全 文 ：中国生态农业学报 2010年 9月 第 18卷 第 5期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, Sept. 2010, 18(5): 1031−1035
* 国家公益性行业(农业)科研专项(200903052)资助
** 张兴(1952~), 男, 教授, 博士生导师, 主要从事植物化学保护和农药学研究。E-mail: zhxing1952@126.com
韩立荣(1979~), 女, 博士研究生, 主要从事微生物及农药学研究。E-mail: hlr4119@126.com
收稿日期: 2009-11-17 接受日期: 2010-03-17
DOI: 10.3724/SP.J.1011.2010.01031
瓦克青霉 F10-2对川楝树皮残渣纤维素酶解研究*
韩立荣 王永宏 张 璟 冯俊涛 张 兴**
(西北农林科技大学无公害农药研究服务中心 陕西省生物农药工程技术研究中心 杨凌 712100)
摘 要 以川楝树皮残渣为原料进行纤维素酶解研究, 测定了不同培养时间培养基质中主要胞外酶活性的变
化, 并对发酵前后残渣结构进行扫描电镜观察和红外光谱分析。结果表明: 瓦克青霉 F10-2具有木质纤维素降
解能力, 酶解液中纤维素酶、半纤维素酶、木质素过氧化物酶和锰过氧化物酶活性在发酵的 8~16 d内分别达
到最大值 6.42 U·g−1、7.62 U·g−1、6.55 U·g−1和 3.33 U·g−1。利用扫描电镜对降解后底物表面结构进行观
察, 可看到残渣表面变得疏松、柔软, 且具有部分微孔。底物残渣傅立叶红外光谱分析表明, 该菌株对残渣中
各组分均有一定降解。固态发酵培养试验表明，培养 24 d后残渣中纤维素、半纤维素和木质素的降解率分别
达到 42.70%、33.96%和 24.62%。
关键词 瓦克青霉 F10-2 川楝树皮残渣 木质纤维素 固态培养 降解
中图分类号: X712 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2010)05-1031-05
Enzymatic hydrolysis of chinaberry bark residue by Penicillium waksmanii F10-2
HAN Li-Rong, WANG Yong-Hong, ZHANG Jing, FENG Jun-Tao, ZHANG Xing
(Research and Development Center of Biorational Pesticides, Northwest A & F University; Technology and Engineering
Center of Biopesticides, Shaanxi Province, Yangling 712100, China)
Abstract The extra-cellular enzyme activity of Penicillium waksmanii F10-2 was determined using chinaberry bark residues as
substrate at different times. The ultra-structure and chemical constituents of the residues before and after fermentation were also
compared by using scanning electron microscope (SEM) and Fourier transform infrared spectrum (FTIR). The results show that fer-
mentation of P. waksmanii F10-2 utilizes methyl cellulose as substrate. After 8~16 days of fermentation, the maximum activities of
cellulase, hemi-cellulase, lignin peroxidase and Mn-depended peroxidase are 6.42 U·g−1, 7.62 U·g−1, 6.55 U·g−1 and 3.33 U·g−1,
respectively. The ultra-structure of degraded chinaberry bark residues is soft and loose with some micro-pores. FTIR spectrum analy-
sis of the residues shows that P. waksmanii fermentation products degrade components of chinaberry bark residues. After fermentation
for 24 d, the ratios of degradation of cellulose, hemi-cellulose and lignin in residues are 42.70%, 33.96% and 24.62%, respectively.
Key words Penicillium waksmanii F10-2, Chinaberry bark residues, Ligno-cellulose, Solid-state fermentation, Degradation
(Received Nov. 17, 2009; accepted March 17, 2010)
纤维素是自然界中存在的最广泛的一类碳水化
合物, 也是地球上数量最大的可再生资源[1]。我国纤维
素资源非常丰富, 仅农作物秸秆一项就年产 7亿 t[2]。
虽然纤维素废弃物资源巨大, 但由于天然纤维素的
结构复杂和难于降解, 目前人们对其开发和利用十
分有限, 除少部分被用于纺织、造纸、饲料加工外,
大部分被直接焚烧, 既浪费宝贵资源, 又污染环境。
植物细胞壁是由纤维素、半纤维素、木质素和
其他聚合物组成的复合体[3]。纤维素本身具有结晶
区域, 同时被木质素和半纤维素缠绕包围, 这些结
构特点严重阻碍了天然木质纤维素的有效利用, 必
须对天然纤维素进行预处理, 以破坏木质素保护层
和改变纤维素晶体结构 , 从而提高纤维素的利用
率。目前 , 研究较多的纤维素预处理方法有物理−
化学法如微波、超声波、高能电子辐射、蒸汽爆破、
酸碱、氧化等处理方法[4]。然而, 传统的物理−化学
法具有耗能大、预处理成本高和对环境污染严重等
弊端。相对而言, 生物降解法以其酶解条件温和、
1032 中国生态农业学报 2010 第 18卷
能耗低、设备简单和对环境友好等优势引起人们的
更多关注[5−8]。木质素生物降解研究主要集中于担子
菌类真菌, 尤其是白腐真菌中的黄孢原毛平革菌已
成为研究木质素降解的一种模式菌, 但实际上自然
界中木质素的降解是真菌、细菌及相应微生物群落
共同作用的结果, 很多非担子菌如青霉、黑曲霉等
也能产生高效的木质素降解酶类[9]。
植物农药残渣是指具有杀虫杀菌活性的植物材
料经过有机溶剂或水提取有效成分后的残余部分 ,
通常占植物材料干重的 90%以上。随着植物农药研
发的迅速发展, 在其直接加工利用中产生大量的废
弃残渣, 这些残渣大都露天堆放、挖坑填埋和焚烧,
造成严重的环境污染问题。这些残渣中含有大量的
纤维素、半纤维素和木质素, 是重要的再生资源。
如果能够将其中丰富的纤维素转化为工业可利用的
还原糖及化工原料等, 这对减少环境污染、加速可
再生资源的生物转化具有重要意义。目前, 西北农
林科技大学无公害农药研究服务中心实验室在植物
农药残渣的综合利用方面已做了较为详细的研究 ,
并成功完成了利用植物农药残渣培养绿霉孢子制剂
和堆置多功能有机肥等研究[10−11]。本文利用以植物
农药残渣为惟一碳源筛选得到的纤维素酶产生菌[12]
对川楝树皮残渣进行发酵降解, 考察了该菌的木质
纤维素酶分泌特性及降解后残渣结构的变化情况 ,
以期为植物农药残渣的综合利用开辟新的途径。
1 材料和方法
1.1 试验材料
供试菌株瓦克青霉 F10-2 菌株 (Penicillium
waksmanii)分离自陕西省秦岭山区的腐烂枝干 , 保
藏于西北农林科技大学无公害农药研究服务中心。
川楝树皮残渣由西北农林科技大学无公害农药研究
服务中心提供。将川楝树皮粉碎, 用 70%酒精提取 2
h, 过滤后的滤渣即为川楝树皮残渣。
1.2 固态发酵培养条件
称取 6 g川楝树皮残渣、4 g麦麸、0.14 g蛋白
胨和 0.04 g磷酸二氢钾放入 250 mL锥形瓶中, 按水
料比 2∶1加入蒸馏水, 121 ℃下灭菌 1 h, 备用; 用
无菌水将菌株斜面培养物分别制成孢子悬浮液, 每
瓶培养基中接种瓦克青霉孢子悬浮液 (106 个孢
子·mL−1)3 mL, 同时设不接种孢子悬浮液的为对
照。之后置于 26 ℃光照条件下持续培养 24 d, 每隔
4 d取样, 测定培养过程中各种酶类活性和培养基质
中纤维素、半纤维素和木质素含量。
1.3 指标测定与分析
粗酶液的制备参照文献[9], 酶活性测定参照文
献[13−17]。纤维素酶(Cellulase)活性用滤纸为底物进
行测定, 1 个酶活力单位(U)定义为每分钟水解底物
生成相当于 1 μmol葡萄糖的还原糖所需的酶量; 半
纤维素酶(Hemi-cellulases)活性以 1%木聚糖为底物
进行测定, 1 个酶活力单位(U)定义为每分钟水解底
物生成相当于 1 μmol木糖的还原糖所需的酶量; 木
质素过氧化物酶(Lignin peroxidases)活性的测定用
藜芦醇法, 1 个酶活力单位(U)定义为每分钟氧化藜
芦醇产生 1 μmol藜芦醛所需的酶量; 锰依赖过氧化
物酶(Manganese-dependent peroxidases)活性的测定
用 MnSO4法, 1个酶活力单位(U)定义为每分钟氧化
Mn2+产生 1 μmol Mn3+所需的酶量; 漆酶(Laccases)
活性的测定用 ABTS 法, 1 个酶活力单位(U)定义为
每分钟氧化 1 μmol ABTS所需的酶量。
基质中纤维素、半纤维素和木质素含量测定采
用文献[18], 残渣结构观察采用HITACHIS-570型扫
描式电子显微镜 , 川楝树皮残渣结构分析采用
NICOLET 330FT-2R型红外光谱分析仪。
酶解液糖分分析采用日本岛津 LC-6AD型液相
色谱仪、NH2P-50 4E色谱柱及示差折光检测器。流
动相为乙腈+水(60+40), 流速 0.6 mL·min−1, 进样
量为 10 μL。
川楝树皮残渣固体培养中木质纤维素各组分的
降解率计算见式(1)。
100−= ×接种前某成分含量 接种后某成分含量降解率 ％接种前某成分含量
(1)
1.4 统计分析
数据统计分析方法采用 DPS软件(v8.50)进行。
2 结果与分析
2.1 瓦克青霉 F10-2产酶情况
2.1.1 发酵过程中纤维素酶和半纤维素酶活性的变化
纤维素酶是一种多组分的复合酶, 以纤维素酶
总酶(Filter paper cellulose, FPase)活性来考察菌株
F10-2的纤维素酶产生情况。如图 1所示, 随着培养
时间延长纤维素酶活性逐渐升高, 在发酵第 8 d 达
到最大值 6.42 U·g−1, 之后随着发酵时间延长酶活
性又逐渐下降。半纤维素酶活性在发酵 4~12 d迅速
增加, 第 12 d 达到峰值 7.62 U·g−1, 随后酶活性下
降, 在第 20 d又达到第 2个峰值 5.94 U·g−1, 之后
又迅速下降。
2.1.2 发酵过程中木质素降解酶类活性的变化
木质素降解酶类主要有木质素过氧化物酶、锰
依赖过氧化物酶和漆酶。由图 2 可知 , 瓦克青霉
F10-2 可以产生木质素过氧化物酶和锰依赖过氧化
第 5期 韩立荣等: 瓦克青霉 F10-2对川楝树皮残渣纤维素酶解研究 1033
图 1 瓦克青霉 F10-2纤维素酶和半纤维素酶的产酶曲线
Fig. 1 Courses of cellulase and hemi-cellulase production
from P. waksmanii F10-2
图 2 瓦克青霉 F10-2木质素降解酶的产酶曲线
Fig. 2 Courses of lignolytic enzyme production from
P. waksmanii F10-2
物酶, 但测定中未发现漆酶。木质素过氧化物酶在
培养的第 4 d达到第 1个峰值, 但酶活性较低, 在培
养的第 12 d酶活达到最大值 6.55 U·g−1。锰依赖过
氧化物酶在培养的第 16 d达到最大值 3.33 U·g−1, 且
整个培养过程中相对于木质素过氧化物酶活性较低。
2.2 瓦克青霉 F10-2对川楝树皮残渣的降解
比较川楝树皮残渣固体培养中木质纤维素各组
分的降解情况可知(图 3), 随着培养时间的延长, 川
楝树皮残渣各组分含量也呈规律性变化。在菌株培
养的前 12 d, 纤维素降解速度快速提高, 12 d后降解
率增幅不明显。菌株培养的前 12 d, 半纤维素和木质
素降解速度相对较平缓, 在 12~16 d半纤维素降解速
度大幅上升, 相对于纤维素和半纤维素, 木质素降解
速度较慢。在培养的 24 d内, 纤维素、半纤维素和木
质素降解率分别为 42.70%、33.96%和 24.62%。
2.3 瓦克青霉 F10-2降解后川楝树皮残渣结构的变化
2.3.1 川楝树皮残渣表面结构的变化
利用扫描电子显微镜(SEM)对瓦克青霉 F10-2
降解前和降解 16 d后的川楝树皮残渣结构扫描观察,
结果如图 4所示。从 SEM照片可以看出, 降解前残
渣表面结构比较紧密、有序, 质地也比较坚硬, 残渣
经过菌株 F10-2 降解后, 由于部分半纤维素及木质
素的去除, 使残渣表面变得疏松、柔软, 且具有部分
微孔, 说明经过瓦克青霉 F10-2 降解后残渣结构发
生了明显变化。
2.3.2 傅立叶红外光谱分析
木质素红外光谱的特征吸收峰与归属之间存在
一定的对应关系。分别取未经降解和降解后的川楝
树皮残渣样品做红外光谱分析, 结果见图 5。残渣中
纤维素、半纤维素分子的主要结合键 C—O—C
图 3 川楝树皮残渣发酵过程中纤维素、半纤维素和
木质素的降解率变化
Fig. 3 Degradation rates of cellulose, hemi-cellulose and
lignin during fermentation of chinaberry bark residues
图 4 降解前(A)和降解后(B)川楝树皮残渣表面结构的扫描式电镜分析
Fig. 4 Surface structure of undegraded (A) and degraded (B) chinaberry bark residues through SEM
1034 中国生态农业学报 2010 第 18卷
图 5 降解前(A)和降解后(B)川楝树皮残渣样品的傅立叶
红外光谱分析
Fig. 5 FTIR of undegraded (A) and degraded (B)
chinaberry bark residues
的特征吸收峰位置在 1 320~1 210 cm−1, 木质素中芳
香环的特征吸收峰在 1 674~1 508 cm−1附近, 甲基和
亚甲基的吸收峰在 2 940~2 842 cm−1附近, 愈创木核
吸收峰在 1 153~1 145 cm−1附近。降解后残渣与未降
解残渣相比发生了明显变化, 2 924 cm−1附近甲基、
亚甲基吸收明显减弱, 1 547 cm−1、1 514 cm−1附近的
芳香环吸收减弱, 1 152 cm−1、1 148 cm−1附近愈创木
核吸收减弱, 891 cm−1附近末端亚甲基振动减弱, 说
明发酵残渣中芳香环结构明显减少, 也就是木质素
结构得到了降解。1 267 cm−1附近 C—O—C集团吸
收减弱, 说明部分纤维素、半纤维素得到了降解。
此外, 经发酵的残渣在 423 cm−1附近吸收强度增加,
说明残渣发酵过程产生了一些小分子物质, 即经过
发酵残渣得到了明显降解。
2.4 酶水解糖液成分分析
取残渣酶解液, 再经 0.45 μm膜过滤后, 进行液
相色谱分析, 结果见图 6。由液相色谱图经定性分析
可知, 酶解液的主要成分为葡萄糖, 此外也含有相
当多的木糖。可见, 菌株 F10-2固体培养过程产生了
纤维素酶和部分木聚糖糖酶, 这与前期酶系测定和
酶解试验结果相吻合。
3 结论
瓦克青霉 F10-2 可在固态川楝树皮残渣基质中
生长, 并可产生木质纤维素降解酶类。川楝树皮残
渣的降解是纤维素酶、半纤维素酶、木质素过氧化
物酶和锰过氧化物酶共同作用的结果。对川楝树皮
残渣扫描电镜和红外光谱分析表明, 降解后残渣结
构变得疏松且具有部分空隙, 各官能团也发生了一
定的变化, 在培养的 24 d内, 瓦克青霉 F10-2对纤维
图 6 川楝树皮残渣水解产物的 HPLC图
Fig. 6 HPLC of chinaberry bark residues hydrolysates
a: 标准物 Standards; b: 空白 CK; c: 川楝树皮残渣酶解液 Hy-
drolysates of chinaberry bark residues.
素、半纤维素和木质素的降解率分别达到 42.70%、
33.96%和 24.62%。
纤维素酶来源非常广泛, 不同微生物产生的纤
维素酶在组成上有显著差异, 对纤维素的降解能力
也大不相同。长期以来, 木质纤维素降解酶的研究
主要集中在木霉(Trichodema)和白腐菌等菌株。虽有
研究表明青霉属真菌中一些种类不仅能分泌组成齐
全、酶活较高的木质纤维素降解酶, 而且具有易培
养、生长快等特性[19], 但青霉属真菌降解纤维素的
研究报道相对较少, 经查阅仅见国外 Wood 等[20]、
Rapp等[21]、Jorgensen等[22]和 Laborda等[23], 国内曲
音波等 [24]、袁红莉等 [25]和王希国等 [26]有相关报道,
而关于瓦克青霉固态发酵降解木质纤维素类方面的
研究尚少见报道。
通过对瓦克青霉 F10-2 产酶和木质素降解特征
的研究, 拓宽了木素降解酶微生物来源。此外, 以植
物农药残渣等植物废弃物的生物处理代替焚烧、掩
埋等传统处理方式, 不仅减少了环境污染, 更缓解
了能源匮乏等问题。
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