全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 31(2)：250— 254 2011年 3月
罗汉果转抗病基因 NPR1的研究
杨 华，李惠敏，覃屏生，高成伟，秦新民
(广西师范大学 生命科学学院，广西 桂林 541004)
摘 要：以罗汉果子叶为外植体 ，研究了影响根癌农杆菌介导的罗汉果遗传转化的若干因素，建立了罗汉果
遗传转化体系。结果表明，5 d苗龄的子叶、预培养 1 d、侵染 20 min、共培养 4 d、共培养温度 22 C、AS100
fmol／L、Hy浓度不定芽筛选为 10 mg／L，生根筛选为 20 mg／L转化率最高。抗性苗经 PCR和 Southern印迹
分析，初步证实 NPR1基因已整合至罗汉果基因组中，转化率为 1．5 。
关键词 ：罗汉果 ；农杆菌介导；遗传转化；NPR1基因
中图分类号 ：Q943 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2011)02—0250—05
rn n ● l● ● 。lra terrm g disease resistance Rene
NPR 1 into Siraitia grDs Dr Z
YANG Hua，LI Hui_Min，QIN Ping-Sheng，
GAO Cheng-Wei，QIN Xi Min
(Colege of Life Science，Ouangxi Normal University，Guilin 54 1004，China)
Abstract：Using cotyledon of Siraitia grosvenorii as explants，an efficient and reliable transformation system was estah
lished．Several factors affecting genetic transformation of Agrobacterium-mediated S．grosvenori were studied．The re—
suits showed that 5 days aged cotyledon using for infection explants，pre-culture 1 d，bacterial infection time 20 min，c0I
culture 4 d with 22℃，AS concentrate 100 fmol／L，10 mg／L of hygromycin was suitable screening concentration for the
differentiation of adventitious bud and root could get the better transformation efficiency under 20 mg／L of hygromycin．
The transformants were confirmed by PCR and Southern blotting analysis with the transformation rate 1．5 ．
Key words：Siraiti grosvenori；Agrobacteriurrmediated；genetic transformation NPR1 gene
罗汉 果 (Siraitia grosvenorii)为葫 芦科 (Cu—
curbitaceae)罗汉果属 (Siraitia)植物，是我 国传统
的药用植物 ，有润肺止咳、清热凉血 、生津止咳、滑肠
排毒 、润肺化痰等功效。同时 ，其主要甜味物质罗汉
果甙 V是一种低热量高甜度的天然甜味剂，适合糖
尿病、高血压以及心血管患者食用。罗汉果中还含
有大量氨基酸、果糖 、维生素和矿物质 ，具有很好 的
保健效果。因此有“东方神果”之称 。作为我国传统
的食药两用植物及出口创汇药材之一，罗汉果 的市
场开发前景十分广 阔(李锋等，2004；李典鹏等，
2000)。但罗汉果在栽培过程中容易受到根结线虫
病、疱叶丛枝病、花叶病等病害的危害，严重影 响了
罗汉果的产量和品质。因此，培育高抗病品种以适
应生产的需要已成为一个亟待解决 的问题 。
利用植物基因工程技术，将外源抗病基因导入
受体植物培育抗病品种 ，是进行罗汉果抗病育种的
有效途径 。NPR1基因是植物系统获得性抗性中的
一 个关键基因，最早从拟南芥中克隆得到(Cao等
1994，1997)，它可调控植物的广谱性抗性的发生，在
植物系统性抗病中起着关键作用 ，人们对其结构、作
用机理以及与植物抗病性的关系等方面进行了研究
(Zhang等，l999；Kachroo等 ，2000；Ekengren等 ，
收稿 日期：2010—07—10 修回日期：2010 11一O6
基金项 目：广西 自然科学基金(桂科 自0728095)[Supported by the Natural Science Foundation of Guang (0728O95)]
作者简介：杨华(1983)，女，广西灵川人，硕士研究生，研究方向为植物基因工程，(Email)yanghua518888@126．coin。
通讯作者(Author for c0rresp。ndence，E mail：xmqin@mailbox．gxnu．edu．cn)
2期 杨华等 ：罗汉果转抗病基 因 NPR1的研究 251
2003；I in等 ，2004；)，发现 NPR1介导 的抗性 途径
可能是 多种 植 物共 同保 守 的途 径 (Cao等 ，1998；
Chern等，2001)。并且 ，NPR1在转基 因植株 中的
过量表达可使植株表现对多种病原物的广谱持久抗
性(Fitzgerald等 ，2004)。到 目前为止 ，转 NPR1基
因的作物不多，尚未见将该抗病基 因转入罗汉果方
面的报道 。本研 究在 NPR1基 因的克隆 (秦新 民
等，2005)和罗汉果子叶高效再生 系统 的基础上 (秦
新 民等，2008)，通过对影 响农杆菌介导的主要 因素
进行研究，建立一个优化的罗汉果遗传转化体系，将
NP尺1抗病基因导入罗汉果，以期获得罗汉果广谱
抗病新品种 。
1 材料和方法
1．1植物材料及无菌苗培养
实验采用罗汉果“青皮果”品种优质果为材料。
种子用 75 酒精消毒 30 S，再用 0．1 HgC1 溶液
消毒 8 min，无菌水冲洗 4次后 ，播于 0．7 9／6琼脂培
养基上。在(25_-41)。C培养箱中萌发 ，取培养 5～6 d
的种子子叶为实验材料 。
1．2菌株及质粒
采用根癌农 杆菌 LBA4404菌株 ，其 中含带 有
NPR1基 因 和 潮 霉 素 磷 酸 转 移 酶 基 因 的 质 粒
pCaMVNPR1，基 因表达 由启动子 CaMV35S调控 。
1．3农杆菌介导的罗汉果遗传转化
将经 检 测 含 有 NPR1基 因 的 根 癌 农 杆 菌
LBA4404接种于含 Km 50 mg／L、Rif 50 mg／L的 2
×YT培养基平板上 ，置于 27℃恒温培养箱中暗培
养 2 d。从平板上挑取农杆菌单菌落 ，接种 到含有
Km 5O mg／L、Rif 50 mg／I 的 2×YT液体培养基
中，于恒温摇床上，27℃，200 r／rain，振荡 (黑 暗)培
养至 oD ∞为 0．6～0．8(约 12～16 h)，5 000 r／min
离心 5 rain收集菌体 ，再加入含 100／lmol／I AS的
2×YT液体培养基 ，重新悬浮细菌 。于 27℃，200 r／
min培养 3 h，作为感染转化材料的原液。
取 5～6 d龄的罗汉果无菌苗的子叶，接种于预
培养基(MS+6-BA1．0 mg／L+IBA0．5 mg／L+30
g／L蔗糖+7 g／L琼脂粉 ，pH6．0)上，光照培养(光
照强度 1 000～1 500 lx，每天 12 h光照，温度为(25
±1)C)1 d后，用上述农杆菌液侵染 20 min，然后
转至共培养基上 (MS+6-BA1．0 mg／I +IBA 0．5
mg／I +AS100／~mol／I +30 g／L蔗糖 +7g／I 琼脂
粉，pH5．6)，于 22。C，黑 暗培养共培养 4 d，用无菌
水洗净子叶后转至筛选培养基上 (MS+6-BA1．0
mg／L+IBA0．5 mg／L+ Hyl0 mg／L十Cef 500 rag／
L+30 g／L蔗糖+7 g／I 琼脂粉 ，pH5．8)，待抗性芽
长出后 ，按每一个不定芽为一个株系进行编号 ，每个
月在 继 代 培养 基 (MS+ 6-BA0．2 mg／I + Hy 10
mg／L+Cef 400 mg／L+30 g／l 蔗糖 +7 g／L琼脂
粉 ，pH5．8)上继代一次 。不定芽长 至 3～4 cm 长
时 ，切下生长健壮的芽苗置于生根培养基 中(1／2MS
+IBA1．0 mg／I + Hy20 mg／I +Cef350 mg／L十 15
g／I 蔗糖 ，pH6．0)进行生根筛选 ，当不定根长 2～3
cm时敞开瓶盖 ，炼苗 2～3 d后进行移栽 。
1．4转化植株 的 PCR检测
取抗性植株长出的新 叶，采用 CTAB法提取植
物总 DNA，NPR1基 因 PCR扩增 反应 的引物为 ：
P1： 5-AGTTGATAAGGTCTCTTCGTTGATT—
AGCAG一3 ； P2： 5 一GGTACAGCAAAAATTA—
CACTAAGAGGCAAG一3 。
30>LPCR反应体系 ：模板 DNA30 ng，上下游
引物各 0．5／~mol，4种 dNTP各 100／~mol，10×
buffer 3 I ，Taq酶 2．5 U。反应程序 ：95℃预变性
5 min；94。C变性 30 S，55 C退火 30 S，72。C延伸 3
min(35个循环)；72℃延伸 10 min。PCR反应产物
进行 1 琼脂糖 电泳 ，EB染色后进行观察 。
1．5 Southern杂交分析
取 20～30 g CI、AB法提取的高质量总 DNA
经 HindHI完全消化后 ，在 0．7 9／6琼脂糖凝胶 电泳上
分离。将 DNA转至带正 电荷的尼龙膜上。探针为
以 pCaMVNPR1为模板经 PCR扩增的 NPR1基因
片段(2．2 kb)，用地 高辛进行标记 。预杂交、杂交、
洗膜及免疫 学 检测依 次按 DIG High Prime DNA
Labeling and Detection Starter Kit I(Roche公 司)
说明书进行 。
2 结果
2．1预培养时间对分化率的影响
实验表明，未经预培养 的外植体分化率仅为
4．42 ，可能是 因为伤 口处的细胞 尚未进入分裂状
态 ，而侵染过程中农杆菌对切 口产生毒性效应 ，这两
种因素累加导致外植体很难出芽，转化率很低；经预
培养 1 d的外植体感 染后 ，分化率 明显提 高，达 到
9．59 (表 1)。随着预培养 时间的延长 ，子 叶分化
252 广 西 植 物 31卷
率逐渐降低，预培养 4 d后子叶分化率降到 5．66％。
故罗汉果子叶预培养时间以 1 d为宜。
表 1 预培养时间对转化率的影响
Table 1 Effect of pre—cultivation days on differentiation
rate of Siraitia grosvenorii
2．2侵染时间对分化率的影响
实验结果(表 2)表明，侵染时间为 5 min时，转
化率很低 ；当侵染时间为 15～20 min时，芽分化率
明显提高 ；再延长侵染时间，在随后 的培养中大部分
子叶出现软化现象，分化率明显降低。因此，在其它
条件相同的情况下，侵染时间以 20 min为宜。
表 2 侵染时间对分化率的影响
Table 2 Effect of different infection times on
differentiation rate of Siraitia grosvenori
5
10
l5
2O
25
30
187
142
119
164
173
125
1l
lO
10
17
10
3
5．88
7．04
8．40
10．37
5．78
2．40
2．3共培养时间对转化率的影响
共培养是农杆菌遗传转化关键 的步骤之一 。当
共培养 1～2 d时，仅见少量农杆菌菌落出现；3～4
d后，在外植体的周围已可见明显菌落，抗性芽分化
率也呈上升趋势；5 d后，子叶问明显可见相连的菌
落，子叶分化率也随之降低；共培养 7 d时，农杆菌
过度繁殖生长导致叶片污染严重 ，变黑死亡，使转化
的植物细胞很难在筛选培养基上分化成苗 。因此，
适宜的共培养时间为 4 d(表 3)。
2。4共培养温度对分化率的影响
共培养的温度对 T—DNA的转移也有一定的影
响(Dilen等，1997；党尉等，2007)。本实验比较了
共培养温度对农杆菌介导转化罗汉果的影响。罗汉
果子叶经农杆菌感染后分别在 19、22、25、28。C四种
温度下共培养 4 d，结果显示 ，22。C共培养温度条件
下获得 了最高的抗性芽分化频率 10．87 。当温度
低于 22℃时，抗性芽的数 目下降，19。C时抗性芽分
化率比 22℃时下降了近 3 。而当温度高于 22℃
时，抗性芽的数 目也随着温度 的升高而下降，28℃
时的抗性芽分化率只有 6．77 (表 4)。这表明温度
对 T—DNA的转移有一定的影响。
表 3 共培养时间对分化率的影响
Table 3 Effect of CO～cultivation days on differentiation
rate of Siraitia grosvenorii
146
158
163
162
139
144
161
4
7
12
15
10
4
2
2．74
4．43
7．36
9．26
7．19
2．78
1．24
表 4 共培养温度对分化率的影响
Table 4 Effect of CO—cultivation temperature on
diferentiation rate of Siraitia grosvenorii
共培养温度 外植体数 分化芽的外植体数 分化率
Co—culture No．of Explant number of Differentiati0n
temperature(℃) explants adventitious bud rate(％)
19
22
25
28
88
92
76
74
7．95
10．87
9．21
6．77
2．5 AS加入方式对罗汉果转化率的影响
通常进行 AS处理 的方法有两种 ，在农杆 菌菌
液 中加入适 当浓 度的 AS以诱 导农 杆菌 的感染 能
力，或在农杆菌与植物外植体进行共培养时添加于
培养基中。为了提高转化率 ，我们设定了四个处理
比较 AS对罗汉果子叶转化 的影响。实验 I：在工
程菌菌液和共培养培养基中均不加入 AS；实验 Ⅱ：
只在工程菌菌液培养中加 AS；实验Ⅲ：只在共培养培
养基中加 As；实验Ⅳ：在工程菌菌液和共培养培养基
中都加入 AS。以上 4组实 验 AS的浓 度均 为 100
p．mol／L。结果表明，AS对罗汉果遗传转化具有促进
作用，在实验I中，诱导产生 的 Hy抗 性芽 率为
4．32 ；实验Ⅱ、实验Ⅲ的 Hy抗性芽率相当，分别为
6．06 和 6．40 ；实验Ⅳ的最高为 10．34 (表 5)。
2．6抗性植株的分子检测
经条件优化后 ，从 4 411个外植体获得抗性芽
451个 ，潮霉素生根筛选 后得到 89株完 整抗性植
2期 杨华等 ：罗汉果转抗病基因 NPR1的研究 253
株 。抗性苗移 栽种植 高达 1 m 时，取其 新 叶提取
DNA进行 PCR检测，PCR检测结果表 明在随机抽
取的 7O个植株中有 52株为 阳性植株 ，PCR阳性植
株率约为 74．29 。转化率 约为 1．5 。从图 1看
出 ：转基因植株 DNA扩增出的特异带与质粒 DNA
扩增 出 的条带 处 于 同一 位 置 ，大 小 为 2．2 kb，为
NP尺l全长基因。
表 5 AS加入方式对罗汉果分化率的影响
Tabl 5 Effect of AS addjti0n scheme on djfferentiation
rate of Siraitia grosvenorii
图 1 部分转基因植株的 PCR分析
Fig．1 PCR analysis of genomic DNA
from transgenic plants
M：XDNA／Hind II+EcoR I Marker；l-6．转化植株
7：未转化植株 ；8：质粒 DNA。
选择经 PCR检 测呈 阳性的部分植株进一步做
Southern印迹分析 。结果表明，非转化植 株未显示
任何杂交信号 ，而转化 植株都显示 了杂交信 号(图
2)，证明外源基因已经整合进罗汉果基 因组 中。
3 讨论
影响农杆菌介导的外源基 因转化的因素主要有
预培养时问 、农杆菌感染时间，共培养时间 ，以及 Ti
质粒 vir区活化等。适宜的预培养时问是提 高分化
率的条件之一 ，外植体转 化前进 行预培养可 以促进
细胞分裂 ，调整 细胞 状态 ，使细胞更 容易整合 外源
DNA(An，1985；I in等，2005)。因此 ，外植体 预培
养时问与植物转化效率有着明显的关系。但不同植
物或 同一植物不同部位外植体均有其最佳的预培养
时间。本实验结果 表明：罗汉果子叶预培养 1 d可
明显提高转化率。
图 2 Southern印迹分析
Fig．2 Southern blot analysis of genomic DNA from
leaves of control and transgenic plants
1，3，4，5，6：转化植株 ；2：未转化植株。
外植体在菌液 中浸泡时间直接影响农杆菌细胞
的聚集 和附着 ，浸泡时间长短与农 杆菌菌株和植物
对农杆菌的敏感度有关 。本实验中发现罗汉果子叶
需要较长时间的浸泡 ，20 min的侵染时间对罗汉果
子叶的转化效果最好。
农杆菌和外植体的共培养时间在整个转化过程
中是非常重要的环节 ，因为农杆菌的附着和 T DNA
的转移及整合都是在共培养时间内完成的。而农杆
菌附着后不能立 即转化 ，只有在创伤部位生存 16 h
之后才能诱发肿瘤。不同的植物或不同类型的外植
体与农杆菌 的最佳共培养时问差异很 大，范围在 2
～ 7 d(王关林等 ，2002)。本实验结果表 明，罗汉果
子叶外植体农杆菌侵染的适宜的共培养时间为4 d。
随着共培养时间延长会 出现农 杆菌过度 繁殖 的现
象 ，外植体容易被毒 害致死 ，或者在芽分化培养中，
抑菌 困难 ，细菌代谢物对芽产生毒害作用而最终导
致其褐化死亡，转化率 明显降低。
Dillen等(1997)的研究 表明 ，共 培养 温度在农
杆菌介导的转化过程中起重要作用，较低的共培养
温度有利 于提高转 化效率 ，其机 理可 能是 由于 T—
DNA转移复合体中 VirB—VirD4部分在较低温度下
能更好地发挥作用 (Fulle等，1996)。近年来 ，在大
蒜(Kondo等，2000)、棉花(Sunilkumar等，2001)和
大豆(党尉等 ，2007)的转化中也获得 了类似的结果 。
本实验研究也表明，22℃的共培养温度有利于提高
罗汉果的转化效率，而高于或低于22。C转化率均有
不同程度下降 。
AS可有 效地提高转 化效率 (杨 秀荣等 ，2002；
254 广 西 植 物 31卷
黄健 秋等 ，2000；刘海 坤 等，2004；Sunilkumar等 ，
2001)，损 伤细胞渗出液 中含有 0．5～1．0 t~mol／L
的 AS即可诱导农杆菌 Vir区基 因活化 。其 中诱导
效果最佳的是乙酰丁香酮 (AS)，加入 AS也可以显
著提高农杆菌的转化率 。但也有个别研究显示 ，AS
的加入与否对转化率的影响不大(杨广东等 ，2002)。
本实验研究表明，在农杆菌培养和共培养 阶段同时
加入 AS，分化率从 4．32 提高到 l0．34 ，促进作
用非常明显。
目前 ，本研究 已获得了罗汉果转 NPRl基因植
株 ，转化苗经 PCR和 Southern blot杂交分析 ，证明
外源基 因已整合到罗汉果基因组中。
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