全 文 ：广 西 植 物 Guihaia　May２０１４,３４(３):２９９－３０３　　　　　　　　　　 http://journal．gxzw．gxib．cn　
DOI:１０．３９６９/j．issn．１０００Ｇ３１４２．２０１４．０３．００４
黄琼林,梁凌玲,何瑞,等．应用matK 基因鉴别青天葵及其常见混伪品[J]．广西植物,２０１４,３４(３):２９９－３０３
HuangQL,LiangLL,HeR,etal．ApplymatKgenetoidentifyNerviliafordianditscommonadulterants[J]．Guihaia,２０１４,３４(３):２９９－３０３
应用matK 基因鉴别青天葵及其常见混伪品
黄琼林,梁凌玲,何　瑞,詹若挺,陈蔚文∗
(广州中医药大学 中药资源科学与工程研究中心 岭南中药资源教育部重点实验室,广州５１０００６)
摘　要:分析了青天葵及其混伪品matK 序列,以期在分子水平建立青天葵及其常见混伪品的鉴别方法.采
用一对通用引物对matK 基因进行PCR扩增并测序,所得序列用DNAMAN、MEGA等软件进行分析.获得
青天葵及其混伪品的matK 基因序列长度为５８７bp,平均GC含量为３２．８％.青天葵的种内遗传距离为０,与
混伪品种间遗传距离范围为０．０１６~０．３７５.基于matK 基因序列构建的NJ聚类树能明显地区别青天葵及其
混伪品.因此,应用matK 基因序列可以有效鉴别青天葵及其混伪品.
关键词:青天葵;matK 基因;混伪品
中图分类号:Q９４８　　文献标识码:A　　文章编号:１０００Ｇ３１４２(２０１４)０３Ｇ０２９９Ｇ０５
ApplymatKgenetoidentifyNerviliafordi
anditscommonadulterants
HUANGQiongＧLin,LIANGLingＧLing,HERui,
ZHANRuoＧTing,CHENWeiＧWen∗
(KeyLaboratoryofChineseMedicinalResourcefromLingnan(GuangzhouUniversityofTraditionalChineseMedicine),
MinistryofEducation,ResearchCenterofChineseHerbalResourceScienceandEngineering,Guangzhou
UniversityofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou５１０００６,China)
Abstract:InordertoestablishthenovelmethodondistinguishingNerviliafordianditscommonadulterants,matK
genesfromN．fordianditsadulterantswereamplifiedandsequencedusingapairofuniversalprimes．Theresults
revealedthatmatKgenesacquiredfromN．fordianditsadulterantscontained５８７basepairs,andaverageGCconＧ
tentwas３２．８％．TheintraspecificdistancesamongN．fordi were０,whereastheinterspecificdistancebetweenN．
fordiianditsadulterantsrangedfrom０．０１６to０．３７５．TheclusteringtreeaccordingtoNeighborJoiningmethodand
Kimura２ＧParametermodeldiscriminatedN．fordiianditsadulterantsobviously．matKgeneissuggestedtobean
effectivebiomarkertoidentifyN．fordianditscommonadulterants．
Keywords:Nerviliafordi;matKgene;adulterant
　　青天葵为岭南地区道地药材,主产地为广西、广
东,来源于兰科植物毛唇芋兰(Nerviliafordii)的
全草或叶片,具有镇咳平喘、抗肿瘤、增强免疫、抗菌
等作用.临床上主要用于治疗肺部疾病,尤其是在
治疗百日咳等小儿呼吸道疾病等方面具有良好效
果.青天葵野生资源由于过度开采,加上其自身繁
殖条件苛刻,现已面临枯竭(陈蔚文,２０１０).由于资
源短缺,市场上屡见青天葵的伪品或掺假品,常见的
有同属植物毛叶芋兰(N．plicata)、车前科车前草
(Plantagoasiatica)、伞形科积雪草(CentellaasiaＧ
收稿日期:２０１３Ｇ０８Ｇ２８　　修回日期:２０１３Ｇ１１Ｇ０８
基金项目:教育部博士点基金(２００８０５７２０００４);教育部留学回国人员科研项目(教外司留[２００９]１００１).
作者简介:黄琼林(１９８６Ｇ),男,广东湛江人,博士,主要从事创新中药研究与开发工作,(EＧmail)perfecthql＠１６３．com.
∗通讯作者:陈蔚文,博士,教授,主要从事创新中药研究与开发工作,(EＧmail)chenww＠gzucm．edu．cn.
tiaca)、旋花科红薯叶(Ipomoeabatatas)等(梅全
喜,２００８).青天葵也因叶片大小被分为三个类型,
即大叶型、中叶型和小叶型(杜勤等,２００９).混伪品
的化学成分和功效多与青天葵存在差异,它们的存
在严重影响了青天葵的临床安全和用药质量.因
此,青天葵的真伪鉴别是其合理用药和资源保护的
首要前提.
传统青天葵及其混伪品鉴别方法,如性状鉴别、
显微鉴别等(广东省药材公司,１９９８;乐凡,２００６),容
易受到植物生长发育阶段、生长环境及加工条件等
诸因素影响,主观性强,重复性和稳定性差,而且需
要具有专业知识的人员进行.杜勤等(２００９)利用
RAPD分子标记揭示了青天葵及其常见混伪品在
DNA基因组上的差异,然而RAPD是基于PCR和
随机引物扩增的方法,虽然避免了传统鉴定方法的
主观误差,但其操作复杂,重复性和稳定性也较差.
近年来,DNA条形码在中药品种鉴别方面应用
广泛,matK 基因已被认为是植物DNA条形码有效
的候选片段之一,广泛应用于中药的真伪鉴别、系统
发育探讨和亲缘关系分析(滕艳芬等,２００２;王亚玲
等,２００６;马剑等,２０１０).目前,应用matK 基因快
速鉴别青天葵及其混伪品未见有报道.为此,本文
针对３种不同叶型青天葵以及４种常见混伪品
matK 基因序列进行分析和鉴定,为青天葵的真伪
鉴别和临床用药提供分子依据.
１　材料与方法
１．１植物材料
实验材料及Genbank下载序列见表１.采集供
试植物的叶片,置硅胶中保存,经广州中医药大学中
药资源科学与工程研究中心詹若挺研究员鉴定.
１．２试剂
植物基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生
物科技公司;PCR 试剂、ExTaq DNA 聚合酶、
DNAMarkers购自大连宝生物工程公司;引物合成
和测序由北京六合华大基因科技股份有限公司广州
分公司完成.
１．３DNA提取
取硅胶保存的干燥叶片约０．０５g,用蒸馏水清
洗表面并擦拭干净,采用植物基因组总DNA提取
试剂盒提取供试植物DNA.将DNA溶液稀释至
浓度为２５ng/μL,分装并置Ｇ２０℃保存.
表１　样品信息及Genbank登记号
Table１　ThecolectedinformationandGenbank
accessionnumbersofthesamples
物种 类型 来源 Genbank登记号
青天葵
Nerviliafordi
大叶
BigＧleaf
本实验室培育
Cultivatedinourlab
JX６２９２７５Ｇ
JX６２９２７７
青天葵
N．fordi
中叶
MiddleＧleaf
本实验室培育
Cultivatedinourlab
JX６２９２７８Ｇ
JX６２９２７９
青天葵
N．fordi
小叶
SmalＧleaf
本实验室培育
Cultivatedinourlab
JX６２９２８０Ｇ
JX６２９２８１
毛叶芋兰
N．plicata
Genbank JN００４５１１Ｇ
JN００４５１２
车前草
Plantagoasiatica
广州中医药大学药王山
Medicinalmountain,Guangzhou
UniversityofChineseMedicine
JX６２９２８２
车前草
P．asiatica
广东省平远县
Pingyuan,Guangdong
JX６２９２８３
积雪草
Centelaasiatiaca
广州中医大学药王山
Medicinalmountain,Guangzhou
UniversityofChineseMedicine
JX６２９２８４
积雪草
C．asiatiaca
广东省平远县
Pingyuan,Guangdong
JX６２９２８５
红薯叶
Ipomoeabatatas
广州中医大学药王山
Medicinalmountain,Guangzhou
UniversityofChineseMedicine
JX６２９２８６
红薯叶
I．batatas
广州大学城
HigherEducationMegaCenter,
Guangzhou
JX６２９２８７
１．４PCR扩增和测序
PCR扩增的正向引物为 M３F (５′ＧCGTACAGＧ
TACTTTTGTGTTTACGAGＧ３′),反向引物为 M１R
(５′ＧACCCATGCCATCTGGAAATCTTGGTTCＧ３′)(HＧ
olingsworthetal．,２００９).
PCR反应体系:总体积为１００μL,其中１０×Ex
Taqbufer１０μL、dNTP(１０mmol/L)６．０μL、正反向
引物(１０μmol/L)各２．０μL、模板DNA３．０μL、Ex
TaqDNA聚合酶(２．５U/μL)１．０μL,用灭菌蒸馏水补
足体积.PCR反应程序:９４℃２min;９４℃０．５min,
５２℃０．５min,７２℃１．０min,３３个循环;７２℃５min.
PCR产物经１％琼脂糖凝胶电泳检测后,送样纯化及
双向测序.
１．５序列分析
采用DNAMAN和 Omiga２．０进行序列拼接
校对,去除序列两端的低质量区,并利用CLUSTＧ
ALX１．８３进行多重比对.将获得的条形码片段序
列进行Blastn(NucleoteideBlast)比对确认后,采用
Bankit软件提交至Genbank.采用CLUSTALX软
件比对序列,基于Kimura２ＧParameter双参数模型
和NeighborＧJoining邻接法,运用 MEGA４．０分析
遗传距离并构建系统发育树(１０００次重复bootＧ
strap检验各分支的支持率).
００３ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
２　结果与分析
２．１PCR扩增
青天葵及其混伪品matK 基因的PCR扩增产
物经琼脂糖凝胶电泳检测,得到的条带约８００bp
(图１).１３个供试样品的PCR产物纯化后,均获得
质量可靠的序列.采用Bankit向Gnebank提交序
列,获得的序列登记号见表１.
２．２序列分析
获得青天葵及其混伪品matK 序列的长度为
５８７bp,平均GC含量为３２．８％.不同叶型青天葵
样品matK 基因序列完全一致.青天葵与同属的毛
叶芋兰有９处差异位点,与其他混伪品之间的变异
较大,序列比对结果如图２所示.
图１　青天葵及其常见混伪品matK 基因电泳图　
M．DL２０００标记;１．青天葵;２．车前草;３．积雪草;４．番薯叶.
Fig．１　ElectrophoretogramofmatKgenefrom
Nerviliafordianditscommonadulterants　M．DL
２０００markers;１．Nerviliafordi;２．Plantagoasiatica;
３．Centellaasiatiaca;４．Ipomoeabatatas．
表２　青天葵及其混伪品的K２P遗传距离
Table２　TheK２PgeneticdistancesofNerviliafordiianditscommonadulterants
１ ２ ３ ４ ５ ６ ７ ８ ９ １０ １１ １２ １３ １４ １５
１　NerviliafordiJX６２９２７５
２　N．fordiJX６２９２７６ ０．０００
３　N．fordiJX６２９２７７ ０．０００ ０．０００
４　N．fordiJX６２９２７８ ０．０００ ０．０００ ０．０００
５　N．fordiJX６２９２７９ ０．０００ ０．０００ ０．０００ ０．０００
６　N．fordiJX６２９２８０ ０．０００ ０．０００ ０．０００ ０．０００ ０．０００
７　N．fordiJX１３５５８１ ０．０００ ０．０００ ０．０００ ０．０００ ０．０００ ０．０００
８　N．plicataJN００４５１１ ０．０１６ ０．０１６ ０．０１６ ０．０１６ ０．０１６ ０．０１６ ０．０１６
９　N．plicataJN００４５１２ ０．０１６ ０．０１６ ０．０１６ ０．０１６ ０．０１６ ０．０１６ ０．０１６ ０．０００
１０　PlantagoasiaticaJX１３５５８２ ０．３７５ ０．３７５ ０．３７５ ０．３７５ ０．３７５ ０．３７５ ０．３７５ ０．３６９ ０．３６９
１１　P．asiaticaJX１３５５８３ ０．３７５ ０．３７５ ０．３７５ ０．３７５ ０．３７５ ０．３７５ ０．３７５ ０．３６９ ０．３６９ ０．０００
１２　CentellaasiatiacaJX１３５５８４ ０．３０９ ０．３０９ ０．３０９ ０．３０９ ０．３０９ ０．３０９ ０．３０９ ０．３０４ ０．３０４ ０．２４３ ０．２４３
１３　C．asiatiacaJX１３５５８５ ０．３０９ ０．３０９ ０．３０９ ０．３０９ ０．３０９ ０．３０９ ０．３０９ ０．３０４ ０．３０４ ０．２４３ ０．２４３ ０．０００
１４　IpomoeabatatasJX１３５５８６ ０．３３３ ０．３３３ ０．３３３ ０．３３３ ０．３３３ ０．３３３ ０．３３３ ０．３２７ ０．３２７ ０．２８３ ０．２８３ ０．２４９ ０．２４９
１５　I．batatasJX１３５５８７ ０．３３３ ０．３３３ ０．３３３ ０．３３３ ０．３３３ ０．３３３ ０．３３３ ０．３２７ ０．３２７ ０．２８３ ０．２８３ ０．２４９ ０．２４９ ０．０００
２．３遗传距离计算
根据KimuraＧ２Parameter遗传距离模型计算
得到的序列间的遗传距离见表２.青天葵的种内遗
传距离为０;在种间,与毛叶芋兰的遗传距离最小
(０．０１６),与车前草的遗传距离最大(０．３７５).
２．４聚类分析
从NJ树上可以看出,所有样品聚成两大支,青
天葵的７个样品先单独聚成一支,再与同属的毛叶
芋兰形成一大支,其它混伪品聚成另外一支.聚类
树直观地将青天葵及其常见混伪品鉴别开来,而且
展开支持率在９８％以上,结果可靠.
３　讨论与结论
DNA条形码是指利用一段短的DNA标准序
列实现快速、准确的物种鉴别 (Hebertetal．,
２００５),其常用片段主要位于叶绿体 DNA(chloroＧ
plastDNA,cpDNA)和核糖体 DNA 转录间隔区
(nuclearribosomalDNAinternaltranscribedspace,
nrITS).matK 是叶绿体基因蛋白编码区中进化最
快的基因之一,编码成熟酶(maturase)K,其进化速
率为rbcL 的２~３倍,具有丰富的碱基替换、非同义
１０３３期　　　　　　 　　　黄琼林等:应用matK 基因鉴别青天葵及其常见混伪品
图２　青天葵及其常见混伪品matK 基因序列比对
Fig．２　ComparisonofmatKgenesequencebetweenNerviliafordiianditscommonadulterants
突变和插删,可用于科内、属内物种鉴别(Gadeket
al．,２０００;Hiluetal．,２００３;徐凤霞等,２００３).在本
研究中,以青天葵及其混伪品的不同个体或不同居
群植株为样品,用一对通用引物扩增matK 基因并
双向测序,确保序列的可靠性和代表性.通用引物
的扩增效率和测序成功率高,序列易于比对,获得的
２０３ 广　西　植　物　　　 　　　　　　　　　　　　　　３４卷
图３　基于matK 基因的青天葵及其常见混伪品NJ聚类树
Fig．３　PhylogenetictreeconstructedbasedonmatKgene
fromNerviliafordianditscommonadulterants
序列聚类效果良好.本研究表明,青天葵与同属毛
叶芋兰亲缘关系最近,红薯叶次之,积雪草和车前草
则最远,与杜勤等(２００９)的研究结论一致.matK
在青天葵及其混伪品间遗传距离远远大于青天葵的
种内遗传距离,提示matK 基因具有足够的变异来
区别青天葵及其混伪品.
青天葵在民间用药时,根据叶片大小被分为３
种类型.３种叶型的产区也有所不同,广东北部和
东部以及广西桂林地区产者多为小叶或中叶,广西
南宁、百色及海南产者多为大叶(王振华等,２００７).
杜勤等(２００５)认为大叶青天葵是高产品种,而小叶
青天葵是繁殖新块茎能力最强的品种.在本研究
中,没有在matK 基因序列找到３种叶型青天葵的
鉴别依据,说明它们的matK 基因依然保持高度的
同源性,可能是叶片形态差异仅是因生长环境因素
的影响,并非基因组DNA变异而造成的;此外也可
能在于３个叶型分化时间并不长久.作者的研究也
未能在叶绿体rbcL 基因序列找到区别３种叶型青
天葵的碱基差异位点(黄琼林等,２０１２).青天葵的
分型问题仍需进一步探讨.
本研究建立起青天葵及其混伪品基于matK 基
因序列的鉴别体系,为青天葵的真伪鉴别和用药安
全提供了科学依据.
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