全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 31(6)：836—843 2011年 l1月
DOI：10．3969／j．issn．1000—3142．2011．06．024
文心兰 NaN3离体化学诱变及 RAPD检测
． 崔广荣，张子学，张从宇，胡能兵，隋益虎，李杰勤
(安徽科技学院 植物科学学院，安徽 凤阳 233100)
摘 要：采用 3种浓度的NaNa分别对离体培养的文心兰类原球茎薄切片进行不同时间诱变处理，考察了不
同浓度、不同时间诱变处理对类原球茎薄切片生长、类原球茎再生及再生苗生长的影响，并对再生苗 DNA进
行了RAPD检测。结果表明：诱变剂对类原球茎薄切片生长产生严重影响，部分薄切片褐化死亡，再生类原
球茎生长受到抑制，再生苗数量减少，表现出明显的伤害作用，这种伤害作用随诱变剂浓度的加大和处理时间
的延长而加重；NaN3抑制再生苗生长，试管苗普遍矮小。1o条 RAPD引物 PCR检测表明，再生苗DNA发生
了一定的变异，表现在 RAPD图谱带型的多态性，随着诱变剂浓度的加大和处理时间延长，多态性比例增高。
NaNa适宜诱变浓度为 6 mmol／L，适宜处理时间为 2～4 d。
关键词：文心兰；叠氮化钠；离体培养；化学诱变；RAPD
中图分类号 ：$682．31；Q813．1 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2011)06—0836—08
Study on NaN3 chemical induction for Oncidium
in in vitro culture and RAPD screening
CUI Guang-Rong，ZHANG Zi—Xue，ZHANG Cong-Yu，
HU Neng-Bing，SUI Yi—Hu，LI Jie-Qin
(Plant Science school of Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，China)
Abstract：Three kinds of concentrations of NaN3 were used as mutagens for chemical induction with thin cel layers
(TCLs)of Oncidium protocorm-like bodies(PLBs)in different time．The effects of different concentration and time
treatments on the growth of TCLs，PLBs and plantlets which regenerated from the TCLs were investigated．Mean—
while，the DNA of the plantlets were tested by RAPD reaction．The results showed that mutagen NaNa had great
effects on TCLs growt h．Some TCLs got browning and died，the PLBs grew slowly and the number of regenerated
plantlets were reduced．There were obvious injured effects on the explants，PLBs and plantlets regenerated from the
TCLs．The injured effects got more and more serious with higher concentration of mutagen and longer time treat—
ment．The mutagen NaN3 inhibited plantlets growing．RAPD reaction indicated that the molecule maps had some
polymorphisms which mean the sequence of DNA had changed．The ratio of polymorphisms got higher with higher
concentration of mutagen and longer time treatment．The concentrations of 6 mmol／L NaN3 treatment for 2—4 days
are suitable dosage for Oncdium chemical induction in vitro．
Key words：Oncdium；NaN3；in vitro culture；chemical induction；RAPD ’
传统的杂交育种由于受种质资源和地域的限
制，致使很多研究工作者难以在兰花育种上获得更
大的突破，诱变育种技术的发展给人们带来了希望
(Ahloowalia等，2001，2004)。化学诱变主要通过
化学诱变剂造成生物 DNA的损伤和错误修复而产
生突变体，这些突变往往以点突变为主，并且因诱变
收稿日期：2011—02—17 修 回日期：2011 09—21
基金项目：安徽省自然科学基金(O7O411o1o)[supported by the Natural Science Foundation of Anhui Provincel(。7O4l1O1。)
作者简介：崔广荣(1964一)，男，安徽长丰人，博士，教授，主要从事植物生物技术的研究和教学工作，(E-mai1)cuigr64@ i“ ·com o
6期 崔广荣等：文心兰 NaN。离体化学诱变及 RAPD检测 837
剂不同具有较高突变频率和较为稳定的突变谱(夏
英武，1997；Stefano，2001)。将植物组织培养技术
与化学诱变技术结合起来，具有不受环境条件限制、
节省人工和时间、扩大变异谱和提高变异率等优点
(刘进平等，2004)。叠氮化钠(NaN。)是植物化学诱
变育种中常用的诱变剂，其在细胞内以碱基替换方
式影响 DNA的正常合成，从而导致点突变的产生
(夏英武，1997)。NaN。作为诱变剂在植物诱变育
种上已经获得了广泛应用(安学丽等，2003；彭波等，
2007；徐小万等，2009)。RAPD(random amplified
polymorphic DNA)分析技术是一种检测核苷酸序
列多态性 的方法 ，该方法 以 PCR(polymerase chain
reaction)为基础，无需预先了解 DNA序列的信息
(Wiliams等，1990)，是突变体检测和筛选的常用方
法(李莉等，2004；冯霞等，2006；温亮等，2009)。
有关文心兰的 NaN。的离体化学诱变研究尚未
见报道。本研究以文心兰类原球茎薄切片离体培养
高效再生植株技术体系为基础(崔广荣等，2009)，探
讨 NaN。诱变剂对文心兰的诱变效应，并对诱变处
理再生苗 DNA进行初步的 RAPD分子检测，为文
心兰离体化学诱变育种奠定技术基础。
1 材料与方法
1．1外植体与培养基
外植体：由茎尖诱导的文心兰成熟类原球茎。
培养基：薄切片再生类原球茎培养基为 1／2MS+6一
BA4．0 mg／L+Ad2．0 mg／L+NAA1．0 mg／L+椰
汁 100 mL／L+蔗糖 20 g／L+琼脂粉 4．5 g／L；试管
苗分化培养基为 MS+6-BA2．0 mg／L+NAA0．5
mg／L+蔗糖 20 g／L+琼脂粉 4．5 g／L；试管苗生根
培养基为 1／2Ms+IBA0．5 mg／L+蔗糖 2O g／L+
琼脂粉4．5 g／L。各培养基灭菌前用 1．0 mol／L的
KOH溶液调节为 pH5．5。
1．2试剂
诱变剂：叠氮化钠(NaN。)由中国化学药品公司
生产，化学纯。RAPD引物：10 bp随机引物由南京
农业大学侯喜林教授研究室提供，由上海英俊生物
工程公司合成。PCR反应试剂：Taq酶(5 ／ L)、
MgC12、dNTP(10 mM)、10×bufer等购于TaKaRa
公司。其它化学试剂：主要由中国化学药品公司生
产 ，均为分析纯 。
1．3方 法
1．3．1外植体处理和接种培养 选取直径约 3～4
mm的文心兰类原球茎，在超净工作台上切成厚约
1 mm的薄切片，每瓶接种 7块薄切片，置于培养架
上光照培养。培养室温度为 25±2℃，光照强度约
为 1 500 lx。
1．3．2诱变剂配制 叠氮化钠用蒸馏水配制成 3种
浓度 3．0、6．0、12．0 mmol／L，121℃(灭菌压力 0．12
MPa)湿热灭菌 2O min冷却备用。
1．3．3诱变处理 当类原球茎薄切片表面出现点状
突起，新类原球茎开始形成时(接种后8 d)在净化工
作台上对每块组织滴加诱变剂，并确保诱变剂浸润
组织块。3种浓度的叠氮化钠各自设置 3个处理时
间，即 1、2、4 d，并设 1无菌水处理为对照，共 1O个
处理，每处理 10瓶，每瓶接种 7个类原球茎薄切片。
处理完毕后，用无菌水漂洗 3次后，于无菌吸水纸上
吸干水分后，接种于新的诱导培养基上继续培养，3O
d后，将新形成的类原球茎接种到分化苗培养基上
成苗，而后进行生根培养。观察统计诱变剂对新类
原球茎的形成、苗再生的影响。各处理随机取 1O棵
再生苗测量株高，取平均值。
1．3．4 DNA提取与电泳检测 当试管苗根长至 2
cm左右时，采用改 良 SDS法，剪下叶片，提取总
DNA。随机选取 3O棵苗(处理 N一9除外，仅获得26
棵苗)，称取叶片 0．2 g，在冰浴条件下进行研磨提
取。具体步骤为：(1)叶片 0．2 g+研磨缓冲液 0．8
mL，研磨成匀浆；(2)加入等体积的氯仿一异戊醇，充
分摇匀；(3)6 000 rpm离心 5 min；(4)取上清夜于
另一离心管 72℃保温 3～4 min，取出于冰浴迅速
冷却；(5)加入 1／4体积 5 mol／L高氯酸钠溶液，摇
匀后加入等体积氯仿一异戊醇，充分摇匀后 6 000
rpm离心 5 rain；(6)取上清液，加入 2倍体积预冷
95 乙醇，轻摇后静置 10 rain，DNA絮状析出；(7)
用牙签挑出DNA于另一离心管，加入 100 L 1×
TE溶液，让 DNA充分溶解。重复(5)、(6)、(7)步
骤，DNA最后溶解于 100 L 1×TE备用。取上述
提取的 DNA溶液 2 L于 0．8 琼脂糖凝胶上
100V恒压电泳，并用标准浓度分子量标记，检测
DNA的纯度及浓度，根据检测结果将样品DNA浓
度调节约为 25 ng／ L。
1．3．5 RAPD反应体系及引物筛选 RAPD反应体
系设置为：以对照苗 DNA对 100条引物进行筛选，
选择适合文心兰基因组 RAPD扩增的引物，琼脂糖
838 广 西 植 物 31卷
凝胶浓度为 1．2 ，10OV恒压电泳(表 1)。
表 1 RAPD反应体系
Table 1 The reaction system of RAPD
94 C 3 min
94℃ 1 min 、
．
36℃ 1．5 min 38循环
72℃1．5 min J
72 ℃ 5 min
4℃ 保存
0．2 uL
2．0 “L
2．4 uL
1．0 uL
1．0 uL
1．0 “L
12．4 “L
表 2 选用引物名称及序列
Table 2 Selected primers and their sequence
1．2．6诱变植株基因组RAPD筛选及分析 选择条
带清晰、干扰带少的 10条引物对诱变处理苗 DNA
进行多态性检测，每处理检测 30株(处理 N一9再生
苗仅 26棵，以 26棵为准)，琼脂糖凝胶浓度为
1．2％，100V恒压电泳。统计每处理中各单株扩增
总条带数、多态性带数，并进行植株变异性分析。1O
条引物序列见表 2。
2 结果与分析
2．1 NaN 对类原球茎薄切片(TCLs)生长、PLBs形
成和再生苗生长的影响
表 3显示 ，NaN。处 理对文心兰类原球茎薄切
片(TCLs)伤害较为严重，导致部分 TCLs褐化死亡
(图 1：B)，随着 NaN。浓度的增加和处理时间的延
长，这种伤害的程度逐渐加重，与对照处理 TCLs
(图 1：A)生长状态差异巨大。其中处理 N一9中文
心兰 TCLs的死亡率可达 85．7 ，处理 N一3和 N一5
的死亡率分别为 55．7 和 58．6 ，除去自然死亡率
后，这 2个处理基本达到“半致死量”效应(Stefano，
2001；董颖萍等，2005)，也即在 NaN。浓度为 12
mmot／L、处理 1 d或 6 mmol／L、处理 2 d时，均可
致外植体类原球茎 TCLs半数死亡。
表 3 NaN3对类原球茎薄切片生长及再生苗的影响
Table 3 Effects of NaN3 on the growth of TCLs and shoot formation
处理编号 诱变时间 叠氮化钠浓度 接种切片块数 类原球茎切片死亡率 再生苗株高 再生苗总数
No．of Time of Concentrations of Number of The death rate Height of Number of
treatment induction(d) NaNs(mmol／L) innoculated TCLs of TCLs( ) shoots(cm) regeneration shoots
15．7 g
34．3 f
55．7 de
31．4 f
58．6 d
81．4 b
52．9 e
7O．0 C
85．7 a
7．1 h
2．6土0．6
2．7±0．7
2．5±0．7
2．5±0．6
2．4±0．8
2．3士0．5
2．3±0．5
2．2士0．6
2．3土0．7
3．7土 0．9
注：苗高小于 1．0cm不计人再生苗总数 ；a、b⋯e d e、f、g、h表示在 5 水平上差异显著。
Note：The height of shoot less than l_0 em didn’t calculate in number of regenerated shoots；a，b，c，d，e，f，g，h represent significant differ
ence at 5 leve1．
在去除诱变剂 NaN。后，这种伤害作用依然存
在，具体表现在对新生类原球茎继代增殖培养的生
长状态上，新生类原球茎生长速度相对缓慢，部分类
原球茎依然会死亡(图 1：D)，有可能是漂洗后还有
少量诱变剂残留或诱变效应延续 的缘故。经过
NaN。处理后，各处理中再生苗数量和生长状态也
受到了较大影响，苗再生数少且再生苗普遍表现为
矮小，与对照苗高差异明显，但各NaNa诱变处理间
的苗高度差异却不明显(图 1：E)，其具体原因尚不
清楚。除了NaN。诱变处理导致再生植株矮小外，
未发现其它形态变异植株。
2．2 NaN 不同处理样品 DNA RAPD检测及分析
2．2．1 NaN 不同处理样品 DNA RAPD检测及分析
(1)3 mmol／L NaN。不同时间处理植株 RAPD检
测结果(表 4)。表4归纳了1O条 RAPD随机引物对
3 mmol／L NaN 诱变后再生植株扩增的结果，表明
，蓦栅 一～一～一一
1 2 3 4 5 6 7 8 9 (

AU19
AQ2O
AK12
AM 2O
AQ11
AEl8
AK16
AI19
AQ15
20．0
33．3
33．3
30．0
26．7
16．7
30．0
20．0
30．0
20．0
36．7
46．7
43．3
30．0
30．0
26．7
23．3
60．0 14
30．0
30．0
53．3
40．0
53．3
23．3
63．3
36．7
46．7
图 2 引物 AQ20对处理 1 d再生植株扩增 RAPD图谱
Fig·2 Primer AQ20 amplification profile for plantlets treated with 3 mmol／I NaN3 for 1 day
表 5 6 mmol／L NaN3不同时间处理再生植株随机引物扩增多态性
Table 5 Random primers amplified polymorphism for plantlets regenerated
from treatments with 6 mmol／L NaN3 in different time
体间具有较多的相同或相似的多态性，表明 NaN。
作用于 DNA序列具有一定的专一性。
(3)12 mmol／I NaN 不 同时间处 理植株
RAPD检测结果 (表 6)。表 6统计结果显示，12
mmol／I 的 NaN。对文心兰基 因组 DNA 的诱变作
用更加明显，各引物扩增的RAPD带谱的多态性比
例、类型均不同程度增加。如图4所示，浓度为 l2
mmol／L NaN。处理再生苗 DNA的多态性 比例更
0 U
6 u M 9 9 8 7
6 “ K 9 8 5 9 6 9
6期 崔广荣等：文心兰 NaN。离体化学诱变及 RAPD检测 841
图 3 引物 AQll对处理 4 d再生植株 PCR扩增 RAPD图谱
Fig．3 Primer AQ1 1 amplification profile for plantlets treated with 6mmol／L NaNa for 4 day
表 6 12 mmol／L NaN3不同时间处理再生植株随机引物扩增多态性
Table 6 Random primers amplified polymorphism for plantlets regenerated
from treatments with 1 2 mmol／L NaN3 in different time
图 4 引物 AQ2O对处理 1 d再生苗 PCR扩增 RAPD图谱
Fig．4 Primer AQ20 amplification profile for plantlets treated with 1 2 mmol／L NaN3 for 1 day
高，类型也更加丰富，但不同引物的表现也不尽相同。
3 结论与讨论
利用不同浓度的NaN。诱变剂对文心兰类原球
茎薄切片进行诱变处理，均能产生较为理想的诱变
效应，6 mmol／L NaN3处理 2 d和 12 mmol／L
NaN。处理 l d能使外植体达到“半致死率”。NaN。
对外植体及其再生类原球茎、试管苗的生长影响较
大，外植体褐化死亡率高，试管苗普遍矮小。RAPD
筛选结果表明，再生试管苗基因组 DNA不同程度
发生了变异，呈现出不同比例的带谱多态性，多态率
随处理时间的延长和诱变剂浓度的增大而提高，
RAPD带谱多态性主要表现为增加或减少某些带。
NaN。的适合剂量是 6 mmol／L浓度处理 2～4 d。
诱变材料的选择是园艺植物诱变育种成败的关
键之一(徐小万等，2009)，在离体化学诱变中，茎尖、
叶片、愈伤组织等均可作为诱变材料使用，但必须保
842 广 西 植 物 31卷
证诱变剂的有效渗入和诱变后的材料能进一步生
长、发育，最终产生新的个体(夏英武，1997；Stefa—
no，2001；刘进平等，2004；徐小万等，2009)。文心兰
和其他兰花一样，生长速度(包括离体培养的外植体
生长速度)相对缓慢，因此在化学诱变时选择合适的
外植体尤为重要。类原球茎薄切片再生类原球茎不
仅速度快，而且操作简单、方便，是进行文心兰离体
化学诱变的理想材料(崔广荣等，2OO9)，既有利于诱
变剂的渗入，又有利于诱变后再生植株，本试验的结
果更进一步证明了这点。其他一些研究者在进行兰
花诱变时常选择类原球茎作为外植体，虽然也取得
了较好的诱变效果(陈超等，2006)，但类原球茎本身
已经是较为成熟的个体，不仅不利于诱变剂的渗入，
而且获得的突变体中嵌合体的比例较高。利用类原
球茎薄切片快速再生新类原球茎过程进行诱变处
理，有可能减少嵌合体产生的比例。
提高诱变频率和减少外植体的损伤是化学诱变
处理中的一个矛盾，如何确定诱变剂浓度和处理时
间因材料不同而异。刘艳萌等(2008)用 EMS诱发
草莓耐盐性变异时认为，(0．1 +1．5 h)和(0．2
+1．0 h)处理浓度及时间适合于愈伤组织，而(0．
2 ～O．4 +1．0～2．0 h)的处理浓度和处理时问
则适合于叶片。安学丽等(2003)在考察 EMS对玉
米 自交系的诱变效应时认为 0．4 EMS处理玉米
种子 12 h可达“半致死量”。陈超等(2006)进行蝴
蝶兰类原球茎诱变时认为 0．4 的 EMS处理 6～8
h即可达半致死量。杨志国等(2009)]在进行西瓜
离体振荡培养诱变时认为 1．5 mmol／L NaN。处理
1．5h较为合适。本研究中，6 mmol／L NaN。处理 2
d和 12 mmol／LNaN。处理 1 d能使外植体达到“半
致死率”，其原因是正处于生长旺盛阶段的类原球茎
薄切片可能具有更强的抗损伤力，具体原因尚待进
一 步研究 。NaN。诱 变处理 ，植株普 遍表现矮化现
象，并伴有畸变植株的形成(安学丽等，2003；姜振峰
等，2006；)。本试验中 NaN。诱变文心兰试管苗矮
化效应明显。植株矮化效应与其诱变后生理效应存
在一定的关系(张景萍等，2004；付凤玲等，2005)。
RAPD技术是建立在 PCR基础之上的一种可
对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技
术，扩增产物的多态性反映了基因组多态性，因此该
技术已广泛用于突变体的鉴定分析(李莉等，2004；
王健等，2006；章宁等，2009；温亮等，2009；)、遗传多
样性研究等(明凤等，2003；谢伟等，2005，2006)，已
经成为一种十分成熟的分子标记技术 (梁 肖仍，
2010)。必须注意的是 ，RAPD多态性反映了基因组
DNA发生了序列上的变异，并不能直接说明植株性
状就一定发生了变异。本研究中部分引物扩增的
RAPD多态性比例较高，但最终真正鉴定出突变体
尚有许多工作要做，特别是苗在田间的各种性状表
现，尤其是能否获得花色、花型等变异性状还需进一
步研究 。
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