全 文 ：　 Ｇｕｉｈａｉａ　 Ａｕｇ. ２０１６ꎬ ３６(８):９１５－９２２
ｈｔｔｐ: / / ｊｏｕｒｎａｌ.ｇｘｚｗ.ｇｘｉｂ.ｃｎ
ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｇｕｉｈａｉａ－ｊｏｕｒｎａｌ.ｃｏｍ
ＤＯＩ: １０.１１９３１ / ｇｕｉｈａｉａ.ｇｘｚｗ２０１４１１００３
胡延萍ꎬ 包蕊ꎬ 王莉ꎬ 等. 西藏嵩草 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ反应体系优化研究 [Ｊ]. 广西植物ꎬ ２０１６ꎬ ３６(８):９１５－９２２
ＨＵ ＹＰꎬ ＢＡＯ Ｒꎬ ＷＡＮＧ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ｏｎ Ｋｏｂｒｅｓｉａ ｔｉｂｅｔｉｃａ [Ｊ]. Ｇｕｉｈａｉａꎬ ２０１６ꎬ ３６(８):９１５－９２２
西藏嵩草 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ反应体系优化研究
胡延萍１ꎬ 包　 蕊１ꎬ 王　 莉１ꎬ 石　 琳１ꎬ２ꎬ 李　 毅１∗
( １. 中国科学院西北高原生物研究所ꎬ 西宁 ８１０００８ꎻ ２. 中国科学院大学ꎬ 北京 １０００４９ )
摘　 要: 西藏嵩草(Ｋｏｂｒｅｓｉａ ｔｉｂｅｔｉｃａ )为莎草科嵩草属多年生草本ꎬ根状茎短ꎬ秆密集丛生ꎮ 生于海拔 ２ ５５０ ~
４ ９５０ ｍ的河滩地、湿润草地、高山灌丛草甸ꎬ分布于甘肃、青海、四川西部、西藏东部ꎬ其根系发达ꎬ喜湿ꎬ耐寒ꎬ
生活力强ꎮ 西藏嵩草繁殖以营养繁殖为主、有性繁殖为辅ꎬ其茎叶茂盛ꎬ有较高的营养价值ꎬ产草量高ꎬ是青藏
高原夏、秋两季的主要放牧饲草ꎮ 该研究以青藏高原高寒沼泽化草甸的建群种和优势种———西藏嵩草为材
料ꎬ对影响其 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ反应的因素(Ｍｇ２＋、Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ、引物和模板 ＤＮＡ)进行 ５ 因素 ４水平的正
交试验ꎬ以确定西藏嵩草 ＩＳＳＲ分析的最佳反应体系ꎬ并筛选适宜的 ＩＳＳＲ 引物及各引物的最佳退火温度ꎮ 结
果表明:建立了适宜于西藏嵩草 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ反应的最佳体系为 ２０ μＬ反应液中包括 １０ × ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ、１.５
ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１ Ｍｇ２＋、１.０ Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、０.１００ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１ ｄＮＴＰ、０.３ μｍｏｌ􀅰Ｌ￣１引物和 ３０~４０ ｎｇ ＤＮＡ模板ꎻ同时
从 １００条 ＩＳＳＲ引物中筛选出了扩增结果清晰、稳定的 １２条引物ꎬ各引物的最佳退火温度为 ４８.０~ ５３.２ ℃(引
物不同ꎬ其最佳退火温度也不同)ꎻ西藏嵩草 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ 适宜的扩增程序为首先预变性 ９４ ℃ ５ ｍｉｎꎬ然后变性
９４ ℃ ２０ ｓ、复性 ４８.０~５３.２ ℃ １ ｍｉｎ、延伸 ７２ ℃ ８０ ｓ、３８个循环ꎬ最后 ７２ ℃延伸 ６ ｍｉｎꎮ 体系稳定性验证结果
表明ꎬ该体系在西藏嵩草其他样品中所得条带清晰且多态性丰富ꎬ为后续西藏嵩草的遗传多样性分析和优良
牧草种质资源筛选研究奠定了基础ꎮ 该研究结果对以西藏嵩草为优势种的高寒沼泽化草甸研究及湿地生态
系统的修复和保护具有重要意义ꎮ
关键词: 西藏嵩草ꎬ 莎草科ꎬ ＩＳＳＲ￣ＰＣＲꎬ 反应体系ꎬ 正交设计
中图分类号: Ｑ９４５　 　 文献标识码: Ａ　 　 文章编号: １０００￣３１４２(２０１６)０８￣０９１５￣０８
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ｏｎ Ｋｏｂｒｅｓｉａ ｔｉｂｅｔｉｃａ
ＨＵ Ｙａｎ￣Ｐｉｎｇ１ꎬ ＢＡＯ Ｒｕｉ１ꎬ ＷＡＮＧ Ｌｉ１ꎬ ＳＨＩ Ｌｉｎ１ꎬ ２ꎬ ＬＩ Ｙｉ１∗
( １. Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｔｅａｕ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｘｉｎｉｎｇ ８１０００８ꎬ
Ｃｈｉｎａꎻ ２. Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００４９ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｋｏｂｒｅｓｉａ ｔｉｂｅｔｉｃａꎬ ｂｅｌｏｎｇｉｎｇ ｔｏ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ ｏｆ Ｋｏｂｒｅｓｉａ ａｎｄ ｔｈｅ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ Ｃｙｐｅｒａｃｅａｅꎬ ｉｓ ａ ｐｅｒｅｎｎｉａｌ ｈｅｒｂ. Ｔｈｅ
ｒｈｉｚｏｍｅｓ ｏｆ Ｋ. ｔｉｂｅｔｉｃａ ａｒｅ ｓｈｏｒｔ ａｎｄ ｃｕｌｍｓ ａｒｅ ｄｅｎｓｅｌｙ ｔｕｆｔｅｄ. Ｉｔ ｉｓ ｍａｉｎｌｙ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ ｉｎ Ｑｉｎｇｈａｉꎬ Ｇａｎｓｕꎬ ｗｅｓｔ ｏｆ Ｓｉｃｈｕａｎ
ｐｒｏｖｉｎｃｅｓ ａｎｄ ｅａｓｔ ｏｆ Ｔｉｂｅｔ Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎ ａｔ ａｌｔｉｔｕｄｅｓ ｒａｎｇｉｎｇ ｆｒｏｍ ２ ５５０ ｍ ｔｏ ４ ９５０ ｍ ａｎｄ ｃａｎ ｂｅ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ａｌｐｉｎｅ
ｓｗａｍｐｙ ｍｅａｄｏｗｓꎬ ｗｅｅｄｙ ｐｌａｉｎｓꎬ ｍａｒｓｈｅｓ ａｎｄ ｒｉｖｅｒｓｉｄｅｓ. Ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｋ. ｔｉｂｅｔｉｃａ ｉｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ. Ｂｅｓｉｄｅｓꎬ ｉｔ ｉｓ ｈｙ￣
ｇｒｏｐｈｉｌｏｕｓꎬ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｃｏｌｄ ａｎｄ ｓｔｒｏｎｇ ｉｎ ｖｉｔａｌｉｔｙ. Ｆｏｒ ｔｈｅ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｋ. ｔｉｂｅｔｉｃａꎬ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｉｓ ｐｒｉｏｒ ｔｏ
收稿日期: ２０１４￣１１￣０４　 　 修回日期: ２０１５￣０５￣０７
基金项目: 国家自然科学基金(３１２００２４５)ꎻ国家科技支撑计划项目(２０１２ＢＡＣ０８Ｂ０４)ꎻ中国科学院青年创新促进会项目(２０１４３８６)ꎻ青海省国际
科技合作项目(２０１５￣ＨＺ￣８０８) [Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ(３１２００２４５)ꎻ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｋｅｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒ ＆ Ｄ Ｐｒｏｇｒａｍ
(２０１２ＢＡＣ０８Ｂ０４)ꎻ Ｙｏｕｔｈ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ(２０１４３８６)ꎻ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｇｒａｍ ｆｏｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｑｉｎｇｈａｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ(２０１５￣ＨＺ￣８０８)]ꎮ
作者简介: 胡延萍(１９８１￣)ꎬ女ꎬ山东定陶人ꎬ博士ꎬ副研究员ꎬ主要从事植物生物技术研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｙｐｈｕ＠ ｎｗｉｐｂ.ｃａｓ.ｃｎꎮ
∗通讯作者: 李毅ꎬ研究员ꎬ博士生导师ꎬ主要从事植物遗传资源与繁育研究ꎬ(Ｅ￣ｍａｉｌ)ｌｉｙｉ＠ ｎｗｉｐｂ.ｃａｓ.ｃｎꎮ
ｓｅｘｕａｌ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ. Ｋ. ｔｉｂｅｔｉｃａ ｐｌａｎｔｓ ａｒｅ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｅｃｏｎｏｍｉｃ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ. Ｔｈｅ ｓｔｅｍ ａｎｄ ｌｅａｆ ｏｆ Ｋ. ｔｉｂｅｔｉｃａ
ａｒｅ ｌｕｘｕｒｉａｎｔ. Ｋ. ｔｉｂｅｔｉｃａ ｃｏｎｔａｉｎｓ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｃｒｕｄｅ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ ｆａｔｓ ａｎｄ ｉｓ ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ ｂｙ ｌｉｖｅｓｔｏｃｋ ｏｖｅｒ ｏｔｈｅｒ ｐｌａｎｔｓ
ｆｏｕｎｄ ｏｎ ｔｈｅ ｐｌａｔｅａｕ. Ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｋ. ｔｉｂｅｔｉｃａ ｇｒａｓｓ ｉｓ ｏｆ ｈｉｇｈ ｙｉｅｌｄ. Ａｓ ａ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅꎬ ｉｔ ｉｓ ｔｈｅ ｍａｊｏｒ ｇｒａｚｉｎｇ ｆｏｒａｇｅ
ｇｒａｓｓ ｏｆ ｓｕｍｍｅｒ ａｎｄ ａｕｔｕｍｎ ｉｎ Ｑｉｎｇｈａｉ￣Ｔｉｂｅｔ Ｐｌａｔｅａｕ. Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬ Ｋ. ｔｉｂｅｔｉｃａ ｉｓ ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ
ｏｆ ａｌｐｉｎｅ ｓｗａｍｐ ｍｅａｄｏｗｓ ｉｎ Ｑｉｎｇｈａｉ￣Ｔｉｂｅｔ Ｐｌａｔｅａｕ. Ｋ. ｍｅａｄｏｗｓ ａｒｅ ａｌｓｏ ｈｉｇｈｌｙ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｃａｒｂｏｎ ｓｔｏｒａｇｅ ａｎｄ ｓｅｒｖｅ ａｓ
ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｃａｒｂｏｎ ｓｉｎｋｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ. Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅꎬ Ｋ. ｔｉｂｅｔｉｃａ ｗａｓ ｃｈｏｓｅｎ ａｓ ｔｈｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｂｊｅｃｔ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ. Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｅｓｔａｂ￣
ｌｉｓｈ ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ Ｉｎｔｅｒ Ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｒｅｐｅａｔｓ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ (ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ) ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｋ. ｔｉｂｅｔｉｃａꎬ ｆａｃｔｏｒｓ
ｗｈｉｃｈ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬ ｓｕｃｈ ａｓ ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ｉｏｎ (Ｍｇ２＋)ꎬ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅꎬ ｄＮＴＰꎬ ｐｒｉｍｅｒ ａｎｄ
ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅꎬ ｗｅｒｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ａｎｄ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｏｆ ｆｉｖｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｆｏｕｒ ｌｅｖｅｌｓ. Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎꎬ
ｓｕｉｔａｂｌｅ ＩＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｆｒｏｍ １００ ＩＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｂｙ ｇｒａｄｉ￣
ｅｎｔ ＰＣＲ. Ａｓ ａ ｒｅｓｕｌｔꎬ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ ｉｎ Ｋ. ｔｉｂｅｔｉｃａ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｉｎ ａ ２０ μＬ ｖｏｌｕｍｅ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２
μＬ １０× ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒꎬ １.５ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１ Ｍｇ２＋ꎬ １.０ Ｕ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅꎬ ０.１００ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１ ｄＮＴＰꎬ ０.３ μｍｏｌ􀅰Ｌ￣１ ｐｒｉｍｅｒ
ａｎｄ ３０－４０ ｎｇ ｔｅｍｐｌａｔｅ ＤＮＡ. Ｏｕｔ ｏｆ １００ ＩＳＳＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｓｃｒｅｅｎｅｄꎬ ｔｗｅｌｖｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｌｅａｒ ａｎｄ ｓｔｅａｄｙ
ｂａｎｄｓ ａｎｄ ｓｕｉｔａｂｌｅ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ｅａｃｈ ｐｒｉｍｅｒ ｗａｓ ４８.０－５３.２ ℃ꎬ ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ ｏｎ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ. Ｔｈｅ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ
ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ ｆｏｒ Ｋ. ｔｉｂｅｔｉｃａ ｗａｓ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ: ａｎ ｉｎｉｔｉａｌ ｓｔｅｐ ｏｆ ５ ｍｉｎ ａｔ ９４ ℃ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ３８ ｃｙｃｌｅｓ ｏｆ ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ
ａｔ ９４ ℃ ｆｏｒ ２０ ｓꎬ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ａｔ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ４８.０－５３.２ ℃ (ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｎｎｅａ￣
ｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ) ｆｏｒ １ ｍｉｎ ａｎｄ ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ ａｔ ７２ ℃ ｆｏｒ ８０ ｓꎬ ｅｎｄｉｎｇ ｗｉｔｈ ａ ｆｉｎａｌ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｏｆ ６ ｍｉｎ ａｔ ７２ ℃. Ｔｈｅ ｓｔａｂｉｌｉ￣
ｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｃｌｅａｒ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｄｉｖｉｄｕ￣
ａｌｓ ｏｆ Ｋ. ｔｉｂｅｔｉｃａ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｓｙｓｔｅｍ. Ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ｗａｓ ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｔｏ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ
ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｋ. ｔｉｂｅｔｉｃａ ｇｅｒｍｐｌａｓｍｓ. Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗｉｌｌ ｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｆ
ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ ｆｏｒａｇｅ. Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬ ｉｔ ｉｓ ｏｆ ｇｒｅａｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ Ｋｏｂｒｅｓｉａ￣ｓｗａｍｐ ｍｅａｄｏｗｓ ｉｎ Ｑｉｎｇ￣
ｈａｉ￣Ｔｉｂｅｔ Ｐｌａｔｅａｕ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｔｈｅ ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｗｅｔｌａｎｄ ｅｃｏｓｙｓｔｅｍ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｋｏｂｒｅｓｉａ ｔｉｂｅｔｉｃａꎬ Ｃｙｐｅｒａｃｅａｅꎬ ＩＳＳＲ￣ＰＣＲꎬ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｓｙｔｅｍꎬ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ
　 　 西藏嵩草(Ｋｏｂｒｅｓｉａ ｔｉｂｅｔｉｃａ)ꎬ为莎草科(Ｃｙｐｅｒ￣
ａｃｅａｅ)嵩草属(Ｋｏｂｒｅｓｉａ Ｗｉｌｌｄ.)多年生草本ꎮ 根状
茎短ꎮ 秆密集丛生ꎬ较粗壮ꎬ高 ５ ~ １５ ｃｍꎬ直径 １ ~ ２
ｍｍꎬ有钝棱或圆柱形ꎬ具条纹ꎬ基部具浅褐色至深褐
色枯死叶鞘ꎮ 叶短于秆ꎬ丝状ꎬ宽约 １ ｍｍꎬ边缘席
卷ꎮ 生于海拔 ２ ５５０~４ ９５０ ｍ的河滩地、湿润草地、
高山灌丛草甸ꎬ分布于甘肃、青海、四川西部、西藏东
部ꎬ其根系发达ꎬ喜湿ꎬ耐寒ꎬ生活力强(中国科学院
中国植物志编辑委员会ꎬ ２０００ꎻ 张胜邦和卢学峰ꎬ
２０１２)ꎮ 西藏嵩草的繁殖以营养繁殖为主ꎬ有性繁
殖为辅ꎬ其茎叶茂盛、有较高的营养价值ꎬ产草量高ꎬ
是青藏高原夏、秋两季的主要放牧饲草(邓德山等ꎬ
１９９５ꎻ 马玉寿和徐海峰ꎬ ２０１３)ꎮ 以西藏嵩草为优
势种形成的高寒沼泽化草甸ꎬ具有典型的高原湿地
生态特征ꎬ是青藏高原高寒草甸类草地的组成部分ꎬ
其独特的水源涵养功能ꎬ在维持青藏高原生态系统
平衡及保护生物多样性等方面发挥着重要作用ꎻ其
泥炭的形成与储存对降低大气中温室气体和稳定全
球变化有着重要意义(周兴民ꎬ ２００１ꎻ 李春秀和孙
海松ꎬ ２００９ꎻ田昆等ꎬ ２００９)ꎮ
加拿大蒙特利尔大学 Ｚｉｅｔｋｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ(１９９４)创
建了基于 ＰＣＲ 的分子标记 Ｉｎｔｅｒ￣ｓｉｍｐｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｒｅｐｅａｔｓ (ＩＳＳＲ)ꎮ 该标记操作简单、灵敏度高、稳定
性好而且多态性丰富 ( Ｎａｇａｏｋａ ＆ Ｏｇｉｈａｒａꎬ １９９７ꎻ
Ｄｅｖａｒｕｍａｔｈ ｅｔ ａｌꎬ ２００２)ꎮ 鉴于 ＩＳＳＲ的优点ꎬ现已在
牧草遗传结构分析、基因作图与定位、亲缘关系及种
质资源筛选与育种等方面应用广泛(Ｌｉ ｅｔ ａｌꎬ ２０１３ꎻ
李钰莹和董宽虎ꎬ ２０１４)ꎮ 本研究设计正交试验ꎬ优
化影响青藏高原高寒草甸优势种西藏嵩草 ＩＳＳＲ 的
主要因子(如 Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ、引物
和 ＤＮＡ模板)ꎬ旨在建立适合西藏嵩草 ＩＳＳＲ的稳定
性及重复性好ꎬ多态性丰富的最佳反应体系ꎬ为进一
步开展 ＩＳＳＲ标记在西藏嵩草遗传多样性及种质资
源筛选等方面的研究提供理论依据与遗传基础ꎮ
１　 材料与方法
１.１ 材料
２０１３年 ７ 月赴青海省海北藏族自治州祁连县
境内的石棉矿(３８°２４０′４３.８″ Ｎꎬ ９９°１６′３７.１″ Ｅ)地
６１９ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
区采集西藏嵩草叶片材料ꎬ经中国科学院西北高原
生物研究所卢学峰研究员鉴定为西藏嵩草(Ｋｏｂｒｅｓｉａ
ｔｉｂｅｔｉｃａ)ꎬ凭证标本放置于青藏高原生物标本馆
(ＨＮＷＰꎬ标本号 ２０１３００３)ꎮ
１.２ 试剂
ｄＮＴＰ、Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶、１００ ｂｐ 和 ２００ ｂｐ ＤＮＡ
ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ购于 ＴａＫａＲａ 公司ꎮ 所用引物(Ｓｅｔ
＃９ꎬ由加拿大哥伦比亚大学 Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏ￣
ｌｕｍｂｉａ提供)委托上海生工合成ꎮ
１.３ 方法
１.３.１ 提取 ＤＮＡ 与质量检测 　 基因组 ＤＮＡ 提取采
用 Ｄｏｙｌｅ ＪＪ ＆ Ｄｏｙｌｅ ＪＬ ( １９８７)改进的 ＣＴＡＢ 法ꎮ
ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ｃ 微量紫外分光光度计(Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉ￣
ｅｎｔｉｆｉｃ)检测 ＤＮＡ的纯度和浓度ꎬ其 ＯＤ２６０ / ２８０值均在
２.０４~ ２.１２ 之间ꎬ浓度在 ９５ ~ ４５０ ｎｇ􀅰μＬ￣１之间ꎬ满
足 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ对 ＤＮＡ模板质量的要求ꎮ
１.３.２ ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ 反应体系的优化 　 对 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚
合酶、Ｍｇ２＋、ｄＮＴＰ、Ｐｒｉｍｅｒ及 ＤＮＡ等进行 ５ 个因素 ４
种不同梯度的 Ｌ１６(４５)正交试验筛选(表 １)ꎮ 优化
试验选用 ＵＢＣ８５５ (其序列为 ５′￣ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡ￣
ＣＡＣＡＣＹＴ￣３′)引物ꎮ 每个体系还含有 ２ μＬ 的 １０×
ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒꎬ用超纯水补至 ２０ μＬꎮ ＰＣＲ扩增反应在
Ｃ１０００ ＴｏｕｃｈＴＭ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ型 (Ｂｉｏ￣Ｒａｄ) ＰＣＲ仪
上进行ꎮ 扩增程序为预变性 ９４ ℃ ５ ｍｉｎꎻ变性 ９４ ℃
２０ ｓꎬ复性 ５０ ℃ １ ｍｉｎꎬ延伸 ７２ ℃ ８０ ｓꎬ ３８ Ｃｙｃｌｅｓꎻ
７２ ℃ ６ ｍｉｎ延伸ꎻ并于 ４ ℃保存ꎮ ＰＣＲ产物于水平
板琼脂糖凝胶(浓度为 １.２％)上电泳ꎬ使用凝胶成
像系统(ＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ ＭＰꎬ Ｂｉｏ￣Ｒａｄ)拍照的方法记录
实验结果ꎮ
１.３.３ 引物筛选及其最佳复性温度优化　 在优化后
的 ＰＣＲ体系上ꎬ从 １００条引物中筛选出扩增条带丰
富且清晰、稳定性和多态性好的引物ꎮ 以引物
ＵＢＣ８５５(Ｔｍ ＝ ５２ ℃)为例ꎬ在其 Ｔｍ值上下浮动 ４ ℃ꎬ
设置 ８ 个温度梯度 (４８. ０、４８. ５、４９. ６、５１. ２、５３. １、
５４.７、５５.６、５６.０ ℃)ꎬ其它反应程序同前文正交试验
的扩增程序ꎬ筛选出该引物的最佳退火温度ꎮ
１.３. ４ ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ 体系的稳定性验证 　 用引物
ＵＢＣ８５５对西藏嵩草不同材料进行 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ 扩增ꎬ
进行 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ扩增体系的稳定性检测试验ꎮ
１.４ 统计与分析
采用正交设计直观分析方法评分实验结果ꎬ按
照扩增条带数量丰富度、清晰度及背景深浅的标准
进行打分ꎬ条带数量丰富、清晰且背景低的为 １６ 分ꎬ
最差的为 １分ꎮ 用 ＤＰＳ ７.０５ 软件进行数据统计分
析(唐启义等ꎬ ２００６)ꎮ
２　 结果与分析
２.１ 西藏嵩草正交设计数据分析
图 １ 是西藏嵩草 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ 正交实验的结果ꎬ
处理 １２扩增片段清晰ꎬ重复性好ꎬ亮度适中ꎮ １６ 个
处理的直观打分结果如表 １ꎮ
表 １　 西藏嵩草正交试验 (５因素 ４水平)
Ｔａｂｌｅ １　 Ｏｒｔｈｏｒｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｉｎ Ｋｏｂｒｅｓｉａ ｔｉｂｅｔｉｃａ [Ｌ１６(４
５)]
编号
Ｎｏ.
因素 Ｆａｃｔｏｒｓ
Ｔａｑ
ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍ￣
ｅｒａｓｅ
(Ｕ􀅰
２０ μＬ￣１)
Ｍｇ２＋
(ｍｍｏｌ􀅰
Ｌ￣１)
Ｐｒｉｍｅｒ
(μｍｏｌ􀅰
Ｌ￣１)
ｄＮＴＰ
(ｍｍｏｌ􀅰
Ｌ￣１)
ＤＮＡ
(ｎｇ)
结果 Ｒｅｓｕｌｔｓ
Ｒｅｐｅａｔ
１
Ｒｅｐｅａｔ
２
１ ０.４ ０.９ ０.３ ０.０７５ ２０ ３ ２
２ ０.６ ０.９ ０.４ ０.１００ ３０ ８ ６
３ ０.８ ０.９ ０.５ ０.１２５ ４０ ６ ５
４ １.０ ０.９ ０.６ ０.１５０ ５０ １ １
５ ０.４ １.２ ０.５ ０.１００ ５０ ７ ７
６ ０.６ １.２ ０.６ ０.０７５ ４０ ５ ４
７ ０.８ １.２ ０.３ ０.１５０ ３０ １４ １４
８ １.０ １.２ ０.４ ０.１２５ ２０ １５ １５
９ ０.４ １.５ ０.６ ０.１２５ ３０ ４ ３
１０ ０.６ １.５ ０.５ ０.１５０ ２０ １３ １３
１１ ０.８ １.５ ０.４ ０.０７５ ５０ １１ １２
１２ １.０ １.５ ０.３ ０.１００ ４０ １６ １６
１３ ０.４ １.８ ０.４ ０.１５０ ４０ ９ ９
１４ ０.６ １.８ ０.３ ０.１２５ ５０ ２ ８
１５ ０.８ １.８ ０.６ ０.１００ ２０ １２ １０
１６ １.０ １.８ ０.５ ０.０７５ ３０ １０ １１
　 　 表 ２为方差分析统计结果ꎬ据 Ｆ 值ꎬ各因素对西
藏嵩草 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ的影响程度由强到弱依次为 Ｍｇ２＋、
Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶、引物、模板 ＤＮＡ、ｄＮＴＰꎬ且每个因素
的影响均达到了极显著水平(Ｐ<０.０１)ꎮ 因此ꎬ为确定
各个因素的最佳水平ꎬ需对 ５个因素分别进行因素内
水平间的 Ｄｕｎｃａｎ多重比较(表 ３)ꎮ
Ｍｇ２＋是影响西藏嵩草ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ反应最大的因
７１９８期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 胡延萍等: 西藏嵩草 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ反应体系优化研究
图 １　 西藏嵩草 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ正交设计电泳结果(引物 ＵＢＣ８５５)　 １－１６. 处理编号(表 １)ꎻ Ｍ. １００ ｂｐ＋２００ ｂｐ标准分子量参照物ꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ ｉｎ Ｋｏｂｒｅｓｉａ ｔｉｂｅｔｉｃａ ｗｉｔｈ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ (Ｐｒｉｍｅｒ ＵＢＣ８５５)　
１－１６. Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｎｕｍｂｅｒｓ ａｓ ｓｈｏｗｅｄ ｉｎ Ｔａｂｌｅ １ꎻ Ｍ. １００ ｂｐ＋２００ ｂｐ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌａｄｄｅｒ.
表 ２　 不同因素对西藏嵩草 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ影响的方差分析
Ｔａｂｌｅ ２　 ＡＮＯＶＡ ｆｏｒ ｅａｃｈ ｆａｃｔｏｒ ｏｆ ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ
ｒｅａｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｋｏｂｒｅｓｉａ ｔｉｂｅｔｉｃａ
变异来源
Ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ
ｖａｒｉａｔｉｏｎ
平方和
Ｓｕｍ ｏｆ
ｓｑｕａｒｅｓ
自由度
ｄｆ
均方
Ｍｅａｎ
ｓｑｕａｒｅ
Ｆ值
Ｆ ｖａｌｕｅ
Ｐ￣值
Ｐ ｖａｌｕｅ
Ｍｇ２＋ ２３４.２５０ ０ ３ ７８.０８３ ３ ４９.９７３ ３ ０.０００ １∗∗
Ｔａｑ ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １５０.２５０ ０ ３ ５０.０８３ ３ ３２.０５３ ３ ０.０００ １∗∗
ｄＮＴＰ ５４.０００ ０ ３ １８.０００ ０ １１.５２０ ０ ０.０００ ３∗∗
Ｐｒｉｍｅｒ １４２.２５０ ０ ３ ４７.４１６ ７ ３０.３４６ ７ ０.０００ １∗∗
ＤＮＡ ７４.２５０ ０ ３ ２４.７５０ ０ １５.８４０ ０ ０.０００ １∗∗
Ｅｒｒｏｒ ２５.０００ ０ １６ １.５６２ ５
　 注: ∗∗差异极显著(Ｐ<０.０１)ꎮ
　 Ｎｏｔｅ: ∗∗Ｈｉｇｈｌｙ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ(Ｐ<０.０１) .
素ꎮ 当 Ｍｇ２＋浓度在 ０.９ ~ １.５ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１之间时ꎬ随
Ｍｇ２＋浓度增加ꎬ其评分结果均值呈增大趋势ꎻ当
Ｍｇ２＋浓度达 １.８ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１时ꎬ结果均值有减小趋势
(图 ２)ꎮ Ｍｇ２＋浓度为 ０.９ ~ １.２ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１ꎬ扩增条带
丰度低且淡弱ꎻ使用 １.５ ~ １.８ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１的 Ｍｇ２＋时ꎬ
所得条带丰度高且清晰明亮ꎬ特别是 １.５ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１
时ꎬ所得条带是实验中最清晰明亮的(处理 １２)ꎮ 因
此ꎬ１.５ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１是 Ｍｇ２＋最适宜的浓度ꎮ
Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶对西藏嵩草 ＩＳＳＲ 反应的影响
仅次于 Ｍｇ２＋(表 ２)ꎬ评分结果均值随酶量的增加呈
增大趋势(图 ３)ꎮ 当 Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶量为 ０.４ ~ ０.６
Ｕ时ꎬ扩增条带少ꎻＴａｑ ＤＮＡ 聚合酶量为 ０.８ ~ １.０ Ｕ
时ꎬ所得条带逐渐增多ꎮ 由 Ｄｕｎｃａｎ比较(表 ３)结果
可知ꎬ仅水平 ３与 ４差异不显著ꎬ其它水平间均差异
图 ２　 Ｍｇ２＋浓度与评分结果均值间的关系　
Ｆｉｇ. ２　 Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｍｇ２＋ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｍｅａｎ ｇｒａｄｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ
显著ꎮ 综上结果及酶量的经济性原则ꎬ确定水平 ４
(１.０ Ｕ􀅰２０ μＬ￣１)是 Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶的最佳用量ꎮ
对西藏嵩草 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ 影响较大的另一因素是
引物浓度ꎬ引物浓度低时ꎬ扩增效率低ꎻ引物浓度偏
高ꎬ则会导致错配、非特异性扩增及引物二聚体生成
等可能性(图 ４)ꎬ对不同分子量大小片段的扩增ꎬ引
物浓度具有一定的选择性ꎮ 由图 １ 可知ꎬ引物浓度
为 ０.３ ~ ０.４ μｍｏｌ􀅰Ｌ￣１时ꎬ小于 ４００ ｂｐ 的片段未出
现ꎬ而大于 １ ２００ ｂｐ的片段被清晰明显扩增出来ꎻ当
浓度增加到 ０.６ μｍｏｌ􀅰Ｌ￣１时(处理 ４、６、９、１５)ꎬ大于
１ ２００ ｂｐ的条带少且弱ꎬ出现了小于 ４００ ｂｐ的片段ꎮ
说明低浓度引物对大片段条带的扩增有利ꎬ高浓度
引物则有利于小片段条带扩增ꎮ 多重比较表明ꎬ水
平 １与水平 ２和 ３差异不显著ꎬ水平 １与水平 ４差异
８１９ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
表 ３　 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ各因素水平间 Ｄｕｎｃａｎ比较
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｄｕｎｃａｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ ｏｆ ｆａｃｔｏｒｓ ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ ｒｅａｃｔｉｏｎ
Ｍｇ２＋
(ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１)
均值
Ａｖｅｒａｇｅ
Ｔａｑ ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
(Ｕ􀅰２０ μＬ￣１)
均值
Ａｖｅｒａｇｅ
ｄＮＴＰ
(ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１)
均值
Ａｖｅｒａｇｅ
Ｐｒｉｍｅｒ
(μｍｏｌ􀅰Ｌ￣１)
均值
Ａｖｅｒａｇｅ
ＤＮＡ
(ｎｇ)
均值
Ａｖｅｒａｇｅ
１.５ １１.０００ａ １.０ １０.６２５ａ ０.１００ １０.２５０ａ ０.４ １０.６２５ａ ２０ １０.３７５ａ
１.２ １０.１２５ａｂ ０.８ １０.５００ａ ０.１５０ ９.２５０ａ ０.３ ９.３７５ａｂ ３０ ８.７５０ｂ
１.８ ８.８７５ｂ ０.６ ７.３７５ｂ ０.１２５ ７.２５０ｂ ０.５ ９.０００ｂ ４０ ８.７５０ｂ
０.９ ４.０００ｃ ０.４ ５.５００ｃ ０.０７５ ７.２５０ｂ ０.６ ５.０００ｃ ５０ ６.１２５ｃ
　 注: ０.０５显著水平ꎬ不同字母表示处理间差异显著ꎬ字母相同则表示不存在显著差异ꎮ
　 Ｎｏｔｅ: Ｄａｔａ ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｄｉｆｆｅｒ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｗｈｉｌｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｌｅｔｔｅｒｓ ｎｏｔ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ａｔ ０.０５ ｌｅｖｅｌ.
图 ３　 Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶浓度与评分结果均值的关系
Ｆｉｇ. ３　 Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔａｑ ＤＮＡ
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｅａｎ ｇｒａｄｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ
图 ４　 引物浓度值与评分结果平均值的关系
Ｆｉｇ. ４　 Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｍｅａｎ ｇｒａｄｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ
显著ꎮ 确定引物的适宜浓度为 ０.３ μｍｏｌ􀅰Ｌ￣１ꎮ
评分结果均值随模板 ＤＮＡ 用量的增加而减少
图 ５　 模板 ＤＮＡ浓度对评分结果平均值的影响
Ｆｉｇ. ５　 Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｍｐｌａｔｅ
ＤＮＡ ｏｎ ｔｈｅ ｍｅａｎ ｇｒａｄｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ
(图 ５)ꎮ 当 ＤＮＡ 用量为 ２０ ｎｇ 时(处理 １、８、１０、
１５)ꎬ因模板量太少ꎬ扩增的稳定性差ꎮ 仅水平 ２ 与
水平 ３差异不显著ꎬ水平 １ 与其它 ３ 个水平差异显
著ꎬ水平 ４ 与水平 ２、３ 差异也显著ꎮ 因此ꎬ模板
ＤＮＡ的用量范围在 ３０~４０ ｎｇ均可ꎮ
ｄＮＴＰ 对 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ反应的影响最小(表 ３)ꎬ评
分均值结果波动不剧烈(图 ６)ꎮ 当 ｄＮＴＰ 为 ０.０７５
ｍｍｏｌ时(处理 １、６、１１、１６)ꎬ扩增条带少且不清晰ꎻ
当 ｄＮＴＰ 大于 ０.１００ ｍｍｏｌ 时ꎬ扩增条带逐渐增多ꎮ
Ｄｕｎｃａｎ分析表明ꎬ水平 １与水平 ３、水平 ２ 与水平 ４
差异不显著ꎻ水平 １、３与水平 ２、４差异显著ꎮ 所以ꎬ
选取 ｄＮＴＰ 的最佳浓度为 ０.１００ ｍｍｏｌꎮ
比较上述不同分析方法数据处理结果ꎬ本研究
中每个因子 ( Ｍｇ２＋、 Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、 ｄＮＴＰ、
ｐｒｉｍｅｒ和 ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ)的最适浓度组合是处理 １２ꎬ
即 ２０ μＬ 反应体系中含有 １.５ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１ Ｍｇ２＋、１.０
９１９８期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 胡延萍等: 西藏嵩草 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ反应体系优化研究
Ｕ􀅰 ２０ μＬ￣１ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶、 ０. １００ ｍｍｏｌ 􀅰 Ｌ￣１
ｄＮＴＰ、０.３ μｍｏｌ􀅰Ｌ￣１ ｐｒｉｍｅｒ和 ４０ ｎｇ 模板 ＤＮＡꎮ
图 ６　 ｄＮＴＰ 浓度对评分结果均值的影响
Ｆｉｇ. ６　 Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｄＮＴＰ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｎ
ｍｅａｎ ｇｒａｄｉｎｇ ｒｅｓｕｌｔｓ
２.２ 引物筛选及其最佳退火温度
图 ７为退火温度试验(ＵＢＣ８５５ 引物)结果ꎬ退
火温度对 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ结果影响明显ꎮ 当退火温度低
于 ５１.２ ℃时ꎬ小于 ８００ ｂｐ的片段较少ꎬ１ ２００~１ ４００
ｂｐ的片段多ꎬ整体条带亮度较弱ꎮ 当退火温度高于
５３.１ ℃时ꎬ４００ ~ ８００ ｂｐ 的片段增多且逐渐清晰ꎬ大
于 １ ６００ ｂｐ的片段亮度增强ꎬ但１ ２００ ~ １ ４００ ｂｐ 的
片段逐渐消失ꎮ 退火温度为 ５３.１ ℃时ꎬ所得扩增条
带丰富且清晰稳定ꎬ因此引物 ＵＢＣ８５５ 的最佳退火
温度为 ５３.１ ℃ꎮ 据此方法ꎬ筛选出 １２ 条理想的引
物ꎬ其序列及最佳退火温度见表 ４ꎮ
２.３ ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ优化体系稳定性检测
用引物 ＵＢＣ８５５和 ＵＢＣ８４６ 对西藏嵩草不同个
体进行扩增ꎬ验证优化体系的稳定性ꎮ 从图 ８ 中可
以看出ꎬ扩增产物电泳条带丰度高且清晰明亮ꎮ 由
此可见ꎬ优化后的 ＩＳＳＲ 反应体系是稳定可靠的ꎬ可
用于西藏嵩草种质资源遗传结构分析ꎮ
３　 讨论与结论
ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ 反应扩增结果受反应体系各组成成
分、反应条件和实验材料等诸多因素的影响(胡延
萍等ꎬ ２００７ꎻ 李猛等ꎬ ２０１３)ꎮ 对不同物种而言ꎬ其
ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ反应的最佳条件各异ꎬ并且由于试验设计
的因素水平不同ꎬ各因素水平的影响也有差异ꎮ 为
确保 ＩＳＳＲ分析结果的正确性及可重复性ꎬ须在实验
图 ７　 引物(ＵＢＣ８５５)退火温度试验　 １－８泳道的
复性温度分别为 ４８.０、４８.５、４９.６、５１.２、５３.１、５４.７、５５.６、
５６.０ ℃ꎻ Ｍ. ２００ ｂｐ标准分子量参照物ꎮ
Ｆｉｇ. ７　 Ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ ＵＢＣ８５５
Ｒｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｌａｎｅｓ １－８ ｗｅｒｅ ４８.０ꎬ ４８.５ꎬ
４９.６ꎬ ５１.２ꎬ ５３.１ꎬ ５４.７ꎬ ５５.６ꎬ ５６.０ ℃ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎻ
Ｍ. ２００ ｂｐ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ.
前事先对体系条件进行优化筛选ꎮ 本研究中ꎬ西藏
嵩草 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ 扩增反应的影响因素为 Ｍｇ２＋ >Ｔａｑ
ＤＮＡ聚合酶>引物>模板 ＤＮＡ>ｄＮＴＰꎮ Ｍｇ２＋对西藏
嵩草 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ反应的影响最为显著ꎬ这与蚬壳花
椒(李猛等ꎬ ２０１３)和紫云英(孙清信等ꎬ ２０１２)中的
研究结果一致ꎮ 所以ꎬ确定合适的 Ｍｇ２＋浓度对西藏
嵩草 ＩＳＳＲ实验来说是非常重要的工作ꎮ 反应液中
处于游离态的 Ｍｇ２＋不仅会影响反应过程中 Ｔａｑ
ＤＮＡ聚合酶的活性ꎬ还可进一步结合反应液中的
ＤＮＡ ｔｅｍｐｌａｔｅ、ｄＮＴＰ 和 ｐｒｉｍｅｒꎬ从而会改变 ｐｒｉｍｅｒ与
ｔｅｍｐｌａｔｅ的结合效率、ｔｅｍｐｌａｔｅ与 ＰＣＲ产物的解链温
度以及产物的特异性(胡延萍等ꎬ ２０１０)ꎮ 因此ꎬ本
研究适宜的 Ｍｇ２＋浓度为 １.５ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１ꎮ Ｔａｑ ＤＮＡ
聚合酶对西藏嵩草 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ 的影响居第二位ꎬ仅
次于 Ｍｇ２＋ꎬＴａｑ ＤＮＡ聚合酶浓度过低会使 ＰＣＲ扩增
片段少且条带弱ꎬ浓度过高不仅成本高而且会引起
非特异性扩增ꎮ 本研究以 １.０ Ｕ为合适用量ꎮ 引物
是 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ特异性反应的关键ꎬ引物浓度过低仅
能扩增出大片段的条带ꎬ小片段的条带不能有效扩
增ꎻ浓度过高则会引起错配和非特异性扩增ꎬ且会形
成引物二聚体(胡延萍等ꎬ２０１４)ꎬ本研究中适宜的
引物浓度是 ０.３ μｍｏｌ􀅰Ｌ￣１ꎮ 模板 ＤＮＡ是 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ
的研究对象ꎬ在保证其质量的前提下ꎬＩＳＳＲ 对模板
ＤＮＡ用量的要求范围通常较广ꎬ本试验中模板 ＤＮＡ
０２９ 广　 西　 植　 物　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ３６卷
表 ４　 １２条引物碱基组成及其最适复性温度
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｂａｓｅ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｏｐｔｉｍｕｍ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｗｅｌｖｅ ｐｒｉｍｅｒｓ
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
序列 (５′→３′)
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′→３′)
退火温度
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
(℃)
引物
Ｐｒｉｍｅｒ
序列 (５′→３′)
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′→３′)
退火温度
Ａｎｎｅａｌｉｎｇ
ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
(℃)
８０７ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＴ ４８.６ ８３４ ＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＹＴ ４８.０
８１１ ＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＣ ５０.０ ８４６ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＲＴ ５１.０
８１７ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＡ ５１.０ ８５３ ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＲＴ ５３.２
８１８ ＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＧ ４９.２ ８５５ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＹＴ ５３.１
８２２ ＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＴＣＡ ５２.０ ８５６ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＹＡ ５１.０
８３０ ＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＴＧＧ ５２.２ ８５７ ＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＡＣＹＧ ４８.０
　 注: Ｒ ＝ (Ａꎬ Ｇ)ꎻ Ｙ ＝ (Ｃꎬ Ｔ)ꎮ
　 Ｎｏｔｅ: Ｒ＝(Ａꎬ Ｇ)ꎻ Ｙ ＝ (Ｃꎬ Ｔ).
图 ８　 引物 ＵＢＣ８４６和 ＵＢＣ８５５对西藏嵩草不同个体 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ扩增的结果　 Ｍ. １００ ｂｐ＋２００ ｂｐ标准分子量参照物ꎮ
Ｆｉｇ. ８　 Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｉｎ Ｋｏｂｒｅｓｉａ ｔｉｂｅｔｉｃａ ｂｙ
ＵＢＣ８４６ ａｎｄ ＵＢＣ８５５　 Ｍ. １００ ｂｐ＋２００ ｂｐ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ.
的用量为 ３０ ~ ４０ ｎｇꎮ ｄＮＴＰ 是对西藏嵩草 ＩＳＳＲ￣
ＰＣＲ反应影响最小的因素ꎮ 本研究表明ꎬｄＮＴＰ 浓
度为 ０.１００ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１时ꎬ扩增的结果最理想ꎮ
西藏嵩草 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ 不同引物的退火温度各
异ꎬ其范围为 ４８.０~５３.２ ℃ꎮ 不同的物种ꎬ不同的引
物其碱基组成和序列长短不同ꎬ引物的退火温度也
不同ꎮ 包蕊等(２０１４)对华扁穗草 ＩＳＳＲ 分析时ꎬ引
物 ＵＢＣ８３４的退火温度为 ５５.４ ℃ꎬ在唐古特大黄中
ＵＢＣ８３４的退火温度为 ５３ ℃(Ｈｕ ｅｔ ａｌꎬ ２０１４)ꎬ而本
研究中ꎬ该引物的最适退火温度为 ４８ ℃ꎮ 因此ꎬ在
ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ反应中ꎬ对于不同的引物ꎬ须根据其熔点
各自筛选其适宜的退火温度ꎬ不能统一而论ꎮ
正交试验设计可以对 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ 反应体系中的
多个因素同时进行筛选ꎬ能够快速获得满意的水平
组合ꎬ从而避免单因素试验繁琐且费时的缺点ꎮ 本
研究通过正交试验设计ꎬ优化西藏嵩草 ＩＳＳＲ中每个
因子的最适浓度ꎬ并采用直观分析和方差分析的方
法ꎬ筛选出其最佳反应体系ꎮ 即在 ２０ μＬ 反应体系
中包括 １０ × ＰＣＲ ｂｕｆｆｅｒ ２ μＬ、１.５ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１ Ｍｇ２＋、
１.０ Ｕ􀅰２０ μＬ￣１ Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶、０.１００ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１
ｄＮＴＰ、０.３ μｍｏｌ􀅰Ｌ￣１ ｐｒｉｍｅｒ和 ３０~４０ ｎｇ ＤＮＡ模板ꎮ
筛选出具有理想扩增结果的 １２条引物ꎬ并进一步确
定了这 １２条引物对应的最适退火温度ꎮ 利用筛选
出的最佳反应条件对西藏嵩草不同个体进行验证ꎬ
所得电泳图谱清晰稳定ꎬ能够迅速有效地检测出不
同个体之间的差异ꎮ 西藏嵩草是青藏高原高寒沼泽
１２９８期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 胡延萍等: 西藏嵩草 ＩＳＳＲ￣ＰＣＲ反应体系优化研究
草甸的优势种ꎬ利用 ＩＳＳＲ分子标记研究西藏嵩草种
质资源遗传多样性和遗传结构ꎬ对青藏高原退化草
甸的修复和保护具有重要的意义ꎮ
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