全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　Jan．２０１４,３４(１):１０－１４　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０１．００３
杨章旗,冯源恒,吴东山．细叶云南松天然种源林遗传多样性的SSR分析[J]．广西植物,２０１４,３４(１):１０－１４
YangZQ,FengYH,WuDS．AnalysisofgeneticdiversityofPinusyunnanensisvar．tenuifolianaturepopulationsbySSRmarker[J]．Guihaia,２０１４,
３４(１):１０－１４
细叶云南松天然种源林遗传多样性的SSR分析
杨章旗１,冯源恒１,吴东山２
(１．广西林业科学研究院,南宁５３０００２;２．广西大学,南宁５３０００５)
摘　要:利用１２对SSR引物对三个不同种源的细叶云南松群体遗传多样性进行研究.结果表明:共检测到
１３个位点３７个等位基因,每个位点平均观察等位基因数(A)为２．８５,多态率为１００％;平均有效等位基因数
(Ne)１．４５.各群体内的有效等位基因数平均为１．４４７,观察杂合度平均为０．３４１,期望杂合度平均为０．２８１.三
个群体的Nei’s基因多样度指标的变化范围为０．２５６~０．２９７,Shannon多样性指数变化范围为０．４４８~０．４８４,
各群体间的多态性水平差异不大.细叶云南松群体间的基因分化系数(Gst)为０．０８９,群体间的遗传分化水平
较低,大部分变异均存在群体内.细叶云南松群体间的基因流(Nm)在不同位点的变化范围从４．６９３~
１２２．１８９,平均为１１．１７.说明细叶云南松群体间存在比较充分的基因交流.
关键词:细叶云南松;SSR分子标记;遗传多样性
中图分类号:Q９４９　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０１Ｇ００１０Ｇ０５
AnalysisofgeneticdiversityofPinusyunnanensisvar．
tenuifolianaturepopulationsbySSRmarker
YANGZhangＧQi１,FENGYuanＧHeng１,WUDongＧShan２
(１．GuangxiAcademyofForestrySciences,Nanning５３０００２,China;２．GuangxiUniversity,Nanning５３０００５,China)
Abstract:SSRmarkerswereusedtostudygeneticdiversityoftreediferentnaturepopulationsofPinusyunnanensis
var．tenuifolia．Theresultsshowedthat１３sitesand３７alelesweredetected．Foreverysite,theaveragevalueofobＧ
servationalelenumber(A)was２．８５,polymorphismratewas１００％andtheaveragevaluesofefectivenumberofalＧ
leles(Ne)was１．４５．Theaveragevalueofeffectivenumberofaleleswas１．４４７withineachpopulation．P．yunnanenＧ
sisvar．tenuifoliahadalowgeneticdiversitylevelamongthethreepopulations,theaverageobservedheterozygosity
(Ho)was０．３４１andtheaverageexpectedgeneheterozygosity(He)was０．２８１．Nei’sgenediversities(h)atpopulaＧ
tionlevelwere０．２５６and０．２９７．Shannon’sinformationindexes(I)atpopulationlevelwere０．４４８and０．４８４．InaddiＧ
tion,thethreepopulationsdeviatedfrom HardyＧWeinbergequilibrium．Theaveragecoeficientgenediferentiation
(Gst)was０．０８９．MostofvariationappearedinnerpopulationandtherewasnotgenediferentiationsamongpopulaＧ
tions．Therangeofgeneflowofdiferentgenepolymorphismsiteswas４．６９３－１２２．１８９,theaveragenumberwas
１１．１７,whichindicatedthatthehabitatofP．yunnanensisvar．tenuifoliawaslimitedandresultedinthelimitednatuＧ
ralvariation,buttherewereabundantgeneexchangesbetweeneachpopulation．
Keywords:Pinusyunnanensisvar．tenuifolia;SSRmolecularmarker;geneticdiversity
收稿日期:２０１３Ｇ０６Ｇ１５　　修回日期:２０１３Ｇ０９Ｇ０６
基金项目:八桂学者专项经费资助(松树资源培育及产业化关键技术创新)
作者简介:杨章旗(１９６４Ｇ),男,广西资源人,博士,教授级高级工程师,主要从事林木遗传育种研究,(EＧmail)yangzhangqi＠１６３．com.
　　细叶云南松(Pinusyunnanensisvar．tenuifoＧ
lia)是云南松的一个地理变种,产于贵州南部、广西
西北部海拔３００~１６００m及广西西部百色等地,沿
河谷形成纯林(李治基等,１９８１).细叶云南松为常
绿乔木,针叶３针１束,细柔下垂与思茅松较相似;
为减少水份丧失,保证在干燥环境下生存,松针外层
包裹角质和腊质外膜.细叶云南松较耐瘠薄,在土
壤肥力不高的林区能良好生长,并可达到南方速生
丰产林的要求(杨炳强等,１９８８).细叶云南松树干
通直,出材率高,结构适中细腻,有松脂,较抗病虫
害,是一种重要的南方材脂两用树种,也是广西松科
资源中重要的一个变种和重要的木材生产原料(钟
业聪等,１９９０).
细叶云南松研究开始于２０世纪８０年代,中国
科学院植物研究所对广西细叶云南松的地理分布、
群系和群落特点进行了研究,发现细叶云南松主要
分布在南盘江下游两岸海拔３００~１６００m的丘陵
山地,它对气候和土壤的适应性都较强,常常构成大
面积的天然森林.细叶云南松林一般可分为乔木
层,灌木层和草本地被层.其中,乔木层又分为乔木
第一亚层和乔木第二亚层和乔木第三亚层,主要由
细叶云南松组成;中间灌木层覆盖度４０％~５０％.
草本地被层植物覆盖度为５０％~７０％.它们的形
成和分布与所在地的气候、地貌、土壤和人为生产活
动特别是垦殖和烧山的影响有密切的联系(钟业聪
等,１９９０).由于细叶云南松分布面积有限,对其相
关研究较少,但近年来,由于生态环境遭受严重的破
坏,其生存遇到了严峻的考验.为此,从遗传水平上
对细叶云南松进行研究,了解该物种的总体遗传多
样性水平、基因流动和渗入情况,为细叶云南松资源
的保护与利用,以及对细叶云南松的遗传育种研究
提供参考.
１　材料与方法
１．１试验材料
试验材料包括乐业种源、隆林种源和西林种源
的细叶云南松.其中乐业种源含３０个样本,取自位
于广西乐业县境内的雅长林场的大坪、东明、二沟、
果麻、花坪、那成、雅庭、益来等８个分场(２４°４７″２０″
N,１０６°３３″２９″E),分布在海拔４００~１３５０m范围.
隆林种源含３１个样本,取自广西隆林县德峨乡、金
钟乡和猪场乡(２４°４６″２５″N,１０５°２０″２６″E),分布在
海拔８００~１７５０m范围.西林群体含３１个样本,
取自广西西林县的古樟林场(２４°２９″３３″N,１０５°５″
２８″E),分布在海拔７５０~１１５０m范围.
分别采取新鲜无病害的针叶２０~３０针,装入
５０mL离心管,用硅胶填充干燥后封口保存.群体
内采样树之间的间距在３０m以上,尽量平均分布
于群体分布区域内,采样树龄接近.
表１　供试材料及其来源
Table１　Originorcolectionplaceofmaterials
usedinthisstudy
群体名称
Group
name
采样地点
Sampling
location
采样数目
Sampling
No．
平均树高
Average
height
平均胸径
DBH
平均轮枝数
Average
branchNo．
乐业种源
Leye
provenance
乐业县
Leye
County
３０ １６．９９ ２０．５３ １７
隆林种源
Longlin
provenance
隆林县
Longlin
County
３１ １５．４８ １９．１２ １７
西林种源
Xilin
provenance
西林县
Xilin
County
３１ １５．６４ １９．３２ １６
１．２实验方法
１．２．１DNA 的提取与纯化　参照张博等(２００４)
CTABＧ硅珠法稍作改动提取样品的 DNA,并对提
取的DNA进行纯化,用紫外分光光度计和１％琼脂
糖凝胶电泳检测DNA质量和浓度,将提取的DNA
稀释至统一浓度后,放Ｇ２０℃保存备用.
１．２．２PCR扩增　所设计引物由上海捷瑞基因技术
有限公司合成,Taq酶、dNTPs购自捷瑞生物工程
公司.PCR反应体系为１０μL:TrisＧHCI１０mmol/
LpH ８．０,KCI５０ mmol/L,Mg２＋２．５ mmol/L,
dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各０．２mmol/
L),引物２．５pmol,Taq聚合酶０．０８U,DNA１０~
２０ng.扩增反应程序采用TouchＧdownPCR:９４℃
１５s,６０℃１５s(△℃＝Ｇ０．５),７２℃３０s,１６cycles;在
进入９４℃１５s,５２℃１５s,７２℃３０s,１０cycles;最后
７２℃延伸１５min.
１．２．３聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)　SSRＧPCR产
物在８％的聚丙烯酰胺凝胶上电泳,银染检测.银
染检测步骤为PCR产物加等体积上样缓冲液,８％
聚丙烯酰胺凝胶(１００mL凝胶包括４２g尿素,２０
mL４０％丙烯酰胺和 N,N＇Ｇ亚甲双丙烯酰胺(１９∶
１),０．５mL１０％过硫酸铵,５０μLTEMED,１０mL
１０×TBE电泳缓冲液)２４０V稳压电泳１h后固定
染色;固定１０min(固定液１０％乙醇,０．５％乙酸),
１１１期　 　　　　　　　杨章旗等:细叶云南松天然种源林遗传多样性的SSR分析
ddH２O漂洗２次每次２min;再用０．１５％AgNO３ 染
色７min,ddH２O 漂洗２次每次２min,最后显影
(１．５％NaOH,０．００７５６％NaBO４,１％甲醛)至条带清
晰,照相记录.
１．２．４SSR引物筛选　本研究所使用的SSR引物根
据广西林科院对马尾松基因组DNA 测序所得基因
组DNA序列设计开发,共开发１２７对.首先,利用
遗传上相对较远的马尾松、细叶云南松、湿地松、加
勒比松的DNA样品对１２７对引物进行PCR扩增,
筛选出有目的扩增产物,主带清晰的引物;然后再用
马尾松、细叶云南松DNA样品各８个样本对初筛
所得到的引物进行复筛,共选取了１２对具有多态性
的SSR引物用于本实验的群体遗传多样性研究.
１．２．５天然群体遗传多样性方法　SSR为共显性标
记,同一引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被
认为具有同源性.采用小源凝胶成像系统,对所得
的图片进行判读,然后根据所读的数据用A,B,C,
D,E􀆺按条带长度从大到小进行编号.
采用POPGENE３２软件(Yehetal．,１９９７)计
算群体间和群体内的观察等位基因数目(A),有效
等位基因数目(Ne),Shannon多样性指数(I),各位
点的观察杂合度(Ho)和期望杂合度(He),Nei基因
多样度(h),固定指数(F).采用POPGENE３２软件
计算基因分化系数(Fst)和基因流(Nm),用于反映
群体间的遗传分化程度;检测各群体是否符合 HarＧ
dyＧWeinberg平衡定律,度量各群体的连锁不平衡
状况;用POPGENE３２软件分析得遗传距离.
２　结果与分析
２．１SSR引物的筛选
首先采用马尾松、细叶云南松、湿地松、加勒比
松对设计开发的１２７对引物进行PCR扩增,从扩增
结果发现有１２２对引物有主带清晰的扩增产物.之
后再利用马尾松和细叶云南松对初选引物进行复
选,其中２３对引物在细叶云南松中表现出多态性,
１８对引物在马尾松中表现出多态性.从中选取１２
对引物用于本实验,部分扩增结果如图１所示.
２．２细叶云南松天然群体遗传多样性分析
表２显示,１２对引物共检测到１３个位点３７个
等位基因,每个位点平均观察等位基因数(A)为
２．８５,多态率为１００％;有效等位基因数从位点
PF３５１的１．０３到位点PF４０６的１．９７,平均有效等位
图１　PF４０８号引物对乐业群体(a)、西林群体(b)和
隆林群体(c)的扩增结果
Fig．１　ElectrophoresispatternamplifiedfromLeye
population(a),Xilinpopulation(b)andLonglin
population(c)withprimerPF４０８
基因数(Ne)为１．４５.２对引物揭示的细叶云南松
Shannon多样性指数范围在０．７３８~０．０８３之间,平
均为０．４８８.观察杂合度的值范围在０．０３２~０．４９７
间,平均为０．２８４;期望杂合度的值从０．０３３~０．８８９,
平均为０．３４２,不同位点的杂合度也存在较大差异.
三个群体的有效等位基因数介于１．３９１~１．５１１
之间,平均为１．４４７.观察杂合度的值从０．３１８~
０．３８１,平均为０．３４１;期望杂合度的值从０．２６１~
０．３０２,平均为０．２８１.说明各群体间的多态性水平
差异不大.按检测到的有效等位基因数(Ne)和期
望杂合度(He)作为标准,隆林群体的遗传多样性最
高,乐业群体的遗传多样性水平最低(表３).三个
群体的Nei’s基因多样度指标的变化范围为０．２５６
~０．２９７,表明３个群体的遗传多样性水平均偏低.
按照Nei’s基因多样度指标对３个群体由高到低排
序为隆林群体＞西林群体＞乐业群体,总体上与
Shannon多样性指数分析所得的结论一致.
２．３群体遗传分化与基因流分析
为确定SSR位点上的变异量在群体间及在群
体内的分布情况,采用F统计量对群体的遗传变异
２１ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
表２　细叶云南松的遗传多样度
Table２　GeneticdiversityofPinusyunnanensisvar．tenuifolia
扩增位点
Amplifiedlocus
等位基因数
Α
有效等位基因数
Ne
多样性指数
I
期望杂合度
Exp_Het
观察杂合度
Obs_Het
多样性指数
Nei
PF３５１ ２ １．０３３ ０．０８３ ０．０３３ ０．０３２ ０．０３２
PF３８２ ２ １．２２８ ０．３３３ ０．２０７ ０．１８７ ０．１８６
PF３０３ ４ １．３０１ ０．４９０ ０．２３２ ０．２３３ ０．２３１
PF３１２ ２ １．８７０ ０．６５８ ０．５６ ０．４６８ ０．４６５
PF３１９ ２ １．５２１ ０．５２６ ０．４３９ ０．３４５ ０．３４３
PF３４４ ２ １．３５２ ０．４２９ ０．２５６ ０．２６２ ０．２６
PF３４９ ３ １．０７１ ０．１７０ ０．０６８ ０．０６７ ０．０６６
PF３９０ ３ １．２６８ ０．３８８ ０．２３９ ０．２１３ ０．２１２
PF４０２ ５ １．５５２ ０．７３８ ０．１９８ ０．３５８ ０．３５６
PF４０３Ｇ１ ４ １．３０５ ０．５２２ ０．２５６ ０．２３５ ０．２３４
PF４０３Ｇ２ ３ １．４６３ ０．５５９ ０．３８１ ０．３１８ ０．３１６
PF４０６ ２ １．９７６ ０．６８７ ０．８８９ ０．４９７ ０．４９４
PF４０８ ３ １．８９９ ０．７６２ ０．６８５ ０．４７６ ０．４７４
平均 Mean ２．８４６ １．４４９ ０．４８８ ０．３４２ ０．２８４ ０．２８２
　A＝ Observednumberofaleles;Ne＝ Effectivenumberofaleles;I＝ Shannon＇sinformationindex．
表３　细叶云南松天然群体的遗传多样度比较
Table３　ComparisonofgeneticdiversityoftheP．yunnanensisvar．tenuifoliapopulations
群体名称
Groupname
样本大小
Samplesize
等位基因
Na
有效等位基因数
Ne
多样性指数
I
观察杂合度
Obs_Het
期望杂合度
Exp_Het
多样性指数
Nei
乐业群体
Leyepopulation
３１ ２．５３９ １．３９１ ０．４４８ ０．３１８ ０．２６１ ０．２５６
西林群体
Xilinpopulation
３１ ２．４６２ １．４３９ ０．４６４ ０．３２５ ０．２８１ ０．２７６
隆林群体
Longlinpopulation
３０ ２．３８５ １．５１１ ０．４８４ ０．３８１ ０．３０２ ０．２９７
平均 Mean ２．４６２ １．４４７ ０．４６５ ０．３４１ ０．２８１ ０．２７６
进行分析.Fit和Fis分别代表总群体和单个群体
偏离哈迪－温伯格平衡的程度.整个细叶云南松群
体的平均Fit值为Ｇ０．２１０,平均Fis值为Ｇ０．２３７,说明
无论在总体水平还是群体内个体间,细叶云南松群
体都表现为杂合子过剩的现象.
固定指数(Fst)在不同位点的变化范围为０．００２~
０．０５１,群体平均为０．０２２.在Fst值的基础上计算细
叶云南松群体间的基因流(Nm)在不同位点的变化范
围从４．６９３~１２２．１８９,平均为１１．１７,说明群体间存在
比较充分的基因交流(表４).而由表５可知,细叶云
南松的遗传多样性中群体内的遗传多样性占８６．４％,
群体间的占１３．６％;由h计算的群体间的基因分化系
数(Gst)为０．０８９.这表明,细叶云南松群体间的遗传
分化水平较低,大部分变异均存在群体内.
３　结论与讨论
３．１细叶云南松遗传多样性分析
基于１３个等位基因获得的遗传多样性的结果
显示,细叶云南松天然群体平均观察杂合度为０．３４１,
表４　细叶云南松群体的F统计量和基因流
Table４　FＧstatisticandgeneflowoftheP．yunnanensis
var．tenuifoliapopulations
位点
Locus
单个群体偏离度
Fis
总体编离度
Fit
固定指数
Fst
基因流
Nm
PF３５１ Ｇ０．０５１ Ｇ０．０１６ ０．０３３ ７．３７５
PF３８２ Ｇ０．１２５ Ｇ０．１１３ ０．０１０ ２３．６９０
PF３０３ Ｇ０．００６ ０．０１０ ０．０１５ １６．２１８
PF３１２ Ｇ０．２７１ Ｇ０．２０７ ０．０５１ ４．６９３
PF３１９ Ｇ０．３０２ Ｇ０．２８１ ０．０１６ １５．０５４
PF３４４ Ｇ０．００７ ０．０１４ ０．０２１ １１．６５１
PF３４９ Ｇ０．０４７ Ｇ０．０２７ ０．０１９ １２．６７９
PF３９０ Ｇ０．１７６ Ｇ０．１３０ ０．０４０ ６．０６５
PF４０２ ０．４２６ ０．４４４ ０．０３０ ８．０１４
PF４０３Ｇ１ Ｇ０．１０６ Ｇ０．０９４ ０．０１１ ２２．４３１
PF４０３Ｇ２ Ｇ０．２４８ Ｇ０．２０２ ０．０３７ ６．５０２
PF４０６ Ｇ０．８０２ Ｇ０．７９８ ０．００２ １２２．１８９
PF４０８ Ｇ０．４５８ Ｇ０．４４７ ０．００７ ３３．６０５
Mean Ｇ０．２３７ Ｇ０．２１０ ０．０２２ １１．１７０
期望杂合度为０．２８１,Nei’s基因多样度指标为２．７６,
Shannon多样性指数为０．４６５.与其它树种相比,如
欧洲云杉(Piceaabies)杂合度为０．７８９(Pfeiferetal．,
１９９７),黄杉(Pseudotsugamenziesi)杂合度为０．６７３
(Amarasingheetal．,２００２),欧洲栓皮栎 (Quercus
３１１期　 　　　　　　　杨章旗等:细叶云南松天然种源林遗传多样性的SSR分析
表５　细叶云南松的遗传分化
Table５　GeneticsdifferentiationofP．yunnanensis
var．tenuifoliapopulations
指标Index
Shannon
指数
指标Idnex
Nei
指数
群体内遗传多样性 Hpop ０．４２２ 群体内的基因多样
性 Hs
０．２５７
群体总的遗传多样性Hsp ０．４８８ 群体总的基因多样
性 Ht
０．２８２
群体内遗传多样性所占比
值 Hpop/Hsp
０．８６４ 群体内基因多样性
所占比值 Hs/Ht
０．９１１
群体间遗传多样性所占比
值(Hsp－Hpop)/Hsp
０．１３６ 遗传分化系数Gst ０．０８９
suber)杂合度为０．６４８(Horneroetal．,２００１),遗传
多样性偏低.这一方面与细叶云南松自身的分布面
积相对狭小集中连续分布的特点有关,另一方面也
受到了本次研究采用的马尾松SSR引物在细叶云
南松中位点多态性较低的影响.本次研究采用的马
尾松SSR引物具有较高的种间通用性,在应用过程
中发现引物在湿地松、加勒比松等狭长分布或岛状
分布的松类中多态性较高,而在马尾松、细叶云南松
等连续集中分布的松类中多态性较低且杂合体偏
多.导致这种深层次原因还有待以后进行深入研
究.而且细叶云南松天然群体的杂合子过剩也可能
与其处于云南松与马尾松分布区的交汇地带有关,
其可能受到了外来近缘种的基因迁入与渐渗.而细
叶云南松、云南松及马尾松的亲缘关系与进化起源
关系同样值得深入研究.
３．２细叶云南松天然群体遗传结构
遗传变异在群体间小尺度空间上的分布,甚至
群体间大尺度上不同空间的分布是群体遗传结构的
重要特征之一,与进化和生态遗传过程有着不可分
割的联系.由于空间遗传结构的形成和改变是生
境、自然选择和植物繁育系统共同作用的结果,因此
空间遗传结构的分析有助于探讨各种进化因素的作
用和揭示植物的濒危机制,为最大限度地保护和利
用遗传多样性提供参考和依据.
本研究在群体遗传机构分析中得到细叶云南松
天然群体间的遗传分化水平较低,绝大部分变异存
在于群体内.群体间的基因流,平均为１１．１７,表明
细叶云南松在相对狭小的分布区内存在比较充分的
基因交流.研究结果比云南松、高山松和思茅松各
自的居群内遗传变异要高,相对居群间遗传变异要
低(虞泓等,２０００).每到花期,松类的花粉随风力传
送,并在空中形成“花粉云”(polencloud),这如同
一个巨大而丰富的基因型混合库,使松类的交配系
统可以保持较高遗传多样性.细叶云南松地理分布
上范围狭窄、且集中分布的态势,则有利于“花粉云”
对种群形成覆盖,从而使群体间的基因交流顺畅.
本次采样采集的均是成年的大树,其展现的遗传信
息是多年以前形成的.近年来对细叶云南松生境的
人为干扰急剧加重,细叶云南松生境已经呈现出片
段化的趋势,也改变了原有的基因交流格局.因此
应该进行更深入的细叶云南松保育遗传学研究,以
便对这一树种进行科学有效的保护.
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４１ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷