全 文 ：怀山药病毒病的研究
李明军 ,张　峰* ,陈明霞 ,于相丽
(河南师范大学生命科学学院 ,河南 新乡　 453002)
摘　要: 目的　探明怀山药病毒病的症状和感染病毒的种类 ,为脱除怀山药病毒、提高产量、改善品质奠定基础。方
法　调查怀山药大田感病情况 ,应用电镜法观察病毒的大小和形状 ,采用分子生物学方法进一步探明病毒种类。结
果　怀山药感染病毒后的症状为叶色失绿、花叶、畸形 ;在透射电镜下 ,观察到长 600～ 1 200 nm的线状病毒 ,并初
步判断为马铃薯 Y病毒 ; PC R扩增后的电泳检测显示出了清晰的马铃薯 Y病毒和马铃薯卷叶病毒的电泳条带。结
论　首次发现怀山药感染的病毒为马铃薯 Y病毒和马铃薯卷叶病毒 ,它是造成怀山药产量下降和品质退化的主要
原因。
关键词: 怀山药 ;马铃薯 Y病毒 ;马铃薯卷叶病毒 ;病毒病
中图分类号: R282. 22　　　文献标识码: A　　　文章编号: 0253 2670( 2003) 11 附 2 03
Study on virus diseases of Dioscorea oppos ita
LI Ming-jun, ZHANG Feng , CHEN Ming-xia, YU Xiang-li
( Colleg e of Life Science, Henan Normal Univ e rsity , Xinxiang 453002, China)
Key words: Disocorea opposita Thunb. ; po tato vi rus Y; po ta to leaf rol l virus; vi rus disease
　　怀山药 Dioscorea opposita Thunb. 为薯蓣科薯
蓣属植物 ,与怀地黄、怀牛膝、怀菊花合称为“四大怀
药” ,主产于河南温县、武陟、沁阳、博爱等地 ,其肉质
根状茎可入药 ,“主治伤中、补虚羸、除寒热邪气 ,补
中益气力”等 [1 ]。由于其药用价值高、品质好 ,故长期
以来其产品畅销东南亚和日本等国。在生产中 ,怀山
药由于长期采用营养繁殖 ,病毒感染严重 ,造成产量
下降、品质退化 ,致使怀山药种植者放弃种植 ,使某
些优良品种 (如铁棍山药 )处于濒临灭绝的境地。因
此 ,探明怀山药感染病毒的症状和种类 ,并采用生物
技术的方法脱除病毒 ,提高产量 ,改善品质已成为怀
山药生产中亟待解决的一个重要问题。
近年来 ,我们对怀山药组织培养和病毒病进行
了系统的研究 [2～ 4 ] ,首次探明了怀山药感染病毒的
种类和症状 ,并通过茎尖培养脱除病毒的方法证明
了病毒病是导致怀山药产量下降、品质退化的主要
原因。 本实验报道的是关于怀山药病毒病方面的研
究结果。
1　材料与方法
1. 1　材料:怀山药优良品种“铁棍山药”和“ 47号山
药” ,均来自温县农业科学研究所。
1. 2　方法
1. 2. 1　病毒病症状的观察:在怀山药生长旺盛的季
节 ( 7～ 9月份 )到怀山药主产区的大田中观察病毒
感染情况 ,并拍照记录。
1. 2. 2　病毒颗粒的分离与提取:从大田采取有典型
症状的感病叶片和地下根状茎 ,作为实验材料 ,取染
病叶片 100 g ,加入 250 mL提取液和 5 g PV P,分批
捣碎 ;匀浆用干净的双层纱布滤过 ,挤出全部汁液 ,
弃去残渣 ;加入 10%氯仿 ,搅拌均匀 ,在高速冷冻离
心机中离心 ( 8 000 r /min, 15 min) ;上清液转移到一
个干净的烧杯中 ,加入混合均匀的 PEG和 NaCl
( 6% PEG+ 3% NaCl) ,将沉淀好的上清液再一次搅
拌均匀 ,离心 ( 8 000 r /min, 15 min) ,弃去上清液 ,取
沉淀 ,加入重悬浮液 (体积为上清液体积的 1 /3) ,搅
拌均匀 ,在高速冷冻离心机离心 ( 8 000 r /min, 15
min) 2次 ;取上清液 ,然后加入混合均匀的 PEG和
NaCl( 6% PEG+ 3% NaCl) ,上清液中加入体积分数
为 25%的 Tri ton-x-100(澄清剂 )澄清 ,在高速冷冻
离心机离心 ( 8 000 r /min, 20 min) ;弃去上清液 ,取
沉淀 ,加入重悬浮液 ,磁力搅拌均匀 ,高速冷冻离心
机离心 ( 8 000 r /min, 15 min) ;离心好的样品中加入
　　　　　　　　中草药　 Chinese Traditional and Herba l Drugs　第 34卷第 11期 2003年 11月　　　　　　· 附 3·
收稿日期: 2003-05-30基金项目:河南省重点科技攻关项目 ( 0123030900; 0324420016)作者简介:李明军 ( 1962- ) ,男 ,河南温县人 , 1992年获中国科学院植物研究所理学硕士学位 ,现为河南师范大学生命科学学院副教授 ,硕士生导师 ,研究方向为植物生物技术及其应用。 Tel: ( 0373) 3326340 /3328189 ( O)　 E-mail: limingju n2002@ 263. net
* 现工作单位:河南商丘师范学院生物系
重悬浮液和 20%的蔗糖溶液 ,超速离心机中离心
( 35 000 r /min, 2 h) ;弃去上清 ,所得的沉淀即为病
毒沉淀 ,加入约 100μL的重悬浮液 ,使沉淀完全溶
解 ,把溶液转移到小的离心管中 ,再离心 ( 1 000 r /
min, 10 min) 1次 ,把上清液转移到小离心管中 ,获
得病毒提取汁液。
1. 2. 3　病毒颗粒的形态观察:取病毒提取汁液少许
于铜网上 ,用 3%磷钨酸负染 ,于透射电镜下观察并
拍摄照片 ,分析结果 ,初步判断病毒的种类。
1. 2. 4　 PCR鉴定法: 用试剂盒 (上海生工 RNA试
剂提取盒 )提取铁棍山药的上部叶片、下部叶片和根
状茎 (地下块茎 )中的总 RNA;用 PV A(马铃薯 A病
毒 )、 PVM (马铃薯 M病毒 )、 PLRV (马铃薯卷叶病
毒 )、 PV S(马铃薯 S病毒 )、 PVX(马铃薯 X病毒 )和
PVY (马铃薯 Y病毒 )的 3′引物分别反转录各
RNA,分别标记为 1A, 2A, 3A, 1M, 2M , 3M , 1R,
2R, 3R, 1S, 2S, 3S, 1X, 2X, 3X, 1Y, 2Y, 3Y;对各反
转录产物进行 PCR目的片断扩增并对 PCR结果进
行琼脂糖电泳检测。
2　结果
2. 1　病毒病的症状:在怀山药生长初期 ,病毒病症
状并不明显 ,在生长的中后期 ,症状逐渐明显 ,初时
叶上出现明显的褪绿斑 ,随后绿色花斑逐渐隆起 ,叶
片斑驳花叶、凸凹卷曲畸形、黄化或坏死 ,感病叶片
明显小于健壮叶片 ,严重时整株矮化 ,生长缓慢 ,地
下块茎明显小于健壮的植株 ,并且畸形 ,产量下降。
经大田调查发现 ,受病毒危害的植株占 50%左右。
2. 2　感染病毒的种类:透射电镜下 ,在症状明显的
“铁棍山药”和“ 47号山药”的病毒提取液中均看到
了病毒 ,他们位于黏液质的包围之中 ,其形状为线
型 ,长度在 600～ 1 200 nm (图 1) ,给它定名为“怀山
药花叶病毒” ,根据其大小和形状 ,可初步判定其属
于马铃薯 Y病毒。
经 PCR检测后发现 ,铁棍山药的上部叶片含有
马铃薯 Y病毒 ( potato virus Y, PVY) ,下部叶片含
有马铃薯卷叶病毒 ( potato leaf roll virus, PLRV ) ,
根部含有马铃薯 Y病毒和马铃薯卷叶病毒 (图 2)。
3　讨论
怀山药是一种传统的道地中药材 ,在源头的生产
中保证其优质和高产具有重要的意义。但由于怀山药
长期采用营养繁殖 ,导致其产量下降、品质退化 ,而病
毒病可能是造成这种现象的重要原因。目前关于怀山
药病毒病方面的研究国内外还未见报道。笔者首次通
过电镜观察 ,发现了形态和大小与马铃薯 Y病毒相
a-铁棍山药　　　　　　　　　　 b-47号山药
a-D.opposita tie-gun　　　　 b-D. opposita 47
图 1　电镜下怀山药病毒颗粒的形态
Fig. 1　 Shape of virus particle of D . opposita
by electron-microscopy
泳道 1～ 6分别为阴性对照、 Marker、上部叶片、下部叶片、根部、根部
的 PCR电泳结果。 其中 3, 6为 PV Y; 4, 5为 PLRV。
Elect roph oresi s result s display: 1- 6 indicate negat ive
cont rol , M ark er, upper leav es , und er leaves, roots , root EM
of PCR respectively, 3, 6 are PV Y; 4, 5 are PL RV
图 2　 PCR检测结果
Fig. 2　 Results of PCR test
同的病毒颗粒 ,经过分子生物学方法进一步检测后 ,
证明怀山药确实含有马铃薯 Y病毒 ,同时还发现其
含有马铃薯卷叶病毒。 马铃薯 Y病毒通过感染的块
茎长期存在 ,在马铃薯上产量损失可达 80% ;马铃薯
卷叶病毒所造成的卷叶病是马铃薯的主要病毒病害
之一 ,精确的损失难以统计 ,一般与其他病毒同时侵
染时受害较重 ,重病损失可高达 90% ,使薯块变小 ,
降低商品价值等。我们将茎尖培养获得的怀山药脱毒
苗大田种植后 ,发现其产量较感病植株大幅度提高
(另文发表 ) ,这进一步证实了病毒病是造成怀山药产
量下降、品质退化的重要原因。
目前 ,在怀山药的生产中应当利用生物技术培
养脱毒苗并大力推广应用 (这一工作我们正在进行 ,
· 附 4· 　　　　　　　　中草药　 Chinese Traditional and Herba l Drugs　第 34卷第 11期 2003年 11月　　　　　　
研究成果已通过省级鉴定 )。除此之外 ,还应该加强
田间管理 ,及时发现并淘汰田间病株 ,感病的地下根
状茎也不能作为下一年的种栽 ,防止再度传染 ;培养
和利用抗病或耐病品种 ,尤其是要运用基因工程等
手段培育抗病新品种 ,从根上解决病毒感染的问题 ,
为怀山药的优质高产打下良好的基础 ,真正实现中
药材生产中提出的“药材好 ,药才好”的目标 ,使怀山
药这种道地的中药材更好地为人类服务。
致谢: 本实验得到了福建农林科技大学谢联辉
院士和山东农业大学王玉军副教授的大力协助。
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罂粟霜霉病越冬菌态及初侵染来源研究
李金花 1 ,柴兆祥 1 ,董克勇 2 ,魏勇良 1
( 1. 甘肃农业大学 植物保护系 ,甘肃 兰州　 730070; 2. 甘肃农垦良种有限责任公司 ,甘肃 景泰　 730400)
　　罂粟霜霉病树状霜霉 Peronospora arborescens
de Bary一直严重威胁着罂粟的生产。植物病害的防
治 ,总是要从病害循环的某一环节入手。而对于既有
初侵染又有再侵染的罂粟霜霉病来说 ,初侵染来源
及越冬菌态问题成了防治的关键所在。为此 ,作者于
1995- 1997年对罂粟霜霉病的初侵染来源进行了
研究。
1　材料与方法
1. 1　供试材料: 1995— 1997年连续 3年从种植区 1
分别采集系统型病株的根、茎、叶片、花瓣、果壳、萼
片、种子和非系统型病株的显症叶片 [1 ]。 检查叶片
时 ,材料取自病斑处及与病部相邻的健部。
1. 2　方法: 对根、茎、萼片、果壳回软后进行徒手切
片 ;花瓣、叶片剪成 0. 5 cm2的方块。用 5% NaOH或
KOH煮数分钟至病组织退色 ,清水冲洗后用吸水纸
吸干 ,在乳粉油中浸泡 0. 5 h[ 2]。后镜检卵孢子的有
无及数量。各器官随机镜检 40个视野 ,计算 40个视
野的平均值。
镜检种子前 ,用拨针剥开种子 ,挤出胚乳 ,分别
镜检胚乳和种子。 以蒸馏水为载浮剂。
1. 3　卵孢子形成时期:分别于 1995, 1996和 1997
年 4～ 7月 ,每隔 10 d左右从种植区 1采集系统型
病株。采集到的标样压制成干标本 ,镜检卵孢子的有
无。 方法同 1. 2。
1. 4　种子带菌检验
1. 4. 1　收集系统型病株种子: 1995- 1997年连续 3
年在种植区 1对系统型病株挂牌 ,收集系统型病株
的种子。
1. 4. 2　种子内部带菌检验:检查新 1号系统型病株
上严重皱缩的果壳种子、系统型病株上外表正常的
果壳种子、非系统型病株种子及健株种子种皮和胚
乳的带菌情况。 方法同 1. 2。
1. 4. 3　种子外部带菌检查:将新 1号系统型病株上
严重皱缩的果壳种子、外表正常的果壳种子、非系统
型病株种子及健株种子分别取 0. 5 g,置于小烧杯
中 ,分别加灭菌水 10 mL,充分搅拌。将上清液 1 000
r /min离心 5 min,取沉淀物镜检。所用器皿都经过
严格清洗。
1. 5　连作年限与系统型病株率关系的田间调查:
1995- 1997年 4月下旬在种植区 1调查不同连作
年限罂粟田的系统型病株率。每一处理调查 1小区 ,
每小区 200 m2 ,共 11行 ,每行 5个样点 ,每样点 30
株 ,共 1 650株。调查品种为新 1号。
2　结果与分析
　　　　　　　　中草药　 Chinese Traditional and Herba l Drugs　第 34卷第 11期 2003年 11月　　　　　　· 附 5·
收稿日期: 2003-01-11作者简介:李金花 ( 1972- ) ,女 ,甘肃秦安县人 ,讲师 ,硕士 ,现于甘肃农业大学攻读作物遗传育种学博士学位 ,主要从事植物病害研究。