全 文 ：r 西 植 物 Guihala 19 (3)：239—242 999年 8月
文章编号 1004 142(1999)03-0239-04
枸杞髓组织离体培养及高频率植株再生的研究
， 陈 放’， _曲 琳 7，
f1 川大学生物亲， 川成都 610064：2 宁夏戒科院农业生物技术研究室，宁夏银川 750002)
摘 要：枸杞髓组织在 4种 MS培养基上都能诱导出愈伤组织，诱导率 53．7％～100％。在培养基
MS+6一BA 0．1 mg／L+NAA 0．5 mg／L获得的愈 伤组织 ，呈颗粒状，分散性能好，胚性细胞
多。将其转 移到 MS+6-BA 0．5 mg／L+NAA 0．叭 mg／L的分化培养基 上获得大量绿色小芽，
小芽在 MS+6-BA0．2mg／L的培养基上得到快速繁殖．繁殖系数 50～150株／芽·月。丛生芽在
MS+NAA 0．2mg／L的培养基上形成完整植株。
关睦词：枸杞；髓组织；离体培养；植株再生
_ - — ⋯ —-—— —-_·—一
中圉分类导 Q943．1 文献标识码：A
In vitro culture of pith tissue and high——frequency plant
regeneration of cium barbarum L．
CAO You-long ， CHEN Fang ． LUO Qing2， QU Li
(1．Deparfment Biology．Siehuanu㈣ ．Cherlgdu 610064．China；
L LaboratorFofBiot~tmotogy．NingxiaAcademyof由 rieulmralSciences．Yinchuan 750002，China)
Abstract： A study OO pith tissue culture on M S medium with diferent hormone．the induction rate
was 53．7％ ～ 100％ ．Amongwhichthe calliinduced onmedium M S+6—BA 0．1 mg／L + NAA 0．5
mg／L werc smalestin particle sizeand had gooddispersion abi][tywith alargequantityofembry-
onic ce1]s．The calli were moved onto M S+6一BA 0．5 rag／L+NAA 0．01mg／L diferentiation me·
dium and a large quantity of embryonic plants were obtained．The embryonic plants wcle repro·
duced rupidly after they were removed onto medium Ms+6—BA 0。2mg／L with the reproduction
rateof50～ 150dl】sters shoot／bud·month．Complete plants inducedonM S+NAA 0．2mg／L
medium。
Keywords： Lycium barbarum L_：pithtissue culture； vitroculture；plant regeneration
枸杞 (上 crambarbarumL。)是重要的药用植物，多年来，国内外科技工作者十分重视椅杞的组
织培养，已有用叶片、花药、下胚轴，茎端及幼嫩子房为材料进行组织培养分化出植株的 ‘， ’，我
们在此基础上， 以枸杞髓组织为试验材料进行组织培养，获得 了再生植株，为椅杞细胞突变体的筛
选．细胞悬浮培养、原生质分离，细胞杂交、基因转移的研究提供依据．
1lt 日期：1998-08_09
作者摘开 曹有龙 (1963一)，男，博士研究生，植物学专业．
基盒项目：国家九五攻关项 目
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240 广 西 植 物 19卷
1 材料和方法
1．1 试验材料 供试材料为宁夏农科院枸杞研究所培育的高产优质枸杞新品种——宁杞 1号。
1．2 方法
1．2．1 愈伤组织的诱导 取当年生长的明显舒化成髓组织的枝条，摘除叶子．侧芽和带有分生组织
的顶端 100illm，把外植体的切端蘸熔蜡封着伤 口，然后浸人 70％酒精 中 20 s，再转人 0．1％HgCl2
溶液中，经过 8～10 rain后，用无菌水冲洗 3遍，最后以吸水纸吸干，从茎的两端各切除 10 mm，
余下部分切成 20 mm 的小段，用无菌镊子夹着茎 的切段，用瓶塞打孔器从切段中取出圆柱体髓组
织，并将其转移到 90 mm 的无菌培养皿中，用解剖刀切成 2-3 mm厚的小圆片，接种到 4种含不同
激素的MS固体培养基上诱导愈伤组织发生。
1。2。2 愈伤组织的继代培养 在P2培养基中加人 500 nag／L的水解酪蛋白作为继代培养的培养
基。挑选色泽鲜艳．生长迅速的愈伤组织进行继代培养，每次 20 d，2～3次继代后， 出现疏松颗粒
状胚性愈伤组织，选择颗粒较细的愈伤组织，加快继代频率 (2周 1次)，当愈伤组织易碎，颗粒均
匀且生长迅速时，改为3周 1次保存之。
1．2．3 分化培养 将上述继代过程中产生的胚性愈伤组织转移到含不同浓度的6-BA和 NAA的
MS培养基上，4周后观察不同培养基上愈伤组织的分化出芽情况。
1．2．4 生根培养 选择较为健壮的丛生芽，切除底部的叶片，只保留上部 2-3片叶，插人生根培
养基中，3周后观察其生根情况。
在上述各步骤中，各外植体均接种于容量为 120ml的三角瓶中，每瓶 3—4个外植体，每处理 3
～ 4次重复 培养条件：温度 20-25℃，每 日光照 10～12 h，光照强度为 2 500~3 000Ix
2 结果与分析
2．1 愈伤组织的诲导}畦 长
枸杞髓组织切片接到诱导培养基上 3 d后开始膨大，在切面上开始形成白色愈伤组 织 (图版 I：
1)，其中 PI培养基诱导频率最高，可达 95．7％；P3与 P4培养基诱导的愈伤组织 白色紧密，不易分
散，经过 30 d继代
培养，有的可直接分
化出苗，但频率很低
(表 1)，而 P2培养
基上诱导的愈伤组织
为淡黄色松散型，这
种愈伤组织继代转接
后能迅速生 长，多 次
继代培养后，颗粒小，
表1
Table1 Efects ofhormones 01caliinduction ofLycium barbarum L pithtissue
a，um ．
m 明 m Ill 磊imeof eal翌 萋r OlPe rontage o⋯
分散好，难以用镊子夹起来，而且胚性细胞多，分化频率高。
z 2 2’4_D对盘伤组织继代的影响
在 PI培养基中，我们加人植物激素 2，4一D 0．5 mg／L诱导愈伤组织发生，诱导率为 100％。这
说明 2,4一D对枸杞愈伤组织的诱导有一定的促进作用，将其转人含不同激素成分的培养基中进行继
代培养，结果如表 2．
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3期 曹有龙等： 枸杞髓组织离体培养及高频率植株再生的研究 24
从 表 2可 以看 出 ，2，
4一D 对枸杞愈伤组织的形
成 在 一 定 范 围 内 (0．5～ 2
nag／L】随 2，4一D 浓度的增
加，禽伤组织生长加快，但揭
化时间 提前。 当 0．5 mg／L
21 4-D 与 0．5mg／LKT配
合使用时，愈伤组织生长速
度 很 低 ， 而 且 变 得 十分 坚
硬 ， 颜 色 也 由 白 色 转 为
表 2 2,4一D列枸杞愈伤组织的影响
Table 2 Efects of2
,
4-D on~alli ofLycium barbarum L．
毒 嚣： giot he cal + + + ．
绿色，近培养基部分 2 d后出现褐化；培养基
中添加 500 mg／L cH对愈伤组织的生长有
很好的促进作用
当把培养基含 2．4一D0,5mg／L诱导出的
愈伤组织转接到 P2培养基后，愈伤组织逐渐转
变为颗粒状胚性愈伤组织，与 P2培养基上诱导
的愈伤组织物质很相似 (图版I：2】。因此，如
果用含 4一D 0．5 nag／L的培养基诱导愈伤组
织发生，用 P培养基进行继代培养，将获得大
量颗粒状胚性愈伤组织。因此，这种方法是枸
杞进行离体快繁较为适宜 的途径。
3分化培养
表 3
Table 3 EfI b ofdiferent hormones on difcrcm iation
rate ofLycium barbarum L．cali
将经过 P2培养基进行继代培养 15 d的愈伤组织转人附加 3％ 蔗糖、O．8％ 琼脂，500 mg／ L
CH，pH5．8～6．0含不同6-BA浓度的 MS分化培养基，两周后开始形成芽点、可进一步发展成芽丛 (
图版I：3)，所做不同植物激素配比试验结果表明，枸杞禽伤组织芽的分化需要一定浓度6-BA，所
使用的 5种含 6-BA 的培养基分 化频率都在 90％ 以
上，6-BA浓度高，每块愈伤组织得苗数多，但玻璃化苗
也多，6-BA与 NAA配台使用，能显著提高愈伤组织的
分化频率，但同时愈伤组织也得到增殖，分化得到的苗
必须及时转移，否则苗的基部又会转化为愈伤组织。单
独 使用 6-BA ，浓 度为 0．5 nag／L或者 附加 NAA
表 4 枸杞芽的扩繁
Table4 Reproduction ofbuds
0．0ling／L时愈伤组织分化频率略为下降，但分化出的苗正常， 比较几种培养基分化出苗的结果，
以MS+6一BA 0．5mg／L+NAA 0．们 mg／L结果最好(表 4】。
4芽的扩增
在愈伤组织上分化形成的芽，等长到 2 cm高时，将其沿基部切下，转人含不 同6-BA浓度的培
养基中，使其扩增，结果如表 5。从表 5可以看出，以 MS+6-BA0．2 rag／L时，芽生长正常．经
过 20d的培养，每芽可产生 50～150株无根苗 (图版I： 4)，但 BA为 1mg／L时，芽不能进行扩
增，培养 2O d后就转变为玻璃化苗，6-BA 0．5 mg／L的培养基虽能进行扩繁，但随着培养时间的延
长，部分也转化为玻璃化苗。
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242 广 西 植 物 9卷
2．5生根培养
将丛生芽沿基部切下，接种到生根培养基上诱导生
根， 结果 如表 5．
从表 5可以看出，无激素或者高浓度的生长素不利
于枸杞幼芽根的形成，低浓度的生长索对根的形成有促
进作用，当培养基中含有 NAA 0．2 mg／L时，能形成
大量完整植株 (图版 I： 5)，生根率可达 92％，且不
定根较粗，并有侧根 出现。
2．6试管苗移栽
表 s
Table 5 EITe~ts ofdiferenthormones
concentration Olq inducing root
ofLycium barbarum L
霉 R ateof rot
直接从培养基中取出立即移栽的幼苗一般不易成活，7 d后就枯萎死亡。但再生苗经过7 d的练苗
后，再进行移栽，所栽6盆36株幼苗，成活 14株，成活率 38． ，再生苗移栽 20d后开始生长，叶
片变绿．变厚，侧枝萌发，30d后主茎杆形成，开始木质化 三个月后形成完整植株 (图版I：6)
3 讨 论
枸杞体细胞胚的诱导和植株再生已有过报道 ‘ ，并已用愈伤组织进行了悬浮培养 “， - ，最近，通
过原生质体培养得到了愈伤组织，但没有形成再生植株。本文报道的试验结果与以往相比，一是培养材
料选用枸杞髓组织，二是筛选出了具高分化潜能的颗粒状愈伤组织，继代一年多仍保持较高的分化频
率，为枸杞抗病突变体筛选，原生质体融合培养以及外源基因转移的研究提供了一个有用的系统。
枸杞髓组织由薄壁细胞组成，细胞间隙较大，在诱导培养条件下易于发生突变 ¨，我们以其为
材料进行离体培养并获得再生植株，这为枸杞筛选新的品种打下基础．
我们以枸杞髓组织为实验材料，在取材方面，采用石蜡封着切 121，防止 HgCI2和酒精等消毒液
侵人髓组织内部而使髓细胞遭到破坏，得到比较满意的效果．
植物激素 2，4一D 在枸杞髓组织的愈伤组织诱导中有重要的作用，但高浓度的 2，4一D不利于愈伤
组织的诱导，而以0．5 rag／L效果最佳．诱导率达 100％。以MS+0．5mg／L2．4-D诱导愈伤组织
发生；以 培养基进行继代培养；以MS+ BA 0．5mg／L+NAA0．01 mg／L进行分化培养；以
MS+0．2 mg／L NAA进行生根培养，这是枸杞进行离体培养的一条理想途径。
参考文献
(1) 王 莉．拘杞胚乳植 物的诱导和它的倍性水平 (J)．遗传学报，1985．12(6)：44(I～444
(2) 张尔荣，蚋成费 柯杞叶柄的蛆鲠培养 (J]．植物学通报，1995，3《4)：5O～51
(3) 陈维伦，郭东红 枸杞叶片盘伤组蛆的诱导及植株再生 (J)．植物学报，1980,(6)：40～4I
(4) 顾墩荣．韩光氯 刘壤胤 枸杞胚乳盘伤组织的悬浮培养及无丝分裂的话体现寨 (J)．植物学报．1991 33(6)：478～48I
(5) 杨祝民 高清强．植物体细胞胚的诱导和形态发生．植物学通报 (J)．1991，B(增刊)：56~62
(6) Liu C S．An efllcient method for selecting emlbryoglmic callus from Lycium c~nevs L． ll culture¨ ) ．Plant Sc~em
(tirnerpick)，1992，79(1)：99～ 1,94
(7) Ratus hnyak Y．Rudas V 1^ Pjv助 N M-Regonetation of Lycium barbam m L plants from leaf tissue
,
callus culture and
ca]hmI~rotoplasts(J PlantCellReports
, 1990，9(2 84~87
(8) s pi J J，VanWyk SM C．Celfusion：A possiblemechanism forthe origin ofpo lyploid(J)．South African Journal of
Botany，1995．61(2)60~65
(9) ConstantinM 工Chromosomeinsta~]ityin oel andtissuecu lture and regmmrat~l plants(J)．Environawntel andExper-
Lment Botany，Prin~dinGrvatBritain198I
． 21『3／4)：359
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