全 文 ：们 一I7／
广 西 植 物 Guihaia 20(2)：168～ 1 71 2000年 j月
文章 编 号 ：l 0∞一31．12(2000)02 0l 68 04
枸杞髓组织培养 中体 细胞胚胎发生
与过氧化物酶 同工酶分析
魏 琴 ，曹有龙z 陈 放z，周黎 军。，陈东林
1 宜 宾师 范 高等 专科 学枝 生 舒g．- 四川 宜 宾 6．140．7 2．fT叮lI『戈学 生命 iq学 学 院
四川 戚都 61 00,34：3 宵 宾农 业学 植 ．网川宜 宾 644003)
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摘 要 ：枸 杞髓 组 织 在 Ms一6 BA 0．1mg儿 +NAA 0．5mg／[ 培 养基 上诱 导 愈伤 组织 发 生 在 MS
+6-BA 0 1 mg／L+NAA 0．5 mg／I 1-cH 500 mg／L培养基上继代培养．再转^ Ms+6-BA 2 me／
L一 AA 0 5 mg／L的分化培养基上进行分化培养 。显微观察表明-在培养过程中愈 伤组织细胞由
非胚性细胞转变为胚性细胞 ，直至发育戚体细胞胚胎和完整植株 电泳结果显示 体细胞胚胎发生
的各阶段 ．其过氧化物酶同工酶发生相应 的变化
蓑犍词：也望：堕望塑堕羞：住塑璺巫堕；彗皇些望 章 三壁
中 围分 类 号 ：Q949 71 8．43 文献 标 识 码 ：A ，、
Observation of somatic embryogenesis and
anal yses of peroxidase isozymes in cul ture
of the pith of Lycium barbarum L．
W 口 Qin ，CAO You—long：，CHEN Fang。．
ZHOU Li jun ，CHEN Done lin
(1 Depe~ri*neng 0， Biology-Yibin Tea~¨ n’Cedlege—Yibin 644007，China~2．Colege。，Life Science
S,chu~ ( ⋯ -Ch㈣ gd 610064·China 3．yibinAgricMture Schc~1．Yibin 644003．Chlna )
Abstract：Calus wa induced ova M S medium supp]emented with o．1 g L 6 BA and 0．5 mg／I
NAA，from pith of L&~ium barbarum L and subcultured o13 MS medium supplemented with o 1 mg
I，6-BA 0 5 mg／I NAA and 500 mg／L CH Swell pieces of ca[1i okserved under the microscope
and it wa s revealed that the nonembroyn[c ceils of the calus had changed to embroyrfic cells from
which plant was developed through somatic emhryogertesis oft the 3,IS e~alture medium supplemented
wⅡh mg．／L 6-BA and 0．5 mg／L NAA Electrophoredc study of peroxidase i~zymes had dentonsl ral—
ed cortesportdmg chartges dur~ag the stages。￡SoRxatic em hryogens{s
．
Key ~ords：L Ⅲ barbarum L，；pith cultured；somalic em bryogenesis；perox／dase isozyme
收 稿 日期 1§9§0 6 03
怍 者 简介 ：魏 琴 L1967)．女 讲 师 ．植 物学 专 业
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2期 魂 琴等：枸杞髓组织培养中体细胞胚胎发生与过氧化物酶同工酶分析 169
枸杞作为重要的药物资源 ，得到了普遍关注。在组织和细胞培养及应用方面，近年来已
取得不少有意义的进展。 ，利用枸杞叶片作为外植体 已成功地诱导出体细胞胚胎及完整植
株 ，但利用髓组织诱导体细胞胚胎发生并对其过程中过氧化物酶同工酶进行研究未见报道。
通过本文的实验 ，填补了该领域的空白，为枸杞的进一步研究提供了实验依据 。
1 材料和方 法
1．1材 料
供试材料为我国宁夏枸杞 (Lycium barbarum I ．)。为宁夏农林科学院枸杞所培养的高产
优质品种—— 宁杞 1号。
1 2方法
1．2．1胚性愈伤 组织 的谤导与 分化
取 当年 生长 的具有 明显 分化成髓 组织 的枝 条 ，摘 除并丢弃 叶子 。侧芽和带有分 生组织 的
顶端 100 mm。把外植体 的切端蘸熔蜡封着伤口，然后浸入 7O 酒精 中 20 s，再转入 0．1 升
汞溶液中 8～10 min，用无菌水冲洗 3次 最后用吸水纸吸干用解剖刀从茎的两端各切取 10
mil，余下部分切成 20 mm 的小段 ，用无菌镊子夹住茎的切段 ，用瓶塞打孔器从髓组织中取出
组织的圆柱体 。将圆柱体转移到 90 mm的无菌培养皿中，用解剖刀切成 2～3 mm厚 的小圆
片，接种到 Ms+6-BA 0．1mg／L+NAA 0．5mg／L的固体培养基上 ，在该培养基 中加入 500
mg／l 的水解酪蛋白 (CH)作为继代培养基。挑选在诱导培养基上色泽鲜艳、生长迅速的愈
伤组织进行继代培养，2～3次继代后 ，出现的疏松颗粒状愈伤组织 ，接种至 Ms+6-BA 2
mg／L十NAA 0．5 mg／L的分化培养基上
1．2．2体 知胞胚 胎发生 的显微观 察
分别取接种剐分化培养基上 0、3、6、9、1 2、1j、18、21、24、27 d的材料以 FAA固定 ，
爱氏苏木精整染 4 d，曙红复染 ，石蜡包埋 ，切片厚度 8 btm脱蜡封片后 ，Olympus光镜下观
察照相 。
1．2．3过 氧化物 酶 同工 酶分析
分别取分化培养基上培养 O～27 d的材料 以及植株叶片 1 g于冰褡研钵 中，加 0．1 M
Tris—HC1缓冲液 2．5 mL，研磨成浆转入离心管，4 000 r／rain离心 20 min，取上清液加等量的
4O 的蔗糖溶液，摇匀 ，放入冰箱冻室备用 采用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳方法进行过
氧化酶同工酶分析。分离胶浓度为 7．5 ，浓缩胶浓度为 2．5 ，胶厚 1film，每槽加样 5O I ，
稳压 220V，电泳 5 h，整个过程 在 0～ 4 C进行 “’。
2 实验 结果
2．1胚性愈伤组织的诱导 、缝代和分化
枸杞髓组织在诱导培养基上约 10 d产生愈伤组织 ，诱导率为 80 。愈伤组织为淡黄色砼
散型 ，2～3次继代后更加松散 ，颗粒小 ，分散好 ，很难用镊子夹起来 。接种到分化培养基上，
松散的愈伤组织逐渐变紧密，两周后表面出现若干绿色小点 ，进一步培养，能分化出大量绿
色小 芽 。
2．2体细胞胚胎的发生
继代培养 7 d后的愈伤组织转移到分化培养基上后 ，0 d观察表明，愈伤组织大多为非胚
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1 7O 广 西 植 物 20卷
性细胞 ，细胞体积大，排列疏松，细胞质薄 ，核小．染色浅 (图版 I：1)；培养 3 d后，胚性
细胞逐渐增多，形态上以其体积小、细胞质浓嗥、核犬、染色深为特征 (图版 I：2)，同时还
发现 2一细胞胚 ‘图版 I：3)、4一细胞胚 (图版 I：4)、8一细胞胚 (图版 I：5)的存在 ；第 6～
l 5 d中 出现大小 不等 的球形 胚 (图版 I：6)；第 l8～24 d中出现心形胚 (图版 I：7)．鱼雷胚
(图版 I：8)；第 27 d中出现子叶胚 (图胚 I：9)．其维管组织未与愈伤组织联系，子叶肛掉
在 培养基 上 ，经继续 培养 (图版 I：10)长成小植 株 L圈版 I：l1)
胚性 细胞的启 动发生 于愈伤组 织 的表 面或 内部 。
2．3过 氧化物酶 同工酶 分析
过氧化 物酶 同工 酶分析情 况见 图 1、2。
从图 2可以看出，愈伤组织在转人分化培养
基后 ．随着培 养时间 的延 长 ，过氧化 物酶 酶带 也增
加 ，从 第 6～2l d在 Rf 0．12处 出现 新 的酶带 ，在
第 24～27 d时，不但在 Rf 0．12处有酶带 ，还有
Rf 0．15、0．18处 有新酶带 ，这些新 增加 的酶带 逐
渐 与植株 同工 酶酶带 相一致 。
3
胚 性细胞 在分化培养基 上 经过 2细胞胚
细胞 胚 、8一细胞 胚 、球形 胚 、心形 胚 、鱼 雷胚
叶胚 等过程 而发育 成小 植株 ，这 与
合子胚 的发育 途径 相似 。
同工酶 是来源于生物体 结构
不 同而能催 化 同一 反应 的酶 。根 据
酶与基因的关系，生物体酶的结构
是由基因所决定 。对同工酶的分析
是探查 基 因存 在和表达 的有效工
具 。植物的发育过程是遗传信息在
时间 和空伺 顺序表 达的过程 。同工
酶分析 为有机体顺序发育提供 了
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圈 l 过 氧化 钧酶 同 酶照 片
l l The photosraph。f pe ro~ida~ l sozymes
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2 3 4 5 6 T 8 9 10 咕 杜
- 口
2 过 氧化 均 酶同工 酶谱
Fig 2 Pero~idase speclra
手段 。枸杞髓组织培养中过氧化物酶同工酶发生的变化说明细胞的生长、分化过程中基因的
表达在时间、空间上是不同的。据文献 报道+酶活力的提高或基因同工酶酶谱的变化．可能
是组织块进入分化期的前奏 。该实验中，从培养的第 6 d开始 ，同工酶开始变化 ，第 6～21 d
同工酶酶谱较一致，从第 24～2／d又发生变化 ．且与植株更一致。这与显微观察的从第 3～
21 d以胚性细胞的分裂为主，第 l8～24 d出现了维管组织的_分化相一致．所以反过来也证明
培养过程中细胞分裂、分化的存在．为过氧化物酶同工酶作为拘杞体细胞胚胎发生的分子标
记的可能性提供实验依据
参 考文献 ：
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1979，38： 325～ 335
图版 说明 ：
i 非胚性细胞 400×；2．胚性细胞 200×；3．2-细胞胚 400×；‘．4一细胞胚 400×；5．8-细胞胚 ：∞ 一 球
形 胚 200×：7．心形 胚 200× ；8．鱼 雷胚 200×：9．子 叶 胚 200 ；10．从 愈 伤 组 织 上 脱 落 的 件 细 胞 f}E胎 ；
11 小 植株 的幼 苗
Explanation
1 Nonemhroymc ceil 400× ：2 Embroynic cell 200× ；3 Two cell somat[c embryo 400× ：4 Fou r—cel somalic
em bryo 400× ；5．Eight—cel som atic embryo 400× ； 6 Globular sonltic em bryo 200× ； Heart shaped ~om tic
em bryo 200× {8．Torpedo—shaped som 6c em bryo 200× ；9 Coty[edon—shaped som tic em hrvo 2t；o× ： j”1 Sun1t1c
em hryogenesis{rom callus；11．A p Lantlet seedling
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