全 文 ：第 14卷第 3期
2 0 0 6年 7月
中 国 生 态 农 业 学 报
Chinese Journal of Eco—Agriculture
Vo1．14 No．3
July， 2006
农杆菌介导玉米转基因的影响因素研究*
白云凤 王国英 苟明月 赵晋锋 董志刚
(中国农业大学农业生物技术国家实验室 北京 100094)
摘 要 研究了农杆菌介导玉米转基因过程中涉及的外植体选择、高渗和农杆菌共培养、选择培养基筛选转化体
等因素对愈伤组织生长及转化效率的影响。结果表明，同一基因型玉米 自交系中有少数幼穗幼胚诱导出的愈伤组
织生长速度快，转化效率高；高渗和农杆菌共培养以及除草剂筛选抑制愈伤组织的生长，致使部分转基因愈伤不能
分化成苗 ，并提 出其解决 途径。
关键词 玉米转基因 农杆菌介导 除草剂 转化效率
Influencing factors on maize transgene process mediated by Agrobacterium．BAI Yun—Feng，WANG Guo-Ying，GOU
Ming—Yue，ZHAO Jin—Feng，DONG Zhi—Gang(State Key Laboratory for Agmbiotechnology，China Agricultural Univer—
sity，Beijing 100094，China)，CJEA，2006，14(3)：173～175
Abstract The effects of explant selection，high osmotic treatment，CO—culture with Agrobacterium ，screening Of trans—
formed plants by selecting medium on the calus growth and transformation efficiency were studied in the process of maize
transformation mediated by Agrobacterium．The results show that the growth rate and transform ation efficiency of imma—
ture embryos derived from a vigorous ear are higher than those from other ears．High osmotic treatment and CO—culture
with Agrobacterium and herbicide screening impede the calus growth．The solutions are put forward．
Key words Maize transgene，Agrobacterium ，Herbicide，Transform ation efficiency
(Received Oct．15，2004；revised Dec．30，2004)
转基因技术使我们能有效利用外源基因进行品种改良、创造突破性种质。农杆菌介导的基因转化法具
有能转移较大的DNA片段、整合的外源基因重排少且多以单或寡拷贝整合l1l2 J等优点。近年来该方法在禾
谷类，诸如高粱[ 、水稻[ 、玉米[ 、小麦[ ]等作物的转基因中得到了广泛应用。农杆菌介导的转基因涉及
外植体选择、外植体高渗和农杆菌共培养、愈伤组织在筛选培养基上培养以及筛选转化体等步骤，其中有关
每一步涉及的因素对愈伤组织生长和转化的影响程度的报道尚不多见。本实验初步探讨了农杆菌介导玉
米转基因过程中的一些影响因素，结果报道如下。
1 实验材料与方法
供试材料为玉米自交系“综 31”，农杆菌菌株 LBA4404，携带质粒 pBar(含标记基因 bar)或 pBarF(不含
标记基因bar)，均由中国农业大学农业生物技术国家实验室保存。基本培养基为 D培养基 。取人工授粉
14d的5个玉米幼穗常规灭菌后剥胚，随机等量分 3份，第 1份直接放于无除草剂培养基，培养 8d后随机分
为 2部分，1／2继续在无除草剂的非筛选培养基上培养，1／2在除草剂Bialaphos筛选培养基(5mg／L PPT)上
培养；第 2、3份幼胚高渗处理后分别与携带质粒 pBar或 pBarF的农杆菌共培养 3d、回复培养 5d后也随机
分为2部分，1／2放在非筛选培养基上培养，1／2放在筛选培养基(5mg／L PPT)上培养。14d后，非筛选培养
基上的愈伤组织继续在同培养基上继代，筛选培养基上的愈伤组织提高选择压(10mg／L PPT)继续筛选。
* 国家高技术发展(863)计划项目(2001AA212051)资助
** 现工作单位为山西省农业科学院作物遗传研究所(太原 030031)
***通讯作者
收稿 日期：2004·10—15 改回日期：2004·12。30
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174 中 国 生 态 农 业 学 报 第 14卷
2 结果与分析
2．1 不同幼穗愈伤组织的生长能力及转化效率
取 5个幼穗剥胚，分别观测记载不同幼穗的幼胚经农杆菌菌液侵染后形成愈伤组织的能力，以幼胚未经
农杆菌侵染直接放在培养基上培养做对照。结果表明，不论幼胚是直接放在培养基上培养还是经农杆菌侵
染后再放到培养基上培养，其中 1个幼穗(编号E)总比其他 4个幼穗(分别编号 A、B、C、D)的幼胚初始愈伤
组织形成早，愈伤组织生长速度快，其他 4个幼穗之间则无明显差异(表 1)。培养基上加入除草剂筛选，来
自不同幼穗的愈伤组织均有部分逐渐褐化死亡，但不同幼穗对除草剂选择压的反应不完全一致。总的看，E
的抗性愈伤率高于A、B、C或 D，不论筛选期多长，幼胚是直接放在培养基上培养还是经携带质粒 pBarF或
质粒 pBar的农杆菌侵染后再放到培养基上培养，趋势是一致的(见表 1)，而 A、B、C、D之间无明显差异。若
把含无标记基因质粒 pBarF的农杆菌侵染后在筛选培养基仍能生长的抗性愈伤率作为假阳性愈伤率，把它
从含标记基因质粒 pBar的农杆菌侵染后在筛选培养基上仍能生长的抗性愈伤率中扣除，得到的则为比较真
实的阳性愈伤率，即转化率，二者相比则是假阳性愈伤在总阳性愈伤中的比率，即假阳性愈伤率。由表 1可
知，除草剂筛选 2个月后，E转化率高于其他 4个的平均值，而假阳性愈伤率则低于其他4个的平均值。
表 1 不同幼穗 的抗 性愈伤率
Tab．1 Ratio of resistant callus of different young ears of maize
*用携带质粒 pBarF的农杆 荫转化处理 ；**用携带质粒 pBar的农杆 菌转化处理o
2．2 高渗和农杆菌侵染对愈伤组织生长的影响
农杆菌介导玉米转基因的基本程序是幼胚高渗处理后农杆菌侵染转化。本实验中，幼胚高渗处理后与
农杆菌共培养3d，然后放到基本培养基上培养。5d后观测到经过转化处理的幼胚诱导出的愈伤组织生长速
度比未经处理的明显变慢，愈伤组织体积小。用携带不同质粒的菌液侵染，差异不明显。各处理均未观测
到死亡的愈伤组织。随后，将这 3个处理随机分为2部分，1／2在无除草剂培养基上培养，1／2在除草剂筛选
培养基(5mg／L PPT)上培养。20d后观测，高渗和农杆菌侵染对愈伤组织的抑制作用依然存在。在无除草
剂培养基上培养的未经侵染的对照愈伤组织生长均匀，生长速度快；而农杆菌侵染过的愈伤组织生长速度慢，
表2 高渗和农杆菌处理后的抗性愈伤率 有的开始褐化死亡。携带不
Tab．2 Ratio of resistant callus with treatments of high—osmotic
concentration and transfon-nation
5 100 100 100 0
2O 非筛选培养基 97．9 78．8 76．8 20．1
筛选 培 养 基 21．2 14．0 27
*用携带质粒 pBarF的农杆菌转化处理；**用携带质粒 pBar的农杆菌转化处理。
同质粒的菌液侵染之间的差
异不明显 ，均有 20％以上的愈
伤组织褐化死亡 ，而对照仅有
2．1％。在除草剂培养基上筛
选培养的3个处理的愈伤生
长均明显受到抑制，但对照的
抗性愈伤率高于用含 pBarF质
粒的农杆菌侵染过的抗性愈
伤率，而用携带 pBar质粒的农
杆菌侵染过的抗性愈伤率又
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第 3期 白云凤等：农杆菌介导玉米转基因的影响因素研究 175
高于对照(表 2)。
2．3 除草剂选择压对愈伤组织生长的影响
用除草剂开始筛选时农杆菌侵染过的部分愈伤组织逐
渐褐化死亡，愈伤组织存活率直线下降。筛选 8周后，愈伤
组织存活率降至 4．1％，而在无除草剂培养基上生长的愈伤
存活率为 46．2％(见表 3)。
3 小结和讨论
同一基因型的玉米 自交系中，有少数幼穗 的幼胚诱导出
的愈伤组织生长速度快，转化效率高，这与生活力旺盛的细
胞较易接受外来遗传物质有关。因此，转化时挑选生长状态
好的幼穗会提高转化效率。农杆菌介导的玉米转基因过程
中，高渗和农杆菌共培养会明显抑制愈伤组织的生长，这种
表 3 除草剂对转化后愈伤组织生长的影响
Tab．3 Effects of herbicide on the
growth of transformed calus
培养天数／d 愈伤组织存活率／％ Survival rate of calus
Culture time 无除草剂培养基 除草剂培养基
Medium witbo Ut PPT Medium with PPT
100
76．8
63．2
53．3
46．2
39．7
lOO
27．O
l6．7
6．8
4．1
4．1
影响能持续较长时间。由于这种抑制作用，一些生长状态较差的初始愈伤组织会停止生长或褐化死亡，包
括非转化愈伤组织和转化愈伤组织。如果材料本身组培性状差，则很难得到转化苗。对这类材料可考虑采
用其他转化方法或进一步完善农杆菌转化体系。用于从未转化细胞中筛选少量已转化细胞的抗生素或除
草剂会抑制细胞的发育和分化。非转化细胞在逐渐凋亡过程中分泌的毒素或生长抑制剂也会阻碍营养物
质向转化细胞的运输 J，影响转化细胞的增殖和分化。除草剂筛选延长了愈伤组织继代时间，也会使愈伤
组织生长分化能力下降。上述影响会使一些组培性状欠佳的基因型本来就很少的转化愈伤组织难以分化
成苗。对此可考虑在转化处理后不经筛选让愈伤组织直接分化成苗，之后再用除草剂筛选获得转化苗，这
样会拓宽农杆菌转化玉米可利用的基因型。
参 考 文 献
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