全 文 ：基金项目： 安徽省自然科学基金项目（No. 070411010）； 安徽省教育厅省级自然科学基金项目（No. KJ2007B053）资助。
第一作者简介： 崔广荣， 男， 1964 年生， 博士， 副教授， 主要从事观赏植物生物技术研究。 E-mail： cuigr64@sina.com。
收稿日期： 2010-01-19 修回日期： 2010-03-12
第 31 卷 第 4 期 热 带 作 物 学 报 Vol．31 No．4
2010 年 4 月 CHINESE JOURNAL OF TROPICAL CROPS Apr.2010
蝴蝶兰 NaN3离体化学诱变及
再生植株 RAPD检测
崔广荣， 张子学， 张从宇， 胡能兵， 隋益虎， 李杰勤
安徽科技学院植物科学学院， 安徽凤阳 233100
摘要 采用 NaN3对离体培养的蝴蝶兰类原球茎薄切片进行诱变处理， 研究不同浓度和不同处理时间对类原球茎
薄切片生长的影响， 并对再生苗 DNA 进行了 RAPD 检测。 结果表明， NaN3 对类原球茎薄切片生长产生重要影
响， 部分薄切片白化或褐化死亡， 再生类原球茎生长受到抑制， 再生苗数量减少， 部分再生苗畸变， 叶片皱缩、
变厚。 10 条 RAPD 引物的 PCR 检测发现， 再生苗 DNA 序列发生了一定程度的变异， 产生 RAPD 图谱带型多态
性。 根据以上结果认为， 本体系合适的 NaN3诱变剂量为 6 mmol/L， 处理 2 d。
关键词 蝴蝶兰； 叠氮化钠； 离体培养； 化学诱变； RAPD
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2010.04.016
中图分类号 S682.31
蝴蝶兰是洋兰中的典型代表， 因其花形、 株形独特而深受人们的喜爱， 被冠以 “兰花皇后” 之美誉。
传统的杂交育种由于受种质资源和地域的限制而难以获得更大的突破。 现代生物技术在育种中的应用给
创造蝴蝶兰新、 奇、 特种质带来了新的希望。 特别是诱变育种技术与植物组织培养技术的结合已经成为
园艺植物育种的一个重要发展方向[1-3]， 随着蝴蝶兰离体培养技术的不断发展， 人们已经开始在蝴蝶兰的
诱变新种质方面开始了尝试性研究工作[4-5]。 诱变育种技术主要包括物理诱变和化学诱变技术。 化学诱变
主要通过化学试剂造成生物 DNA 的损伤和错误修复而产生突变体， 这些突变往往以点突变为主， 并且因
诱变剂不同具有较高突变频率和较为稳定的突变谱[1，6]。 由于这一技术还具有易操作、 剂量易控制、 对基
因组损伤小、 突变率高等特点， 已经成为运用最为广泛的诱变技术 [7]。
叠氮化钠（NaN3）是植物化学诱变育种中常用的诱变剂， NaN3在细胞内以碱基替换方式影响 DNA 的正
常合成， 从而导致点突变的产生， 已经在植物诱变育种上进行了广泛的应用 [3，8-10]。 将植物组织培养技术与
化学诱变技术结合起来， 对遗传变异的诱发、 繁殖、 改良选择技术具有独特的优势和发展潜力[1-2，6-7]， 具
有不受环境条件限制、 节省大量人工和时间、 扩大变异谱和提高变异率等优点。 离体化学诱变获得成功
的前提条件是诱变剂的有效渗透和诱变植株的高效再生[2]。
RAPD（Random amplified polymorphic DNA）分析技术一种检测核苷酸序列多态性的方法， 该方法以
PCR（polymerase chain reaction）为基础， 无需预先了解 DNA 序列的信息[11]， 是突变体检测和筛选的常用方
法[12-15]， 在遗传种质资源亲缘关系分析等方面也得到了广泛应用[16-17]。
影响植物离体化学诱变效应的因素主要有外植体、 诱变剂的浓度、 处理方法及处理时间等。 有关蝴
蝶兰的 NaN3离体化学诱变研究仅见少量的简单报道， 尚属于初步研究阶段[4]。 本研究以蝴蝶兰类原球茎
薄切片离体培养高效再生植株技术体系为基础[18]， 探讨 NaN3不同浓度、 不同时间对蝴蝶兰的诱变效应，
并对诱变处理再生苗 DNA 进行 RAPD 分子检测， 初步建立蝴蝶兰 NaN3离体化学诱变技术体系， 为蝴蝶
兰离体化学诱变育种奠定前期基础。
4 期 崔广荣等： 蝴蝶兰 NaN3离体化学诱变及再生植株 RAPD 检测
1 材料与方法
1.1 材料
蝴蝶兰外植体由茎尖诱导发育的蝴蝶兰（Phalaenopsis Tsuei Foa Lady）成熟类原球茎（Protocorm-like
bodies， PLBs）。
RAPD引物 10 bp随机引物由南京农业大学侯喜林教授所在研究室提供， 由上海英俊生物工程公司合成。
1.2 试剂及培养基
诱变剂 叠氮化钠（NaN3）购自中国化学药品公司， 化学纯。 用蒸馏水配制后以 121℃湿热灭菌 20 min，
冷却备用。 Taq 酶（5 U/μL）、 MgCl2、 dNTP、 10×DNA buffer 等购于 TaKaRa 公司。 其他化学试剂均购自中
国化学药品公司， 分析纯。
培养基 类原球茎薄切片诱导新类原球茎培养基 ： 1/2MS+4.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L Ad+1.0 mg/L
NAA+100 mL/L椰汁+20 g/L蔗糖+4.0 g/L琼脂粉； 苗再生培养基： 1/2MS+2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+20 g/L
蔗糖+4.0 g/L 琼脂粉； 试管苗生根培养基： 1/2MS+0.5 mg/L IBA+20 g/L 蔗糖+4.0 g/L 琼脂粉。 各种培养基
高压灭菌前用 1.0 mol/L的 KOH溶液将 pH值调至 5.5。
1.3 方法
1.3.1 PLB 诱变处理 选取蝴蝶兰成熟且颗粒较大， 直径约 3~4 mm 的类原球茎， 在净化工作台上切成
厚约 1 mm 的薄切片， 接种培养方法、 培养条件等参照崔广荣方法进行[18]。 当类原球茎薄切片表面出现点
状突起， 即新类原球茎开始形成时（接种后8 d）在净化工作台上对每块组织滴加诱变剂， 并确保诱变剂浸
润组织块。 叠氮化钠浓度为 3、 6、 12 mmol/L， 分别处理 1、 2、 4 d， 并设无菌水处理为对照， 共 10 个处
理。 处理完后， 用无菌水漂洗 3 次， 洗去粘连培养基及残留叠氮化钠， 以无菌吸水纸吸干水分， 接种于
新的诱导培养基上继续培养。 30 d 后， 将新形成的类原球茎接种到芽分化培养基上， 45 d 统计苗再生数
（以形成 2片叶为准）， 并进行生根培养。
1.3.2 总 DNA提取及电泳检测 总 DNA提取 当试管苗根长至 2 cm左右时， 随机选取 30棵苗（处理 N-9
除外， 仅获得 16棵苗）剪取叶片采用改良 SDS法提取总 DNA。 具体步骤为： ①取上述叶片 0.2 g ， 加入提
取缓冲液 0.8 mL， 冰浴条件下研磨成匀浆； ②加入等体积的氯仿-异戊醇， 充分摇匀 6 000 r/min 离心
5 min； ③取上清液至另一离心管， 72℃保温 3~4 min， 冰浴冷却； ④加入 1/4 体积 5 mol/L 高氯酸钠溶液，
摇匀后加入等体积氯仿-异戊醇， 充分摇匀 6 000 r/min离心 5 min； ⑤取上清液， 加入 2倍体积预冷的95％
乙醇， 轻摇后静置 10 min， DNA絮状析出； ⑥用牙签挑出 DNA至另一离心管， 加入 100 μL 1×TE溶液， 充
分溶解 DNA。 重复步骤④～⑥， DNA最后溶解于 100 μL 1×TE溶液 4℃保存备用或-20℃长期保存。
电泳检测 取 2 μL DNA 样品于 0.8％琼脂糖凝胶上 100 V 恒压电泳， 并用标准浓度分子量标记， 检
测 DNA的纯度及浓度， 根据检测结果将样品 DNA浓度调节为 25 ng/μL左右
1.3.3 RAPD 反应体系的优化及引物筛选 以对照苗提取的 DNA 对 100 条引物进行筛选， 选择适合蝴
蝶兰基因组 RAPD扩增的引物， RAPD反应体系为： Taq酶（5U/μL）0.3 μL， 10×DNA buffer 2 μL， 25 mmol/L
MgCl2 2.4 μL， 10 mmol/L dNTP 1 μL， DNA 模板 1 μL， 引物 1 μL， 双蒸水补至 20 μL。 RAPD 的反应程
序为： 94℃预变性 3 min， 94℃变性 1 min， 36℃退火 1.5 min， 72℃延伸 1.5 min， 共 42次循环后， 72℃延
伸 5 min， 4℃保存。 1.2％琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物。
1.3.4 诱变植株基因组 RAPD 筛选及分析 选择条
带清晰、 干扰带少的 10 条引物对诱变处理苗 DNA 进
行多态性检测， 各处理检测 30株（除 N-6、 N-9的再生
苗不足 30株外）， 琼脂糖凝胶浓度为 1.2％， 100 V恒压
电泳。 统计每处理中各单株扩增总条带数、 多态性带
数， 并进行植株变异性分析。 10条引物序列如表 1。
593
热 带 作 物 学 报 31 卷
2 结果与分析
2.1 NaN3对类原球茎 TCLs生长、 PLBs形成和再生苗生长的影响
NaN3对蝴蝶兰类原球茎薄切片的伤害作用非常明显， 如图 1 中的 A、 B、 C 所示。 在高浓度、 较长时
间 NaN3处理下， 类原球茎薄切片在继代培养 3 d 左右白化或褐化死亡， 少数成活的类原球茎薄切片生长
也相当缓慢， 需要较长时间的恢复生长。 此伤害作用随 NaN3浓度增大和处理时间的延长而加重， 死亡率
逐渐上升， 各处理死亡率见表 2。 当 NaN3浓度为 12 mmol/L、 处理时间为 4 d 时， 其死亡率达 90％； 浓度
为 3 mmol/L、 处理 2 d即可达 “半致死量”。 继代恢复生长的新生类原球茎的再生苗生长也受到较大影响，
苗相对矮小， 生长缓慢， 部分苗叶片畸形（图 1 中的 D、 E、 F、 H）， 叶片表面呈皱缩状， 叶片相对厚实，
不舒展， 与叶片表面光滑、 舒展的对照苗（图 1， G） 差异明显。 随着 NaN3浓度增加和处理时间延长， 各
处理的再生苗总数减少， 叶片畸变率上升。
2.2 NaN3不同处理再生苗 DNA RAPD 检测及分析
2.2.1 3 mmol/L NaN3不同时间处理植株 RAPD检测结果 在 3 mmol/L 的 NaN3处理中， RAPD 多态性较
低， 处理 1 d的再生植株中， 10条随机引物均未能检测到 RAPD多态性。 处理 2 d 中的材料中， 有 7 条随
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A B C D
E F HG
A. 3 mmol/L NaN3处理 2 d 的类原球茎薄切片； B. 6 mmol/L NaN3处理 2 d 的类原球茎薄切片； C. 12 mmol/L NaN3处理 2 d 的类原
球茎薄切片； D. 3 mmol/L NaN3处理 2 d 的再生苗； E. 6 mmol/L NaN3处理 2 d 的再生苗； F. 3 mmol/L NaN3处理 2 d 的再生苗；
G. 对照苗； H. NaN3处理后产生的畸变苗。
图 1 NaN3处理后蝴蝶兰类原球茎薄切片生长状况及苗再生
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4 期 崔广荣等： 蝴蝶兰 NaN3离体化学诱变及再生植株 RAPD 检测
机引物筛选出 RAPD多态性， 处理 4 d的材料中， 有 9条随机引物筛选出多态性， 总体上 RAPD多态性均偏
低， 且无规律可寻 （表 3）， RAPD多态性主要表现为部分带的减少或增加 （图 2， A、 B）。 只有延长 NaN3
处理时间， 才有利于诱变剂对 DNA分子的作用而发生 DNA变异， 才有利于形成突变植株。
2.2.2 6 mmol/L NaN3不同时间处理植株 RAPD 检测结果 6 mmol/L NaN3处理对再生植株基因组 DNA
RAPD的多态性较 3 mmol/L的高（表 4）， 表明较高浓度 NaN3处理对再生植株 DNA的诱变作用较强。 RAPD
多态性主要表现为部分带的减少或增加， 也有带型完全不同的类型（图 3， B）。 总体上随着处理时间的延
长， RAPD多态性比例增加， 但不同引物表现不同。
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112 13 14 15 16 17 18 19 20 CK M
100
300
500
700
1 000
1 500
2 000A
B
图 2 部分引物对3mmol/LNaN3处理再生植株PCR扩增的RAPD图谱
bp
1~20 为处理样品； CK 为对照； M 为分子量标记。 A. AN13 为处理 2 d 再生植株扩增 RAPD 图谱；
B. AX19 为处理 4 d 再生苗扩增 RAPD图谱。
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表 3 3 mmol/L NaN3不同时间处理再生植株随机引物扩增多态性
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 CK M
A
B
C
1~16 为处理样品； CK 为对照； M 为分子量标记； 同图版 2。 A. AU20 为处理 1 d 再生植株扩增 RAPD 图谱；
B. AE15 为处理 2 d 再生苗扩增 RAPD 图谱； C. AX19 为处理 4 d 再生苗扩增 RAPD 图谱。
图 4 部分引物对 12 mmol/L NaN3处理再生植株 PCR 扩增的 RAPD 图谱
2.2.3 12 mmol/L NaN3 不同时间处理植株 RAPD 检测结果 由表 5 可见， NaN3 处理浓度为 12 mmol/L
时， 各引物扩增 RAPD 多态性比率并未因浓度的增大而提高， 总的趋势表现为因处理时间的延长多态率
上升， 但不同引物之间 RAPD 多态性存在较大差异。 部分引物扩增 RAPD 图谱见图 4。
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A
B
C
图3 部分引物对6mmol/L叠氮化钠处理再生植株PCR扩增的RAPD图谱
1~20 为处理样品； CK 为对照； M 为分子量标记。 同图版 2。 A. AA19 处理 1 d 再生植株扩增 RAPD 图谱； B. AE15 处理
2 d 再生苗扩增 RAPD 图谱； C. AV10 处理 4 d 再生苗扩增 RAPD 图谱。
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4 期 崔广荣等： 蝴蝶兰 NaN3离体化学诱变及再生植株 RAPD 检测
从 3 种浓度不同时间各处理 RAPD 多态性表现看， 总体上随着 NaN3浓度的增加和处理时间的延长，
NaN3对蝴蝶兰基因组 DNA的作用效应增加， 但当 NaN3浓度为 6 mmol/L、 处理时间达 2 d 时， RAPD 总多
态率并不随 NaN3 浓度增大或处理时间的延长而有明显提高， 因此， 在此试验条件下， 应用 6 mmol/L
NaN3处理 2 d 较为合适， 继续提高 NaN3浓度或延长处理时间只能对再生植株产生更多的伤害， 而对蝴蝶
兰基因组 DNA 的诱变效应不能提高。 值得注意的是， 不同处理间， 不同引物扩增的多态性表现差异较
大， 部分引物扩增的 RAPD 多态性随浓度增大和处理时间延长， 多态性比例增加， 而部分引物扩增的
RAPD 多态性随浓度增大和处理时间延长反而下降， 表现出较强的随机性。 这一结果也说明 NaN3对蝴蝶
兰基因组 DNA 诱变效应的随机性。 另外， RAPD 多态性与植株表现出的形态畸变之间也不存在一一对应
关系， 表明植株形态畸变主要是因诱变剂的伤害作用而造成的， 而不是基因组 DNA变异造成的。
3 结论与讨论
利用 NaN3化学诱变蝴蝶兰类原球茎薄切片再生新类原球茎的方法是可行的。 诱变剂对类原球茎薄切
片、 再生苗均产生一定程度的伤害作用， 随着诱变剂浓度增加和处理时间延长， 伤害作用加重， 表现为
类原球茎白化或褐化死亡， 3 mmol/L的 NaN3处理 2 d时可达 “半致死量”， 再生苗数量减少， 形态出现不
同比例的畸变。 再生植株的 RAPD 检测表明， 这些畸变未必是植株 DNA 分子变异造成的， 主要是因为诱
变剂的延续伤害所造成。 诱变剂在低浓度、 短时间处理时， 均不能使再生植株 DNA 分子发生变异， 10 条
随机引物未能检测出 RAPD多态性， NaN3处理的适合剂量为 6 mmol/L浓度处理 2 d。
诱变与植物组织培养结合需要确定合适的诱变剂、 选用合适的诱变材料、 诱变剂的有效性和培养材
料对诱变剂的敏感程度和特异性， 根据这些设计出有效的体外选择方案， 才能够取得高的突变体选择效
率[1-2]。 在植物离体化学诱变研究中， 多数研究者都是在外植体没有经过恢复生长时， 立即进行诱变处理，
导致诱变剂对外植体的伤害作用更加严重 [4，8-9，19-20]， 也是很多研究者得出诱变剂量偏小的缘故。 本试验中，
类原球茎薄切片已经开始形成点状突起， 即新的类原球茎开始形成， 处于生长旺盛时期[18]， 这样的外植体
对诱变剂可能具有较强的耐受性。 预试验中， 笔者曾在类原球茎薄切片培养开始时进行诱变剂处理， 结
果是所有的外植体几乎全部死亡， 可见选择合适的处理时期非常重要。
在确定化学诱变剂的浓度和处理时间时， 通常以半致死剂量条件作为最适条件[6，19-21]， 但半致死剂量
条件未必是最适诱变条件[2]， 本试验进一步证明了这一观点。 NaN3的半致死剂量为 3 mmol/L、 处理 2 d， 但
是 RAPD 检测结果证明此剂量条件下， RAPD 多态率即基因组 DNA 变异率依然较低， 显然这一剂量并
不是最适剂量。 在植物离体化学诱变中， 人们更倾向于低剂量、 长时间的温和处理， 更有利于获得突
变体[1]。
NaN3诱变处理的植株普遍表现矮化现象， 并伴有畸变植株的形成[8-9，22]， 还伴有细胞组织学方面的变
化等[4]。 本试验中 NaN3诱变处理， 导致蝴蝶兰再生苗形态畸变， 但这些畸变未必是基因组 DNA 的变异造
成的， 更多的是诱变剂后续的伤害作用。 植株矮化效应与其诱变后生理效应存在一定的关系[19，21，23]， 本试
验有关试管苗及其移栽后苗生理生化特性等问题有待于进一步研究。
RAPD 技术是建立在 PCR 基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术，
扩增产物的多态性反映了基因组多态性 [11]， 因此该技术已广泛用于突变体的鉴定分析 [12-15，24]、 遗传多样性
研究等[16-17，25，27]， 已经成为一种十分成熟的分子标记技术。 必须注意的是， RAPD多态性反映了基因组 DNA
发生了序列上的变异， 并不能直接说明植株性状就一定发生了变异。 本研究中部分引物扩增的 RAPD 多
态性比例较低， 可能与所用引物的数量不多或在选择上存在一定的局限性有关， 尚需进一步用更多的引
物进行筛选， 以确定今后蝴蝶兰诱变育种中更合适的突变体筛选引物。 除可见的形态变异植株外， 最终
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热 带 作 物 学 报 31 卷
真正鉴定出突变体尚有许多工作要做， 特别是苗在田间的各种性状表现， 尤其是能否获得花色、 花型等
变异性状还需进一步研究。 植物化学诱变育种技术方兴未艾， 随着现代生物技术的发展及其在植物育种
中的不断应用[28-29]， 其在植物遗传育种研究中必将发挥越来越重要的作用。
参 考 文 献
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In vitro Mutation Induction by NaN3 in Phalaenopsis
and RAPD Detection for the Regenerated Plants
Cui Guangrong, Zhang Zixue, Zhang Congyu, Hu Nengbing, Sui Yihu, Li Jieqin
Plant Science School of Anhui Science and Technology University , Fengyang 233100, Anhui China
Abstract The thin sections (TCLs) of Phalaenopsis protocorm-like bodies (PLB) were used as explants for
in vitro mutation induction by NaN3. The effects of different concentration and time of treatment on the
growth of TCLs were investigated and the DNA of the regenerated plants was detected with RAPD. The
results showed that NaN3 had great effects on TCL growth. Some TCL after treatment got white or browning
and died and grew slowly, and the number of regenerated plantlets was reduced, and the regenerated
plantlets became abnormal with leaves crimpled and thicker. The RAPD reaction with 10 primers indicated
that the molecule maps of RAPD had some polymorphisms which meant the sequence of DNA was
changed. The concentration of 6 mmol/L NaN3 treatment for 2 days was a suitable dosage for Phalaenopsis
mutation induction in this test system.
Key words Phalaenopsis; NaN3; In vitro culture; Chemical induction; RAPD
责任编辑： 高 静
崔广荣等： 蝴蝶兰 NaN3离体化学诱变及再生植株 RAPD 检测 599