全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 28(2)：256— 260 2008年 3月
茅苍术内生真菌的分离鉴定及在组培苗中的回接
陈佳昕 ，戴传超l*，李 霞 ，田林双 ，谢 慧
(1．南京师范大学 生命科学学院，南京 210046；2．江苏省农业科学院 农业生物技术研究所 ，南京 210014)
摘 要：从茅苍术的叶、茎和根中分离鉴定内生真菌，并观测内生菌回接对茅苍术组培苗生长的影响。共获
得茅苍术内生菌 16株 ，其 中叶片中 14株，根茎中各获得一株。分别为交链孢霉、镰刀霉 、小克银汉霉、青霉、
茎点霉、小菌核菌、孔球孢霉和不产孢类。经内生菌和茅苍术快繁苗实验初筛，得到两株对植物无害的内生
菌：小菌核菌和孔球孢霉，将它们回接到茅苍术组培苗中，可以从苗叶片中染色观察到菌丝。其中小菌核菌能
提高茅苍术炼苗的存活率，接入内生菌的茅苍术叶片超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性均高于未接菌的对
照，脂肪酸不饱和指数基本不变，说明分离自茅苍术的内生菌回接后可以与宿主建立共生关系。
关键词：茅苍术；组织培养苗；内生真菌；炼苗；抗逆
中图分类号：Q948．12 文献标识码 ：A 文章编号：1000-3142(2008)02-0256—05
Endophytic fungi screening from Atracty lancea
and inoculating into the host plantlet10S
CHEN Jia-Xini，DAI Chuan-Chaol*，LI Xiaz，TIAN Lin-Shuangi，XIE Hui
(1．College of Life Sciences，Nd g Normal University，Nanjing 210046，China；2．Institute of Agrobiological
Technology，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Nanjing 210014，China)
Abstract：The endophytic fungi were screened and identified from Atracty lancea．Sixteen strains of endophytie fungi
were screened totaly，fourteen from leaves．One strain was from root and stem respectively．These strains including
Alternarla sp．，Fusariium sp．，Cunninghamella sp．，Penicillum sp．，Phoma sp．，Sclerotium sp．，Gilmaniella sp．
and Myceliasterilia．On e strain of Sclerotium and one strain of Gilmaniella which no harm to plant tested by cultu—
ring together with tissue rapid propagation plantlets were inoculated into propagation plantlets．The influence of the
endophytic fungi on the growth，livability and physiology of A．1ancea were studied．Sclerotium sp．can strongly in—
crease the livability of A．1ancea．The mycelium could be observed by dying the materia1．Superoxide dismutase and
peroxidase activilities of treated groups were both higher than that of contro1．Index of unsaturated fatty acid was the
same as that of contro1．These were consistent with the result that endophytie fungi were symbiosis with the host．
Key words：Atracty lancea；tissue rapid propagation plantlets；endophytie fungi；domestication adversity tolerance
茅苍术(Atracty lancea)为菊科苍术属多年生
草本植物，为江苏省著名地道药材。原产于宁镇山
脉地区，茅山曾是其分布中心。由于山地开垦，野生
茅苍术资源日趋枯竭，已被列为省级保护的濒危植
物，近二十年已无商品性生产(郭兰萍等，2002)。尽
管我国近年来在茅苍术研究领域取得了许多重要成
果(陈敏等，2006；巢建国等，2001)，但资源开发还存
在以下难题：(1)野生环境下茅苍术生长缓慢，经济
效益差；(2)人工栽培有难度，茅苍术喜阴凉，不耐
热，不耐涝，易生虫。这严重影响了茅苍术的开发和
利用 。
内生菌是存在于健康植物组织器官中、不形成
收稿 日期 ：2006—09—27 修回日期：2007—02—06
基金项 目：国家自然科学基金(30500066)[Supported by the National Natural Science Foundation of China(30500066)]
作者简介 陈佳昕(1981一)，女，江苏扬州人，硕士研究生，主要从事微生物与植物相互关系研究，E-mail：biojiaxin@hotmail．tom
通讯作者(Author for c0resp0ndence，E—mail：daichuanchao@ninu．edu．cn)
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2期 陈佳昕等：茅苍术内生真菌的分离鉴定及在组培苗中的回接 257
明显致病性的一类微生物。目前研究表明，多数植
物中都有内生菌的存在(Berbee，2001)，它们有促进
植物生长(唐明娟等，2004)、提高抗逆性(任安芝等，
2005)、促进活性成分积累(杨靖等，2004)等作用。
茅苍术挥发油有强烈的抑菌作用(中国药典 ，2oo5)，
其体内是否有内生菌尚无人探讨。从前人研究结果
看，药用植物体内也多有丰富的内生菌，它们可以协
助宿主抵抗病原菌和促进苗期生长(戴传超等，
2005，2006)。因此，我们尝试从茅苍术中分离内生
菌，并接种到组培苗中，检测其对苗生长的影响，希
望能缩短茅苍术的生长周期，加快苗期生长，为开发
茅苍术道地药材提供参考。
1 材料与方法
1．1材料
茅苍术 2004年 5月采自宁镇山脉(汤山)，经南
京师范大学生科院植物教研室杨启银副教授鉴定。
分离用培养基：PDA培养基。
1．2方法
(1)内生菌分离及鉴定：参照 Strobel等(1996)
和Schulthess& Faeth(1998)的方法，植物根、茎
段 、鲜嫩叶片经 自来水 冲洗 3次后 ，在超净 台上 用
70 酒精消毒 1 min，0．1 的升汞消毒 10 min，无菌
水冲洗多次，叶片剪成0．5 cm~0．5 C1TI的大小，根和
茎每段0．5 cm长，置于PDA培养基上 27℃培养，待
截断处菌丝长出，切取菌丝转人另一含 PDA培养
基的培养皿内，27℃恒温培养，之后转接到 PDA培
养基或含茅苍术组织浸汁的 PDA培养基上观察培
养性状，待菌丝长满皿后，根据生长及培养性状，部
分需放人 4℃冰箱中诱导产孢，4～6个月观察产孢
结构。鉴定参照巴尼特等(1977)和魏景超(1979)的
方法。
(2)快繁苗的获得：切取茅苍术嫩梢，自来水冲
洗 3次后，在超净台上用 70 的酒精消毒 1 min，
0．1 的升汞消毒 7 min，无菌水冲洗多次，接种于
MS培养基。将茅苍术嫩梢接人腋芽诱导培养基，
待长出新嫩梢时切下，转移至芽增殖培养基。培养
1个月后，将诱导得到的丛生芽分离后接人无激素
的MS培养基中，嫩梢生长健壮。1个月后可移人
生根培养基(巢建国等，2001)。
(3)内生菌的初筛：将所得的内生菌回接茅苍术
快繁苗，实验前先统计各棵苗的株高、根长、芽数，每
株菌回接三棵苗，在培养瓶中共培养。鉴于每株菌
的生长速度不同，将实验分为两组，每组均设对照。
第一组共培养 1周后统计株高、根长、芽数，第二组
共培养三周后统计株高、根长、芽数。比较接菌前后
差异 。
(4)茅苍术对宿主的生理效应：将在共培养试验
中表现出促生长的两株内生菌(AL3，ALl2)经PDA
培养基活化后，用接种铲挑取一小块(直径0．5 cm左
右)分别回接到已生根的茅苍术无菌苗，每瓶 1株。
共培养 3周，待菌与苗长成一片后，取出炼苗。将苗
移人小盆钵内，弱光照，置于室温下，每天浇一次水。
观察和比较接人内生菌组和对照组苗的生长情况，
记录第一片新叶出现天数，若无新叶产生不计。
(5)内生菌在茅苍术中的定殖：取上述回接内生
菌的茅苍术叶片，在 5O NaOH 煮 5 min，显微观
察，染色后菌丝呈现蓝色，观察菌丝在叶片中的分布
情况。具体方法参考文献(俞大绂，1977)。
(6)超 氧化 物歧 化酶 (SOD)，过氧化物 酶
(POD)，过氧化氢酶(CAT)活性测定：分别取接种
AL3、ALl2和未接种内生菌的茅苍术叶片 0．5 g于
预冷的研钵中。酶液提取与测定参考邹琦(2000)的
方法
(7)脂肪酸测定 ：茅苍术脂肪酸测定及脂肪酸不
饱和指数计算参照文献(戴传超等，2001)。
2 结果与分析
2．1内生菌的分离与鉴定
试验结果表明，茅苍术叶片、茎、根中均有内生
真菌，但不同器官含有内生真菌的数量是不一样的。
在此实验中从 80个叶片样本中分离到 14株，分离
率最高，为 17．5 ；从 20个茎段样和根样中各分离
到 1株；总计 16株。将这些菌株编号为 ALl一16
号。根据菌株的形态特征和产孢情况(巴尼特等，
1977；魏景超，1979)鉴定出 8株，叶片 6株，分别为
AL2，AL15交链孢霉(Alternaria sp．)，AL4小克
银汉霉(Cunninghamella sp．)，AL6青霉(Penicil—
lure sp．)，ALl1茎点霉(Phoma sp．)，ALlO镰刀菌
(Fusariium sp．)，茎 中 1株 (ALl2)为孔球孢霉
(Gilmaniella sp．)，根 中 1株 (AL3)为小菌核菌
(Sclerotium sp．)。其余 8株由于在培养过程不产
生典型特征，无法鉴定。
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258 广 西 植 物 28卷
2．2茅苍术的快速繁殖
(1)丛生芽诱导：取茅苍术嫩梢为外植体，MS基
本培养基 ，通过 5种不同激素组合筛选腋芽诱导培养
基(表 1)。当 6一BA 为 2 mg／L，NAA为 0．3 mg／L
时，植株健壮，生长较快，叶片壮实。因此，MS+6一
BA2 mg／L+NAA0．3 mg／L可用于腋芽诱导。将萌
生的腋芽移入 3种不同激素组合的芽增殖培养基 中，
1月 后 统 计，结 果 表 明，在 MS+6一BA2 mg／L+
NAA0．3～0．4 mg／L培养基上芽增殖诱导频率高，植
株健壮，生长快(表 2)。(2)芽的生长与生根：将茅苍
术分株后移人生根培养基，15~20 d可见幼根。
表 1 不同激素组合对茅苍术腋芽诱导的影响
Table 1 Effect of different hormone compositions on
inducement of lateral buds of A．1ancea
2．3内生菌对茅苍术快 繁苗生长的影响
为了探讨本研究分离到的 16株内生菌是否对
茅苍术生长有促进作用，将这些菌株分别接入茅苍
术快繁苗 。结果表明，有 5株菌 (AL4，AL7，ALl4，
ALl2，AL3，ALl1)对茅苍术组培苗生长有促进作
用，除 AL2、ALl3和 ALl5使组培苗死亡外，其余
对组培苗的生长均无明显的抑制作用，说明大部分
内生菌对茅苍术生长是没有显著危害的(表 3)
(AL8在传代中停止生长，未列入试验)。由于不同
菌株生长速度有差异，根据生长速度不同，试验分两
批进行，两批均设对照。第一批菌株生长快，1周后
测量；第二批菌株生长较慢，3周后测量。
2．4内生菌回接对茅苍术存活与生长的影响
由于 AL4，AL7，AL11，AL3，ALl2，AL14能促
进茅苍术快繁苗的生长，我们挑选了其中已鉴定到
属的两株菌 AL3和 ALl2，将其接入茅苍术快繁苗
培养基中，待长满后进行炼苗。15 d后观察苗成活
率。对照 15个样本，存活 11个存活率达 73．3 9，6。
AL3，18个样本，存活 16个，存活率达 88．8 ，回接
AL3的试 验组存 活 率 比对 照提 高了 15．5 。
ALl2，11个样本，存活 8个，存活率达 72．7 9，6。观
察生长状况表明，AL3处理组，新叶 4．18 d出现。
AL12处理组 6．67天 出现。对照 5．44 d出现 (表
4)。炼苗 1个半月后 ，接菌组生长情况明显优于对
照。我们用苯胺蓝染色的方法 ，在接种内生菌 的茅
苍术叶片组织中找到了内生菌菌丝。说明内生菌菌
丝已经侵入叶片组织，并在其中定殖。苯胺蓝染色
后叶片呈淡蓝色略透明，菌丝蓝紫色(图 1)。说明
AL3和 ALl2与茅苍术建立了良好的共生关系，比
未接菌的对照更能适应新环境。
表 2 不同激素组合对茅苍术芽增殖的影响
Table 2 Effect of different hormone compositions on proliferation of lateral buds of A．1ancea
2．5内生菌对茅苍术组培苗抗逆性的影响
2．5．1对抗氧化酶 系的影响 大量研究表 明，SOD
和POD与植物抗性呈正相关。SOD，POD，CAT协
同作用防御活性氧或其它过氧化物 自由基对细胞膜
系统的伤害。POD参与木质素的合成，POD活性
提高能促进木质素合成，使细胞壁加厚，可有效防御
病原菌的入侵，提高了植物的抗逆性(袁志林等，
2004)。茅苍术幼苗喜阴凉 、不耐热、抗逆性差，为了
考察接入内生菌是否能提高茅苍术幼苗的抗逆性，
帮助茅苍术抵御不良环境，我们测量了 SOD，CAT，
POD酶活。结果表 明接入内生菌组 SOD，POD，
CAT活性均高于对照(表 5)。我们的试验结果说
明，茅苍术组培苗接入内生菌后，适应环境的能力和
抗御逆境的能力都得到提高。
2．5．2对植物脂肪酸的影响 当植物受到逆境胁迫
时，植物脂肪酸会发生改变，一般表现为不饱和脂肪
酸含量会增加(戴传超等，2001)。从植物SOD酶活
力来看，内生菌对植物造成 了轻微的胁迫。接入
AI 3的茅苍术快繁苗脂肪酸不饱和指数为 154．57，
ALl2处理组为 148．87，而对照为 159．53，说明脂
肪酸不饱和指数基本没有改变，内生菌的影响是轻
微的。
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2期 陈佳昕等：茅苍术内生真菌的分离鉴定及在组培苗中的回接 259
N：3，AL3(N=5)株高，根长，芽数中有一指标高于对照，算做对生长有促进作用。芽数一除主茎外的嫩梢总数。
图 1 内生真菌菌丝在茅苍术中的定殖(10×10) 箭头：菌丝，a．AL3接种，b．ALl2接种；内生菌回接到组培苗 c．显示接菌后
植株生长正常，d表示接菌后根生长正常。
Fig．1 Colonization of mycelium of endophytic fungi in the A．1ancea Arrows show the mycelium in the leaf，a．inoculated by AL3，b．
inoculated by ALl2；The inoculation of endophytic fungi to the tissue rapid propagation plantlet c SHOWS the plantlet grew healthily
after inoculation．d shows the root grew healthily after inoculation．
表 4 内生菌对茅苍术生长及存活率影响
Table 4 Effects of the endophytic fungi on the
growth and livability of A．1ancea
表 5 内生菌对茅苍术组培苗的生理影响
Table 5 Effects of the endophytic fungi
on the physiology of A．1ancea in vitro
菌株编号 No．SOD(U／g．fw)CAT(U／mg．pro)POD(U／g．min)
2．6小 结
本试验从茅苍术根、茎、叶中共分离得到 16株
内生真菌，经绿豆发芽实验初筛，得到五株对茅苍术
生长无害的内生真菌，挑选其中已鉴定并生长良好
的两菌株：AL3和 ALl2，回接茅苍术的组织快繁
苗，观察内生菌的接人对茅苍术生长、炼苗成活率和
抗逆性的影响。结果表明，内生菌与茅苍术建立了
良好的共生关系，能提高炼苗成活率，适应环境的能
力和抗御逆境的能力也提高了。
3 讨论
内生菌可以帮助宿主占据一定的生态位，提高
宿主适应环境的能力，它们在基因、生理和生态各水
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26O 广 西 植 物 28卷
平影响着植物(Lucero等，2006)。用植物和微生物
互作的方式解决濒危药用植物的生产问题，有一定
的应用前景。我们实验室在京大戟中筛到一株能促
进京大戟苗期生长的镰刀菌(Fusarium sp．)(戴传
超等 ，2005)。而本次试验从茅苍术中得到一株小菌
核菌(Sclerotium sp．)可以促进苗期生长。可见每
种植物内生菌都有严格的宿主，不同的植物问内生
菌群是有差异的。
内生菌可促进宿主植物的生长，提高抗逆性，如
接种内生菌可以促进台湾金线莲生长(唐明娟等，
2004)，提高禾草的抗逆性(任安芝等，2005)等。本
试验也证明了内生菌对茅苍术组织快繁苗的生长是
有益无害的。两试验组茅苍术的成活率略高于对照
组，尤其是接入 AL3组的茅苍术不但成活率高，新
叶出现也较快 ，说明内生菌能与宿主植物建立 良好
的共生关系，有效地促进植物生长，使植物更快更好
地适应环境。在炼苗时也发现，茅苍术苗在 7～9
月，由于温度过高，炼苗存活的苗地上部分也会枯
死，而只有接入内生菌 AL3的还有部分存活。说明
内生菌的接入提高了快繁苗的抗逆性。为了验证内
生菌的接入是否能提高抗性，测定了 S0D，POD，
cAT三种酶。接菌的试验组三种酶活力高于对照，
S0D活力分别比对照高出76．O9 和 39．O0 。可
能是由于两者刚建立共生关系时，宿主茅苍术产生
某种应激反应。茅苍术濒临灭绝，以组织培养的方
式获得大量的快繁苗可有效保护茅苍术的种质资
源。试验证明，给茅苍术组培苗接种内生菌，通过提
高炼苗存活率和抗逆性，有望给茅苍术野生转家种
提供一些有益的技术措施。
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