１６ꎬ ３６(８):９８６－９９２
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ＤＯＩ: １０.１１９３１ / ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１４１１００４
韩树鑫ꎬ 白艳菊ꎬ 张威ꎬ 等. 蚜虫中携带马铃薯卷叶病毒检测方法的改进 [Ｊ]. 广西植物ꎬ ２０１６ꎬ ３６(８):９８６－９９２
ＨＡＮ ＳＸꎬ ＢＡＩ ＹＪꎬ ＺＨＡＮＧ Ｗꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆｒｏｌｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ａｐｈｉｄｓ [Ｊ]. Ｇｕｉｈａｉａꎬ ２０１６ꎬ ３６(８):９８６－９９２
蚜虫中携带马铃薯卷叶病毒检测方法的改进
韩树鑫２ꎬ 白艳菊１ꎬ２∗ꎬ 张　 威１ꎬ２ꎬ 高艳玲１ꎬ２ꎬ 范国权１ꎬ２ꎬ 张　 抒１ꎬ 申　 宇１
( １. 黑龙江省农业科学院ꎬ 哈尔滨 １５００８６ꎻ ２. 东北农业大学ꎬ 哈尔滨 １５００３０ )
摘　 要: 马铃薯卷叶病毒(Ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆｒｏｌｌ ｖｉｒｕｓꎬＰＬＲＶ)对马铃薯生产的危害极大ꎬ是一种极为重要的马铃薯病
毒病ꎮ ＲＴ－ＰＣＲ是马铃薯卷叶病毒检测较为常用的方法ꎬ该方法检测准确率高、成本低、适用范围广ꎮ 但在实
际生产中其检测对象多为染病植株ꎬ对 ＰＬＲＶ 传播的主要介体桃蚜(Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ)的检测ꎬ则由于蚜虫体积
小、ＲＮＡ提取难度大、成本高、且不能复检ꎬ因而在生产中不能被广泛使用ꎮ 该研究以马铃薯感病植株和带毒
蚜虫为材料ꎬ利用改进的 ＲＮＡ 提取方法从它们中提取到 ＰＬＲＶ 的 ＲＮＡꎬ并以 ＣＰ 基因设计特异性引物ꎬ进行
ＰＣＲ检测ꎮ 结果表明:该方法提取的 ＲＮＡ完整性好ꎬ可用于蚜虫中 ＰＬＲＶ 检测ꎬ且同样适用于对马铃薯感病
植株的检测ꎮ 另外ꎬ通过对田间有翅蚜和无翅蚜携带 ＰＬＲＶ 情况进行检测发现ꎬ无翅蚜 ＰＬＲＶ 检出率为
１００％ꎬ有翅蚜 ＰＬＲＶ检出率也高达 ６０％ꎬ证明该体系在生产中的实用性ꎮ 该研究使用改进的 ＲＮＡ 提取方法ꎬ
提取蚜虫中 ＲＮＡꎬ并利用 ＲＴ－ＰＣＲ进行了 ＰＬＲＶ检测ꎬ与以前的方法相比简单实用ꎬ可被应用于生产检测中ꎮ
该研究结果为马铃薯生产中 ＰＬＲＶ的防控提供了一种新的手段ꎮ
关键词: 马铃薯卷叶病毒ꎬ 蚜虫ꎬ ＣＰ 基因ꎬ 检测
中图分类号: Ｑ９４５.８　 　 文献标识码: Ａ　 　 文章编号: １０００￣３１４２(２０１６)０８￣０９８６￣０７
Ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆｒｏｌｌ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ａｐｈｉｄｓ
ＨＡＮ Ｓｈｕ￣Ｘｉｎ２ꎬ ＢＡＩ Ｙａｎ￣Ｊｕ１ꎬ２∗ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｗｅｉ１ꎬ２ꎬ ＧＡＯ Ｙａｎ￣Ｌｉｎｇ１ꎬ２ꎬ
ＦＡＮ Ｇｕｏ￣Ｑｕａｎ１ꎬ２ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｓｈｕ１ꎬ ＳＨＥＮ Ｙｕ１
( １. Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｈａｒｂｉｎ １５００８６ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２. Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｈａｒｂｉｎ １５００３０ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｔａｔｏ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎꎬ Ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆｒｏｌｌ ｖｉｒｕｓ (ＰＬＲＶ) ｃａｎ ｂｅ ｃａｕｓｅｄ ｅｎｏｒｍｏｕｓ ｈａｒｍꎬｓｏ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＰＬＲＶ ｉｓ ａ
ｖｅｒｙ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ ｐｏｔａｔｏ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ. ＲＴ￣ＰＣＲ ｉｓ ａ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｕｓｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＰＬＲＶꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅ￣
ｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｈｉｇｈ ａｃｃｕｒａｃｙꎬ ｌｏｗ ｃｏｓｔ ａｎｄ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＰＬＲＶ ｉｎ ｐｏｔａｔｏ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ. Ｂｕｔ ｉｎ ｔｈｅ ａｃ￣
ｔｕａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎꎬ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆｔｅｎ ａｒｅ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｌａｎｔｓꎬ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ ｔｈａｔ ｉｓ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｍｅｄｉａｔｏｒ
ｏｆ ＰＬＲＶ ｉｓ ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄꎬ ｂｅｃａｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ａｐｈｉｄ’ｓ ｓｍａｌｌ ｖｏｌｕｍｅꎬ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｉｇｈ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔｙꎬ ｈｉｇｈ ｃｏｓｔꎬ ａｎｄ ｔｈａｔ
ｃａｎ ｎｏｔ ｂｅ ｒｅｃｈｅｃｋｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ. Ｆｏｒ ｔｈｅｓｅ ｒｅａｓｏｎｓꎬ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＲＴ￣ＰＣＲ ｃａｎ ｎｏｔ ｏｆｔｅｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｔａｔｏ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒꎬ ｗｅ ｕｓｅｄ ｐｏｔａｔｏ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ｖｉｒｕｌｉｆｅｒｏｕｓ ａｐｈｉｄｓ ａｓ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓꎬ ａｎｄ ｕｓｅｄ
ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｗｈｉｃｈ ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ＰＬＲＶ ＲＮＡ. Ｔｈｅｎꎬ ｗｅ ｍａｄｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ
ＰＣＲꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｔｈａｔ ｒｅｆｅｒ ｏｆ ＣＰ ｇｅｎｅ. Ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＲＮＡ ｅｘ￣
ｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｔａｔｏ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ｖｉｒｕｌｉｆｅｒｏｕｓ ａｐｈｉｄｓ ｗａｓ ｉｎｔｅｇｒａｌ ｔｈａｔ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ＰＬＲＶ ｉｎ ａｐｈｉｄｓꎬ
ａｎｄ ｉｔ ａｌｓｏ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ＰＬＲＶ ｉｎ ｐｏｔａｔｏ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ ｐｌａｎｔｓ. Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎꎬ ｗｅ ｕｓｅｄ ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ
收稿日期: ２０１４￣１１￣０３　 　 修回日期: ２０１５￣０３￣２８
基金项目: 国家农业部现代农业产业技术体系专项 (ＣＡＲＳ￣１０￣Ｐ１４) [Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｆｕｎｄ ｆｏｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｉｎｄｕｓ￣
ｔｒｙ ｆｒｏｍ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ (ＣＡＲＳ￣１０￣Ｐ１４)]ꎮ
作者简介: 韩树鑫(１９８４￣)ꎬ男ꎬ博士研究生ꎬ研究方向为植物分子病理学ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｐｌｕｔｏ７８９＠ １６３.ｃｏｍꎮ
∗通讯作者: 白艳菊ꎬ硕士ꎬ研究员ꎬ研究方向为植物分子病理学ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｙａｎｊｕｂａｉ＠ １６３.ｃｏｍꎮ
ｆｉｅｌｄ ｏｆ ａｐｈｉｄｓ ａｎｄ ｗｉｎｇｌｅｓｓ ａｐｈｉｄｓ ｃａｒｒｙｉｎｇ ＰＬＲＶ. Ｗｉｎｇｌｅｓｓ ａｐｈｉｄｓ ＰＬＲＶ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｗａｓ １００％ꎬ ｔｈｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｏｆ
ＰＬＲＶ ｏｆ ａｐｈｉｄｓ ｗａｓ ａｓ ｈｉｇｈ ａｓ ６０％ꎬ ｗｈｉｃｈ ｐｒｏｖｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ａ ｇｏｏｄ ｐｒａｇｍａｔｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒａｃｔｉｃａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｙｓｔｅｍ
ｉｎ ｐｏｔａｔｏ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ｗｅ ｕｓｅｄ ｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｅｆｆｉｃａｃｉｏｕｓ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ＲＮＡꎬ ａｎｄ ｕｓｅｄ ＲＴ￣ＰＣＲ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ
ｔｈｅ ＰＬＲＶ ｉｎ ａｐｈｉｄｓ. Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔｈｏｄꎬ ｔｈｅ ｎｅｗ ｍｅｔｈｏｄ ｉｓ ｓｉｍｐｌｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃａｌꎬ ｉｔ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｉｎ
ｐｏｔａｔｏ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｅｓｔꎬ ａｎｄ ｉｔ ｉｓ ａ ｎｅｗ ｍｅａｎｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｈｅ ＰＬＲＶ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｔａｔｏ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆｒｏｌｌ ｖｉｒｕｓꎬ ａｐｈｉｄꎬ ＣＰ ｇｅｎｅꎬ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
　 　 在世界各地的马铃薯生产中ꎬ马铃薯卷叶病毒
(Ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆｒｏｌｌ ｖｉｒｕｓꎬＰＬＲＶ)是马铃薯生产中危害最
为严重的病毒之一ꎬ可以造成马铃薯的产量及品质
严重下降ꎮ ＰＬＲＶ 是单分子正义 ｓｓＲＮＡ 病毒ꎬ属黄
症病毒科(Ｌｕｔｅｏｖｉｒｉｄａｅ)马铃薯卷叶病毒属(Ｐｏｌｅｒｏ￣
ｖｉｒｕｓ)的成员ꎬ基因组长约 ５.９ ｋｂꎬ具有 ６ 个读码框
架ꎮ 病毒粒子为等轴对称二十面体ꎬ无包膜ꎬ直径为
２５ ~ ３０ ｎｍ ( Ｖａｎ Ｒｅｇｅｎｍｏｒｔｅ ｅｔ ａｌꎬ ２０００ꎻ张鹤龄ꎬ
１９９６ꎻ)ꎮ 桃 蚜 ( Ｍｙｚｕｓ ｐｅｒｓｉｃａｅ ) 属 于 半 翅 目
(Ｈｅｍｉｐｔｅ)蚜科(Ａｐｈｉｄｉｄａｅ)ꎬ其寄主植物在 ２８０ 种以
上ꎬ是多种植物病毒的主要传播媒介ꎮ ＰＬＲＶ 主要
靠蚜虫中的桃蚜以持久、循环增殖型方式传播ꎬ另外
还能通过嫁接传播ꎬ但不能经汁液机械接种传毒ꎬ在
寄主植株体内的分布主要局限于维管束内ꎮ 受其侵
染的植株的症状主要为叶片边缘以主脉为中心向上
卷曲ꎬ病重时呈圆筒状ꎬ叶质厚而脆ꎬ呈皮革状ꎬ植株
矮小ꎬ枝叶僵化ꎬ并因韧皮部被破坏ꎬ在茎横切面可
见黑点ꎬ茎基部和节部更为明显ꎬ有的品种块茎组织
表现为导管区网状坏死斑纹ꎬ严重影响马铃薯的品
质和产量(ＫＯＪꎬ１９６９)ꎮ
在目前的马铃薯生产中ꎬ为防止马铃薯卷叶病
毒对其生产造成危害ꎬ常用的检测预防措施的检测
对象为植物组织ꎬ即首先ꎬ通过植株症状初步判断是
否感染了 ＰＬＲＶꎬ如疑似感染则通过 ＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ
(Ｄｏｕｂｌｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓａｎｄｗｉｃｈ Ｅｎｚｙｍｅ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕ￣
ｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ＡｓｓａｙꎬＤＡＳ￣ＥＬＩＳＡ)或 ＲＴ￣ＰＣＲ 方法进行
检测ꎬ确定田间植株中是否含有 ＰＬＲＶ(李楠楠等ꎬ
２０１１ꎻ张华鹏等ꎬ２０１１)ꎬ但当确定植株中含有马铃
薯卷叶病毒时ꎬ事实上田间马铃薯植株已经发生ꎬ受
ＰＬＲＶ感染的植株数量以远大于可控制的程度ꎮ 而
针对传毒介体蚜虫中病毒的检测方法虽已有报道ꎬ
并且也还有一些研究者在继续研究ꎮ 由于单头蚜虫
体积极小ꎬ目前ꎬ研究者们遇到最大的问题就是蚜虫
中总 ＲＮＡ提取ꎬ因为ꎬ只有提取出完整的、质量合格
的 ＲＮＡꎬ才能进行检测ꎬ同时ꎬ合适的提取方法提取
的 ＲＮＡ可以被保存于适当的条件下ꎬ以便日后复检
或进行其它的实验研究ꎮ 而目前以报道的对单头蚜
虫中 ＲＮＡ的提取并鉴定的方法则主要是根据 Ｓｉｎｇｈ
ｅｔ ａｌ (１９９６)ꎻ Ｓｉｎｇｈ(１９９９)使用微量离型机和微量
离心管ꎬ在微量离心管中利用降解液将蚜虫组织直
接降解ꎬ并使用保护液保护降解液中的 ＲＮＡꎬ从而
直接进行逆转录及 ＰＣＲ 检测的方法ꎮ 这类检测方
法的优点是检测时ꎬ操作方便ꎬ不需专门提取 ＲＮＡꎬ
但同样存在一些缺点:首先ꎬ降解液及保护液配置复
杂ꎬ不能利用简单的试剂直接完成ꎻ第二ꎬ使用降解
液进行 ＲＴ￣ＰＣＲꎬ由于蚜虫体内的其它组织及 ＲＮＡ
的干扰ꎬ此检测方法极易出现漏检或者错检ꎻ第三ꎬ
蚜虫组织的降解液并不能长期保存ꎬ如检测出现问
题ꎬ无法进行复检ꎬ也无法进行其它的相关实验ꎮ 虽
然ꎬＮｉｅ ＆ Ｓｉｎｇｈ (２００１)通过加入 Ｄｎａｓｅ Ｉ 的方式改
进 Ｓｉｎｇｈ的方法ꎬ并对蚜虫中的病毒进行了多重 ＲＴ￣
ＰＣＲ检测ꎬ但这种方法依然存在以上的问题ꎮ 另
外ꎬ近年来还有许多针对蚜虫携带病原检测的研究ꎬ
如刘永清等利用 ( ２０１０) 利用反转录 ＰＣＲ ( ＲＴ￣
ＰＣＲ)、反转录巢式 ＰＣＲ(ＲＴ￣ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ)以及实时
ＲＴ￣ＰＣＲ(Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＲＴ￣ＰＣＲ)对蚜虫中的柑桔衰退
病毒(Ｃｉｔｒｕｓ ｔｒｉｓｔｅｚａ ｖｉｒｕｓꎬＣＴＶ)进行了定性及定量分
析ꎬ但使用的提取方法ꎬ依然是利用前人对蚜虫中病
毒 ＲＮＡ的提取方法(Ｍｅｔｈａꎬ１９９７)ꎮ
随着我国马铃薯生产规模的不断扩大ꎬ对马铃
薯病毒病的检测和预防逐渐上升为马铃薯生产中极
为重要的一项工作ꎬ所以需要一种既简单又实用的
检测方法对马铃薯病毒病的传毒介体进行检测ꎬ以
便开展相关的防治工作ꎮ 但目前对 ＰＬＲＶ检测还停
留在针对已受感染植株的初级阶段ꎬ而不多的针对
传毒介体的检测方法则有着各种各样的缺点和不实
用性ꎬ不能作为生产中经常使用的检测方法ꎮ 本研
究采用常规的 ＲＴ￣ＰＣＲ 方法对 ＰＬＲＶ 的传播介体￣
桃蚜进行检测ꎬ并针对单头蚜虫的总 ＲＮＡ提取困难
的特点ꎬ利用相关仪器配合改进了提取方法ꎬ使其可
以简便的提取出蚜虫的总 ＲＮＡꎬ并进行检测ꎮ 另
外ꎬ通过使用本方法ꎬ可在马铃薯植株未发现受 ＰＬＲＶ
７８９８期　 　 　 　 　 　 　 　 　 韩树鑫等: 蚜虫中携带马铃薯卷叶病毒检测方法的改进
表 １　 马铃薯卷叶病毒(ＰＬＲＶ)引物
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ Ｐｏｔａｔｏ ｌｅａｆｒｏｌｌ ｖｉｒｕｓ (ＰＬＲＶ)
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ
引物序列(５′￣３′)
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ(５′￣３′)
扩增片段长度
Ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
(ｂｐ)
来源
Ｓｏｕｒｃｅ
ＰＬＲＶ￣ＣＰ￣Ｆ
ＰＬＲＶ￣ＣＰ￣Ｒ
５′￣ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＧＴＡＣＧＧＴＣＧＴＧＧＴＴＡＡＡＧＧ￣３′
５′￣ＣＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＴＴＴＧＧＧＧＴＴＴＴＧＣＡＡＡＧＣＣＡ￣３′
６２７ 本研究
Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＰＬＲＶＬＲ４Ｓ
ＰＬＲＶＬＲ５Ａ
５′ＣＧＣＧＣＴＡＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡＧＣＣ３′
５′ＧＣＡＡＴＧＧＧＧＧＴＣＣＡＡＣＴＣＡＴ３′
３３６ Ｘｉａｎｚｈｏｕ Ｎｉｅ
ＰＬＲＶ２６２７上(Ｕｐｐｅｒ)
ＰＬＲＶ２６２７下(Ｌｏｗｅｒ)
５′ＡＧＧＣＧＣＧＣＴＡＡＣＡＧＡＧＴＴＣＡ３′
５′ＣＴＴＧＡＡＴＧＣＣＧＧＡＣＡＧＴＣＴＧ３′
２２２ ＳＮ / Ｔ２６２７￣２０１０
侵染前ꎬ检测地块周围的蚜虫ꎬ进而提前进行 ＰＬＲＶ
的防控ꎮ
１　 材料与方法
１.１ 材料
携带 ＰＬＲＶ的带毒蚜虫(数只)、染病马铃薯植
株及作为阴性对照的无毒蚜虫均来自于黑龙江省农
业学院植物脱毒苗木研究所ꎮ 待测蚜虫采集于哈尔
滨市民主乡ꎬ在马铃薯卷叶病发病地块采集有翅蚜
１５只ꎬ马铃薯卷叶病发病植株上采集无翅蚜 １５ 只ꎬ
用于验证检测方法的可靠性ꎮ
１.２ 酶与试剂
试验所用的限制性内切酶、反转录酶、ＲＮＡ 酶
抑制剂、Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶、ｄＮＴＰ、植物 ＲＮＡ 提取试
剂(Ｔｒｉｚｏｌ)分别购自宝生物工程(大连)有限公司、
Ｐｒｏｍｅｇａ公司和 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司ꎮ
１.３ 引物设计与合成
本实验依据 ＰＬＲＶ比较保守的 ＣＰ 基因序列设
计、引用引物ꎬ具体详情见表 １ꎮ
１.４ ＰＬＲＶ的检测
１.４.１ 蚜虫及马铃薯的总 ＲＮＡ提取　 本文采用经过
改进的 Ｔｒｉｚｏｌ法提取单个蚜虫 ＲＮＡꎮ 取 １只蚜虫放
入 ２ ｍＬ的离心管中ꎬ迅速放入液氮中将蚜虫冷冻至
死ꎬ打开管盖ꎬ加入 ２ 个直径 ２ ｍｍ 的玻璃珠(玻璃
珠的表面为磨砂面)ꎬ盖上离心管盖ꎬ将离心管放入
液氮中充分冷却ꎬ 趁离心管在液氮中冷却后温度较
低ꎬ使用植物样品研磨机(ＭＭ４００ Ｒｅｔｓｃｈ)利用其高
速震荡使玻璃珠在离心管中对样品进行研磨ꎬ研磨
完成后将离心管重新放入液氮中ꎬ以防止样品温度
升高ꎮ 由于蚜虫体积较小ꎬ研磨粉碎后组织主要集
中在管壁和玻璃珠上ꎬ所以利用已经预冷的冷冻台
式离心机(ＭＩＫＲＯ ２２０Ｒ Ｈｅｔｔｉｃｈ Ｚｅｎｔｒｉｆｕｇｅｎ)对研磨
后的样品进行 １２ ０００ ｇꎬ离心 １０ ｓ(离心时间过长ꎬ
样品易降解)ꎬ离心后向离心管中立即加入 １ ｍＬ
Ｔｒｉｚｏｌ后充分混匀 (加入 Ｔｒｉｚｏｌ 时使用移液器将
Ｔｒｉｚｏｌ沿离心管壁冲洗管壁)ꎬ并将离心管水平放置
滚动数次ꎬ使可能还附着在管壁上的蚜虫组织充分
地与 Ｔｒｉｚｏｌ接触ꎬ水平静置于试验台 １０ ｍｉｎꎬ以使样
品充分降解ꎮ 加入 ２００ μＬ 氯仿ꎬ 剧烈振荡混匀 ３０
ｓꎬ室温(１５~ ２５ ℃)放置 １５ ｍｉｎꎻ然后ꎬ将样品放入
冷冻台式离心机ꎬ１２ ０００ ｇꎬ ４ ℃离心 １５ ｍｉｎꎮ 经离
心后可见样品分为 ３层:底层为黄色有机相ꎬ上层为
无色水相和一个中间层ꎮ 小心吸取上层水相至另一
离心管中加入等体积的异丙醇混匀(由于蚜虫体积
小ꎬ组织含量少ꎬ这时的中间层虽然肉眼很难分辨ꎬ
但还是要尽量的多吸取水相层)在室温(１５~２５ ℃)
下放置 １０ ｍｉｎꎮ 将样品放入冷冻台式离心机中ꎬ
１２ ０００ ｇꎬ ４ ℃离心 １０ ｍｉｎꎻ由于单个蚜虫中 ＲＮＡ含
量极少ꎬ所以移去上清液的过程需极小心ꎬ尽量不要
用移液器吸头接触到管壁ꎬ以防止 ＲＮＡ 丢失ꎻ用的
使用 ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ 水配制 ７５％乙醇洗涤 ２ 次ꎬ 每次
５００ μＬꎬ １２ ０００ ｇꎬ 室温(１５~２５ ℃)离心 ５ ｍｉｎꎻ 彻
底吸去上清液ꎬ 室温干燥 ５ ~ １０ ｍｉｎ 使酒精完全挥
发ꎻ 用 ２５ μＬ ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ水溶解 ＲＮＡ 样品ꎬ 分光光
度法测定 ＲＮＡ 浓度及纯度同时使用电泳法检测
ＲＮＡ完整性ꎮ
植物总 ＲＮＡ 提取ꎬ按 Ｔｒｉｚｏｌ 试剂说明书按步骤
进行ꎮ
１.４. ２ ｃＤＮＡ 第一链的合成 　 以上一步中提取的
ＲＮＡ为模板ꎬ反转录合成 ｃＤＮＡ 第一链ꎮ 反应步
骤: ＰＣＲ 管中加入模板 ＲＮＡ ４ μＬꎬＲａｎｄｏｍ ｐｒｉｍｅｒ
１ μＬꎬ用 ＤＥＰＣ 处理过的无菌水补齐至 １０ μＬꎮ ７０
℃加热 ５ ｍｉｎꎮ 冰上冷却 ２ ｍｉｎ 后向 ＰＣＲ 管中加入
８８９ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
５ × Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬꎬｄＮＴＰ １. ２５ μＬ (１０ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１ )ꎬ
ＲＮａｓｉｎ ０. ５ μＬ (４０ Ｕ􀅰μＬ￣１)ꎬ Ｍ￣ＭＬＶ １ μＬ(２００
Ｕ􀅰μＬ￣１)ꎬ用 ＤＥＰＣ处理过的无菌水补齐至 ２５ μＬꎮ
按下列条件进行反转录反应: ３７ ℃ １ ｈꎬ７０ ℃ １５
ｍｉｎ (酶失活)后ꎬ冰上冷却ꎬ－２０ ℃保存备用ꎮ
１.４.３ ＰＬＲＶ的 ＲＴ￣ＰＣＲ检测及产物的序列测定　 以
上一步合成的 ｃＤＮＡ 第一链为模板ꎬ使用 ＲＴ￣ＰＣＲ
进行扩增检测并测序ꎮ 检测步骤: 在 ＰＣＲ 管中加
入制备的 ｃＤＮＡ ２ μＬꎬｄＮＴＰ ２ μＬ(２.５ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１)ꎬ
ｒＴａｑ ０.２５ μＬ(５ Ｕ􀅰μＬ￣１)ꎬ１０× ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬꎬ上
下游引物 (１０ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１) 各 ０.５ μＬꎬ用 ＤＥＰＣ水定
容到 ２５ μＬ 的反应体系ꎮ ＰＣＲ 扩增条件: ９４ ℃
２ ｍｉｎ预变性后进行 ３５个循环(９４ ℃变性 ２０ ｓꎬ ５５.５
℃退火 ３０ ｓꎬ ７２ ℃延伸 ３０ ｓ)ꎬ ７２ ℃延伸 ５ ｍｉｎꎬ
４ ℃∞ꎮ 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后ꎬ交由
华大基因进行测序ꎮ
２　 结果与分析
２.１ 引物筛选
本研究中ꎬ选取并设计了一共 ３ 对引物ꎬ并且 ３
对引物都成功扩增出特异性条带(图 １、图 ２、图 ３)ꎮ
考虑到检测的实用性和检测结果的易分辨性ꎬ我们
选用引物 ＰＬＲＶ￣ＣＰꎮ
２.２ ＲＮＡ的提取
以单头蚜虫为材料ꎬ使用改进的方法对其的总
ＲＮＡ进行了提取ꎬ提取完成后取 ５ μＬ 进行电泳检
测后发现ꎬ虽然 ＲＮＡ 的电泳后颜色较淡ꎬ说明其浓
度较低ꎬ但 ＲＮＡ 的完整性良好ꎬ由于 ＲＴ￣ＰＣＲ 检测
灵敏性高并对使用 ＲＮＡ要求不高ꎬ所以试验提取的
ＲＮＡ可用于后续试验ꎮ
２.３ 蚜虫携带 ＰＬＲＶ病毒 ＲＴ￣ＰＣＲ检测
以单头带毒蚜虫的总 ＲＮＡ为模板ꎬ并使用带毒
马铃薯植株为阳性对照ꎬ采用 ＰＬＲＶ 特异性引物
ＰＬＲＶ￣ＣＰꎬ经 ＲＴ￣ＰＣＲ检测ꎬ带毒蚜虫和马铃薯病株
扩增得到特异性条带没有差异ꎬ说明该体系适用蚜
虫体内卷叶病毒的检测(图 ４)ꎮ
２.４ ＰＬＲＶ的序列测定及序列同源性比较
应用引物 ＰＬＲＶ￣ＣＰ 对蚜虫携带 ＰＬＲＶ 病毒的
ＲＴ￣ＰＣＲ扩增产物进行测序(图 ５)ꎮ 利用 ＢＬＡＳＴ工
具与 ＧｅｎＢａｎｋ中已公布的 ＰＬＲＶ 分离物 ＣＰ 基因序
列进行比较ꎬ发现核苷酸同源性均在 ９９％以上ꎬ证
明成功扩增得到了 ＰＬＲＶ 的 ＣＰ 基因ꎬ同时也表明
图 １　 引物 ＰＬＲＶ２６２７ 扩增结果　 Ｍ. １００ ｂｐ分子量标记ꎻ
１. 阴性对照ꎻ ２. 阳性对照ꎻ ３￣６. 带毒蚜虫ꎮ 下同ꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＰＬＲＶ２６２７ ｗｉｔｈ ＰＬＲＶ
Ｍ. １００ ｂｐ Ｍａｒｋｅｒꎻ １. Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ ２. Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ｃｏｎｔｒｏｌꎻ ３￣６. Ｖｉｒｕｌｉｆｅｒｏｕｓ ａｐｈｉｄ. Ｔｈｅ ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ.
图 ２　 引物 ＰＬＲＶＬＲ扩增结果
Ｆｉｇ. ２　 Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＰＬＲＶＬＲ ｗｉｔｈ ＰＬＲＶ
从蚜虫中提取的总 ＲＮＡ可以被用于检测 ＰＬＲＶꎮ
２.５ 检测方法的验证
２.５.１ 有翅蚜中的 ＰＬＲＶ 的检测 　 利用商品薯地块
中随机采集的有翅蚜进行检测方法的验证ꎬ１５ 只有
翅蚜经 ＲＴ￣ＰＣＲ 后利用琼脂糖凝胶电泳测检(图
６)ꎮ 图 ６结果表明ꎬ在 １５只有翅蚜的试验检测验证
中ꎬ共有 ９ 只体内被检测出含有 ＰＬＲＶꎬ检出率为
６０％ꎮ 由于试验中使用的是有翅蚜ꎬ而有翅蚜在自
然地块中是有流动性的ꎮ 在本次试验中ꎬ地块中的
有翅蚜为随机采集ꎬ部分蚜虫可能未能吸食到含有
ＰＬＲＶ的马铃薯叶汁ꎬ所以本次验证中在部分蚜虫
中未检测到 ＰＬＲＶꎮ
２.５.２ 无翅蚜的 ＰＬＲＶ 检测 　 与有翅蚜的验证方式
相同ꎬ利用在商品薯地块卷叶病毒株上的无翅蚜进
９８９８期　 　 　 　 　 　 　 　 　 韩树鑫等: 蚜虫中携带马铃薯卷叶病毒检测方法的改进
图 ３　 引物 ＰＬＲＶ￣ＣＰ 扩增结果
Ｆｉｇ. ３　 Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＰＬＲＶ￣ＣＰ ｗｉｔｈ ＰＬＲＶ
图 ４　 ＲＮＡ提取结果　 Ｍ. 分子量标记ꎻ １￣２. 带毒蚜虫ꎻ
３￣４. 带毒马铃薯植株ꎻ ５. 阳性对照ꎻ ６. 阴性对照ꎮ
Ｆｉｇ. ４　 Ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　 Ｍ. Ｍａｒｋｅｒꎻ １￣２. Ｖｉｒｕｌｉｆｅｒｏｕｓ
ａｐｈｉｄꎻ ３￣４. Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｌａｎｔꎻ ５. Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ ６. Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ.
行检测方法的验证ꎬ试验使用无翅蚜 １５ 只ꎬ经 ＲＴ￣
ＰＣＲ后电泳检测(图 ７)ꎮ 由图 ７ 可知ꎬ在无翅蚜的
检测中ꎬ发现所有被检测的无翅蚜中ꎬＰＬＲＶ 检测均
呈阳性ꎮ 由于无翅蚜不能飞行ꎬ所以在地块中无翅
蚜的流动性与有翅蚜相比较差ꎬ试验采集的无翅蚜
来源于地块中疑似含有 ＰＬＲＶ 的植株ꎬ试验结果也
证明在含有 ＰＬＲＶ 的叶片上采集的无翅蚜ꎬ其体内
已吸食的植物叶汁中含有 ＰＬＲＶ 病毒的比例极高ꎬ
并可以被 ＲＴ￣ＰＣＲ方法所检测ꎮ
３　 讨论
近年来ꎬ马铃薯在我国农业中的地位在不断地
提高ꎮ 出于对马铃薯生产的保障ꎬ马铃薯病毒病的
图 ５　 使用 ＰＬＲＶ￣ＣＰ 对 ＰＬＲＶ的检测
Ｍ. １００ ｂｐ 分子量标记ꎻ １. 阴性对照ꎻ ２. 阳性对照ꎻ
３￣４. 带毒蚜虫ꎻ ５. 带毒马铃薯植株ꎮ
Ｆｉｇ. ５　 Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＬＲＶ ｗｉｔｈ ＰＬＲＶ￣ＣＰ
Ｍ. １００ ｂｐ Ｍａｒｋｅｒꎻ １. Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ ２. Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ
３￣４. Ｖｉｒｕｌｉｆｅｒｏｕｓ ａｐｈｉｄꎻ ５. Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｌａｎｔｓ.
图 ６　 有翅蚜样品中的 ＰＬＲＶ的检测　 Ｍ. 分子量标准ꎻ
１￣２. 带毒蚜虫阳性对照ꎻ ３. 蚜虫阴性对照ꎻ ４￣１６. 田间有翅蚜ꎮ
Ｆｉｇ. ６　 Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＬＲＶ ｉｎ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ａｌａｔａｅ　 Ｍ. Ｍａｒｋｅｒꎻ
１￣２. Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ ３. Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ ４￣１６. Ａｌａｔａｅ.
检测越来越受到重视ꎮ 由于马铃薯病毒病发病区域
广、面积大ꎬ且发病后造成的经济损失及生态环境损
失极大ꎬ这使马铃薯病毒检测受到重视的程度不断
升高ꎮ 目前马铃薯生产中ꎬ大多数种子均为经过脱
毒的马铃薯种薯ꎬ使用这种种子的好处在于ꎬ经过脱
毒后ꎬ种子中并不携带马铃薯病毒ꎬ这样可以避免由
于种子带毒而造成马铃薯病毒病的发生ꎮ 目前生产
中马铃薯病毒病的发生ꎬ多数是在出芽后ꎬ经由蚜虫
等传毒介体传播而来ꎬ所以在蚜虫还未在地块中大
规模出现的时候ꎬ对马铃薯病毒病传毒介体的检测
是预防马铃薯病毒病的一种非常实用的方法ꎮ 现今
０９９ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
图 ７　 无翅蚜样品中的 ＰＬＲＶ的检测　 Ｍ. 分子量标准ꎻ
１、２. 带毒蚜虫阳性对照ꎻ ３. 蚜虫阴性对照ꎻ ４￣１３. 田间无翅蚜ꎮ
Ｆｉｇ. ７　 Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＰＬＲＶ ｉｎ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｗｉｎｇｌｅｓｓ ａｐｈｉｄ
Ｍ. Ｍａｒｋｅｒꎻ １￣２. Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ ３. Ｐｏｓｉｔｉｖｅ
ｃｏｎｔｒｏｌꎻ ４￣１３. Ｗｉｎｇｌｅｓｓ ａｐｈｉｄ.
马铃薯病毒检测较为常用的方法为血清学检测ꎬ当
血清学鉴定不能准确提供检测结果时ꎬ则使用 ＲＴ￣
ＰＣＲ进行联合检测ꎮ ＲＴ￣ＰＣＲ可以在样品中病毒含
量极少的情况下就可以检测到是否有病毒存在ꎬ且
ＲＴ￣ＰＣＲ方法成本较低ꎬ操作简单ꎬ易于推广ꎮ 国际
上ꎬ很早就开始了对马铃薯病毒的检测ꎬ随着检测技
术的发展ꎬ陆续出现了许多新方法ꎮ 可是这些方法
仅有极少的能被应用于实际生产中ꎬ主要原因就是
因为这些技术检测对象主要为马铃薯植株ꎬ仅有少
部分检测方法能被应用于传毒介体ꎬ且由于这些方
法需要的条件较高或检测预报的前瞻性较差导致在
实际生产检测中并不实用(Ｄｕ ｅｔ ａｌꎬ２００６)ꎮ Ｍｅｔｈａ
ｅｔ ａｌ(１９９７)利用的多种方法提取了不同数量的蚜虫
的 ＲＮＡꎬ并进行了检测ꎮ Ｃｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ(１９９７)利用从
植物样本中提取的总 ＲＮＡ 对 ＰＬＲＶ 和马铃薯 Ｙ 病
毒进行了检测ꎮ Ｒｕｓｓｏ ｅｔ ａｌ(１９９９)则利用相似的方
法对佛罗里达州的 ＰＬＲＶ 的发生情况进行了调查ꎮ
同样ꎬ我国对 ＰＬＲＶ 的研究、检测、鉴定也是如此ꎮ
吴兴全等(２００６)对 ＰＬＲＶ福建分离物的 ＣＰ 序列进
行了克隆及序列分析ꎮ 周云和杨永智(２００８)利用
ＰＬＲＶ基因组保守序列片段ꎬ使用 ＲＴ￣ＰＣＲ 方法对
ＰＬＲＶ进行了检测及研究ꎮ 张威等(２０１４)利用了多
重 ＲＴ￣ＰＣＲ检测了马铃薯材料中的三种病毒ꎮ 本研
究利用改进的 ＲＮＡ提取方法ꎬ成功地提取了单头蚜
虫中的 ＲＮＡꎬ经电泳检测 ＲＮＡ 的完整性良好ꎬ可以
被用于 ＲＴ￣ＰＣＲ 检测中ꎮ 同时ꎬ从三组不同的引物
中筛选出了最适合的引物对带毒蚜虫进行了检测ꎬ
检测结果表明ꎬ此方法与其它的方法相比( Ｓｉｎｇｈꎬ
１９９９ꎻＮｉｅ ＆ Ｓｉｎｇｈꎬ２００１)具有试验普适性强ꎬ试剂配
制方便ꎬ复检方便的优势ꎮ 经试验验证ꎬ在有翅蚜和
无翅蚜的检测中ꎬＰＬＲＶ 的检出率远高于使用传统
提取方法进行检测的检出率(Ｍｅｔｈａ ｅｔ ａｌꎬ１９９７)ꎮ
马铃薯生产中使用 ＲＴ￣ＰＣＲ对蚜虫中的病毒进
行检测ꎬ可以对蚜虫携带病毒情况的掌握ꎬ能及时对
ＰＬＲＶ 的发生流行起到预警的作用ꎬ有利于防控ꎮ
通常ꎬ马铃薯植株的检测用于对病害发生的客观评
价ꎬ而当植株被检测出病毒ꎬ或发病症状较重时ꎬ马
铃薯已受到病毒侵害ꎬ且不可逆转ꎮ 利用植物中的
总 ＲＮＡ检测 ＰＬＲＶ需要以新鲜植物组织进行 ＲＮＡ
提取ꎬ而马铃薯由播种到生长为可采摘新鲜叶片的
个体需要一定的时间ꎬ同时 ＰＬＲＶ 从侵染到发病也
需要一定时间ꎬ这样就导致使用马铃薯叶片进行
ＰＬＲＶ的鉴定在生产使用中存在一定时间的滞后
性ꎬ进而导致 ＰＬＲＶ 对马铃薯的生产造成较大的经
济损失ꎮ ＰＬＲＶ 的传播主要是由蚜虫引起ꎬ有翅蚜
一方面是其它地块迁飞而来ꎬ另一方面则是在本地
块产生ꎬ对于迁飞来的蚜虫带毒情况的检测结果ꎬ可
作为预警依据ꎬ指导及早防病ꎬ甚至在马铃薯田间没
有出苗的时候ꎬ就可以通过检测周围杂草等指示植
物、有翅蚜掌握带毒情况ꎮ 无翅蚜栖息在马铃薯植
株上ꎬ活动范围有限ꎬ无翅蚜携带病毒与马铃薯田间
病毒的发生有密切相关性ꎬ通过田间蚜虫数量与带
毒率就可以预测该地块卷叶病毒的发生、流行情况ꎬ
结合蚜虫防治数据ꎬ进而可以推断出马铃薯感染卷
叶病毒的状况ꎮ 所以ꎬ通过蚜虫中 ＰＬＲＶ的检测ꎬ可
以为马铃薯生产中病毒病的防控提供一种新的
方法ꎮ
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( 上接第 ９６８页 Ｃｏｎｔｉｎｕｅ ｆｒｏｍ ｐａｇｅ ９６８ )
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