全 文 ： * ?国家高技术 (863) 发展计划项目 ( 2004 AA 212102) 和山西省科技攻关项目“三价抗虫棉的研制与应用”及山西省自然科学基金项目“彩
色抗虫棉的研制与应用”资助
收稿日期 : 2004-06-08 改回日期 : 2004-07-29
转三价抗虫基因棉花遗传特性研究 *
吴 霞 李燕娥 王娇娟 上官小霞 朱 祯
(山西省农业科学院棉花研究所 运城 044000) (中国科学院遗传与发育生物学研究所 北京 100101)
摘 要 研究采用农杆菌介导法将外源三价抗虫基因( Bt+ CpTI + GNA )导入常规棉花品种中获得转基因再生株 ,
分子检测表明外源基因已在棉花体内表达并遗传给后代材料。其转化再生株后代材料经抗性检测 ,进行大田选育
已至 F8代。PCR 分子检测与转化的标记基因和外源目的基因抗性三者极有规律性 , 转化后代材料分离有的符合
孟德尔规律 ,有的则较偏离 ,其所携带的基因在转基因棉花低代材料中分离规律较为含糊 ,高代材料则较稳定。
关键词 棉花 农杆菌介导 外源三价抗虫基因 遗传特性 标记基因
Genetic characters of transgenic upland cotton cultivars carrying triple genes (Bt + CpTI + GNA) . WU Xia, L I Yan-E ,
WANG Jiao-J uan, SHANGGUAN Xiao-Xia ( Cotton Research Institute, Shanxi Academy of Agricultural Sciences,
Y uncheng 044000,China) , ZHU Zhen( Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences,
Beijing 100101,China) , CJ EA , 2006,14( 1) :21～23
Abstract Foreign triple genes(Bt+ CpTI + GNA) resistant to cotton insects have been introduced into conventional cot-
toncultivars by agrobacterium tumefaciens mediated transformation and the regenerated plants have been obtained . The
results of molecular detection indicatethat theforeign genes havebeen transferred into cotton plants . Theprogeny materi-
als of transgenic plants are detected by insect-resistance . Up to now , the F8 has been got after the selection in thefields .
The results of PCR molecular detection, marker genes and foreign target-gene with insect-resistance are quite regular .
Someof their progenies’segregations coincide with the Mendel’s regularity of segregation, but some deviate, and their
segregation laws in lower transgenic generation materials are vague while those in high generation materials are stabler .
Key words Cotton, Agorbacterium tumefaciens mediated transformation, Foreign triple genes resistant to cotton insects,
Genetic character, Marker gene
(Received June 8, 2004; revised July 29, 2004)
1 试验材料与方法
外源基因构建。三价抗虫基因质粒为 pCRPSBCK-
OMGNA-Npt? (Bt 毒蛋白 + 豇豆蛋白酶抑制剂 + 雪
花莲凝集素 ,简称 Bt + CpTI + GNA ) ,包含了 Bt、CpTI
及 GNA 3种抗虫基因 , 分别由棉花曲叶病毒启动子
(P-RP)及复合启动子 ( OCS uas)6 ( mas) 控制 , 并含有
Ω、AMV 的转译增强序列。标记基因为 NPT?, 实际插
入序列约 11kb基因。修饰的 Bt-CPTI 基因序列全长
2205bps, 编码 735 个氨基酸残基。 GNA 基 因全长
484bps,编码 105个氨基酸序列 , 其基因构建图谱见图
1。棉花外源基因转化采用 高效农杆菌介导 转化
法[ 1] , 受体材料为“冀合 713”、“新陆中 9 号”和彩色棉
等。目的基因检测一般采用 2种方法 , 一是用转基因
棉花倒 3叶饲喂 2龄棉铃虫 4～6d, 依棉铃虫发育和
图 1 质粒 pCRPSBCK-OMGNA-Npt?图谱
Fig.1 Map of plamids pCRPSBCK -OMGNA-Npt?
第 14 ?卷第 1期 中 国 生 态 农 业 学 报 Vol .14 No .1
2 0 0 6 ?年 1 月 Chinese Journal of Eco-Agriculture Jan ., 2006
棉花被棉铃虫食用状况鉴定 ;二是用常规 PCR 扩增分析和 Southern blot分子检测插入序列在植物细胞中定
位和表达情况。标记基因检测采用转基因棉花快速纯合法[ 2] 、结合棉花生长期用 5000mg/ kg卡那浓度涂抹
棉株顶部倒 3叶 ,5d后依棉花叶片颜色鉴定 (绿色为转化株 , 黄色为非转化株 )。
2 结果与分析
外源基因在转化棉株中的表达。因 Bt-CPTI 为融合蛋白 ,故只扩增了 Bt条带 , 而 PCR 分别扩增至预期
长度大小的 743bp Bt 条带和 484bp GNA 条带 , 说明 Bt-CPTI 基因与 GNA 基因已经整合入棉花染色体中
(见图 2和图 3)。根据 Southern杂交结果可知 Bt-CPTI 和 GNA 的插入拷贝数均为 1个 (见图 4) 。
图 2 转三价抗虫基因植株中 Bt 基因的 PCR 分子检测 *
Fig n.2 PCR product of Bt gene in transgenic
cotton plants contained triple genes
* 1 和 15 为 100bp DNA M arker; 2 为质粒 ; 3 为未转
基因棉花 ; 4～14 为转基因棉花 , 图 3 同。
图 3 转三价基因植株中 GNA 基因的 PCR 分子检测
Fig.3 PCR productofGNA geneintransgeniccottonplantscontainedtriplegenes
同一转化愈伤获得的再生株 F0 代基因性状。表 1
PCR 检测结果表明 , 同一转化愈伤块分化得到的再生株 ,
外源基因 Bt 和 GNA 在植株体内不是同时表达 , 其中 713-
图 4 转三价抗虫基因棉花的 Southern blot 杂交图 *
Fig.4 Southern blot analysis of transgenic cotton plants contained triple genes
* A 为 Bt-CPTI , B 为 GNA , 1 为质粒 , 2 为非转基因植株 , 3～8 为转基因植株。
BCG-58 与 22-713-1.26
的 Bt和 GNA 同时表达 ,
另外 3 块基因表达性状
不一。引起这些表达性
状差异的原因可能是外
源基因是随机插入到染
色体上及转基因植株由
表1 同一愈伤块再生株F0 代基因性状
Tab.1 Geneticcharacter of F0 regenerated
plants derived fromthesamecalluscamp
材 料 编 号 Bt GNA
Materials No .
D-15 ?-713 1991 + +
1002 ?+ -
1027 ?- +
713 ^-BCG-58 1996 ?+ +
2006 ?+ +
13 1-713-1 ?. 26 2013 + +
1009 ?+ +
1009 ?- +
22 1-713-1 ?. 26 986 + +
1044 ?+ +
同一块转化愈伤而来 , 但
并不由同一转化细胞分
化而来。另取 7 个克隆
转化的再生株 25 株检测
其抗虫性和标记基因表
达状况 , 仅有 1块二者表
达性状一致 ;2块抗虫性为高抗和中抗稍有差异 , 标记基因均为绿色 ;2块
抗虫性为高抗类型 ,但标记基因却不表达 ; 2块标记基因均表达 , 抗虫性
从高抗到不抗。这可能是外源基因在棉株体内的分布位点无一定规律
性 ,或目的基因在部分棉株体内的表达量达不到毒杀棉铃虫的效果。
转化再生株 F1 代与 F2 代基因性状表现。表 2表明 F1 代棉花基因
表达无规律性 ,标记基因分离比为 0∶7～9∶1。所检测 3块愈伤分化的
再生株基本符合孟德尔 3∶1遗传规律的仅有 1-713-1. 26, 其他 2块偏离
值较大。将 W-713-1.26同一块愈伤分化得到的转化株 F1 代剔除 NPT
?检测黄色和不抗虫或抗虫性较低的单株 , F2 代检测 (见表 3)标记基因
分离比大致同 F1 代。绿色转基因棉花再生株经棉铃虫饲喂检测达
100%抗虫 , 而黄色转化株均不抗虫。该检测结果与 F0 代检测结果有所
差异 ,其原因是在 F0 代已剔除了经棉铃虫饲喂检测抗虫性较低的转化
再生株。
22 中 国 生 态 农 业 学 报 第 14 ?卷
表 2 转基因植株 F1 代基因分离状况
Tab.2 Segregation of F1 regenerated plants
材 料 编号 行号 总株数 绿色 黄色 分离比
Materials No . Rowno . No.of totalplant Green Yellow Segregation ratio
W-713 ?-1 .26 985 #1-2 12 M7 5 v1 l.4∶1
1 ?-3 10 M8 2 v4∶1
1 ?-4 10 M9 1 v9∶1
14 ?-713-1. 26 900 #4-1 7 M0 7 v0∶7
4 ?-2 5 M1 4 v1∶4
4 ?-3 6 M2 4 v1∶2
1 ?-713-1. 26 954 #8-1 11 M6 5 v1 l.2∶1
8 ?-2 7 M5 2 v2 l.5∶1
8 ?-3 9 M7 2 v3 l.5∶1
表 3 转基因棉再生株 F2 代基因分离状况
Tab.3 Segregation of F2 regenerated plants
2000 ?行号 2001 行号 总株数 绿色 黄色 分离比
Rowno .2000 ?Rowno.2001 ZNo.of totalplants Green Yellow Segregationratio
1-3 3 ?26 21 5 4 .2∶1
1 ?-4 5 26 19 7 2 . 71∶1
2 ?-1 6 27 20 7 2 . 86∶1
2 ?-4 9 25 14 11 1 . 27∶1
3 ?-1 10 30 16 14 1 . 14∶1
3 ?-2 12 26 12 14 0 . 86∶1
3 ?-3 12 31 11 20 0 . 55∶1
4 ?-1 13 30 18 12 1 . 50∶1
4-3 16 18 11 7 1 . 57∶1
4-5 19 26 14 12 1 . 17∶1
转基因棉花材料高代基因性状表
现。表 4表明高代转基因棉株体内外
源基因较为稳定 ,3种方法检测值密切
相关 ,相关性与相关度均为高度相关 ,
达极显著标准 , 其相关系数 ( r0 . 05 =
0. 404, r0 . 01 = 0. 515) 高、中抗虫百分
率和叶片涂抹卡那霉素检测携带标记
基因百分率为 0. 7519 * * , 高、中抗虫
百分率和室内组培检测携带标记基因
百分率为 0.6432* * , 叶片涂抹检测和
室内组培检测为 0.9011* * 。说明转
抗虫基因棉株高代材料抗虫性检测采
用上述 3 种方法均可 , 但前提条件必
须是在低代材料淘汰、剔除虫测抗虫
性低的材料。但叶片涂抹卡那霉素检
测携带标记基因百分率和室内组培检
测相关系数还呈不完全相关 , 叶片涂
抹 NPT?检测有 8 个 100%的品系 , 组
培检测仅 2个 100% 的品系 , 其他几个
二者检测值相差较大 ,尤其是组培检测
值差别较大 ,说明高代转基因棉花材料
仍存在基因分离状况。
3 小 结
转三价基因抗虫棉由于所携带基
因在棉株体内的表达量、插入位点、基
因之间的相互作用而引起基因表达差
异 ,使低代转化材料中基因分离无一定
规律性 , 高代材料较为稳定。低代转基
表 4 转三价抗虫基因棉花试验品系抗性检测
Tab.4 Insect-resistance detection of transgenic cotton lines
with insects-resistant genes(Bt+ CpTI + GNA)
品 系
Cotton lines
高抗虫率/ %
High insect-
resistance ratio
高中抗虫率/ %
High- middle insect-
resistance ratio
NPT?涂抹检测/ %
Kan painting
NPT?组培检测/ %
Tissues culture
PX-1 ?40 Z95 95 74 _.3(56 ".5～92 ?.0)
PX-2 ?60 Z100 95 87 r. 5( 75 5.0～100)
PX-3 ?70 Z100 100 93 r. 8( 87 5.5～100)
PX-4 ?55 Z95 75 78 r. 6( 57 5.1～100)
PX-5 ?85 Z100 95 80 r. 0( 60 5.0～100)
PX-6 ?45 Z95 80 94 _.2(91 ".7～96 ?.7)
PX-7 ?15 Z70 95 84 _.4(72 ".0～96 ?.7)
PX-8 ?30 Z80 100 91 r. 2( 82 5.4～100)
PX-9 ?55 Z100 100 100 .0( 100)
PX-10 ?35 Z85 95 74 _.6(62 ".5～86 ?.7)
PX-11 ?45 Z95 95 80 r. 0( 60 5.0～100)
PX-12 ?20 Z100 100 100 .0( 100)
PX-13 ?20 Z50 45 33 _.8(28 ".6～38 ?.9)
PX-14 ?25 Z100 100 90 _.0(80 ".1～95 ?.0)
PX-15 ?65 Z100 100 90 _.4(85 ".7～95 ?.0)
PX-16 ?25 Z65 95 98 r. 4( 96 5.7～100)
PX-17 ?15 Z45 90 91 r. 7( 83 5.3～100)
PX-18 ?30 Z60 53 47 .5(0～95. 0)
PX-19 ?5 Z30 25 18 r. 7( 4 ?. 2～33 .2)
PX-20 ?45 Z85 90 86 _.7(80 ".0～93 ?.3)
PX-21 ?5 Z90 95 94 r. 3( 88 5.5～100)
PX-22 ?35 Z95 100 87 _.0(80 ".0～94 ?.0)
PX-23 ?45 Z100 100 91 r. 2( 82 5.4～100)
PX-24 ?10 Z95 100 83 r. 4( 66 5.7～100)
因材料主要用目的基因检测 ,一定要淘汰抗虫性低的材料。在转化抗虫棉品种、品系选育中抗虫稳定性达 90%
以上即可 ,但产量性状要过关 ,二者缺一不可。
参 考 文 献 h
1 李燕娥 , 吴 霞等 .棉花农杆菌介导法高效转化体系 .中国棉花 , 2000, 27(5) :1～10
2 李燕娥 , 焦改丽 , 李淑君等 .转基因棉花纯合系的获得和遗传分析研究 .中国农业科学 ,1998 ,31( 5) : 44～47
第 1 ?期 吴 霞等 : 转三价抗虫基因棉花遗传特性研究 23