全 文 ：中国生态农业学报 2010年 7月 第 18卷 第 4期
Chinese Journal of Eco-Agriculture, July 2010, 18(4): 861−865


* 山西省青年基金项目(2007021037)、山西省重点实验室开放基金项目(200603021)和山西省留学人员项目(2006年 82号)资助
** 通讯作者: 乔雄梧(1959~), 男, 研究员, 博士, 主要从事农药残留分析和微生物农药的研究。E-mail: xwqiao@public.ty.sx.cn
郝变青(1975~), 女, 助理研究员, 在读博士, 主要从事植物病害生物防治研究。E-mail: haobianqing@163.com
收稿日期: 2009-08-07 接受日期: 2009-11-13
DOI: 10.3724/SP.J.1011.2010.00861
GFP标记的植物促生菌 B96-Ⅱ-gfp的定殖能力研究*
郝变青 1, 2 马利平 2 乔雄梧 2**
(1. 山西大学黄土高原研究所 太原 030006; 2. 山西省农业科学院山西省农药重点实验室 太原 030031)
摘 要 采用绿色荧光蛋白基因标记技术研究了植物促生菌 B96-Ⅱ的标记菌 B96-Ⅱ-gfp在盆栽黄瓜土壤中的
时间、空间定殖动态以及在黄瓜植株上的分布。研究表明: B96-Ⅱ-gfp在土壤中具有持久的定殖能力, 接种 180
d时在自然土和黄瓜枯萎菌病土中的定殖数量分别为 2.7×104 cfu·g−1和 6.6×104 cfu·g−1, 360 d时在土壤中仍
可检测到 B96-Ⅱ-gfp的存在。B96-Ⅱ-gfp可在盆栽植株生长土壤的表层(0~4 cm)、中层(4~8 cm)和底层(8~12 cm)
定殖, 定殖数量随土壤深度的增加而增加。此外, B96-Ⅱ-gfp还可在黄瓜的根、茎和叶上定殖, 根部定殖的数量
(7.2×104 cfu·g−1)显著高于茎部和叶部定殖的数量; 黄瓜植株体内定殖的数量多于体表定殖的数量。对土壤中
可培养的 3大微生物类群影响的研究表明: B96-Ⅱ-gfp对土壤中真菌数量具有显著抑制作用, 而对细菌和放线
菌数量则没有明显影响。防病促生试验表明: B96-Ⅱ-gfp可增加黄瓜株高、鲜重和干重, 对黄瓜枯萎病有一定
的防治效果, 且与未标记菌株 B96-Ⅱ的防病促生作用无显著差异。
关键词 植物促生菌 B96-Ⅱ-gfp 绿色荧光蛋白 定殖 枯草芽孢杆菌 防病促生
中图分类号: S432.2+9; S182 文献标识码: A 文章编号: 1671-3990(2010)04-0861-05
Colonization ability of plant growth promoting Bacillus
B96-Ⅱ-gfp labeled with GFP
HAO Bian-Qing1,2, MA Li-Ping2, QIAO Xiong-Wu2
(1. Institute of the Loess Plateau, Shanxi University, Taiyuan 030006, China; 2. Shanxi Key Laboratory of Pesticide Science,
Shanxi Academy of Agricultural Sciences, Taiyuan 030031, China)
Abstract Colonization dynamics of plant growth promoting Bacillus B96-Ⅱlabeled with GFP (B96-Ⅱ-gfp) in soils and cucumber
plants were investigated via Green Fluorescent Protein Gene Label technique. The results show that B96-Ⅱ-gfp successfully colo-
nizes in soils and cucumber plants. Total B96-Ⅱ-gfp populations are respectively 2.7×104 cfu·g−1 and 6.6×104 cfu·g−1 at 180 days
after incubation in natural soils and Fusarium wilt pathogenic soils. B96-Ⅱ-gfp is detectable in the soil even at 360 days after incu-
bation. Spatial colonization test indicates that B96-Ⅱ-gfp can colonize in the surface (0~4 cm), middle layer (4~8 cm) and lower
layer (8~12 cm) of soil, and its population density increases with soil depth. Furthermore, B96-Ⅱ-gfp colonizes in different organs of
cucumber plants, with a higher population in the interior than at the exterior surface. B96-Ⅱ-gfp population in roots is highest
(7.2×104 cfu·g−1). Whereas B96-Ⅱ-gfp significantly reduces the population of cultured native soil microorganisms (e.g., fungi), it
does not significantly influence the population of bacteria and antinomyces. The results further show that B96-Ⅱ-gfp increases the
height, fresh weight and dry weight of cucumber plants. B96-Ⅱ-gfp exhibits a certain degree of control on Fusarium wilt. Labeled
B96-Ⅱ-gfp is not significantly different from un-labeled B96-Ⅱ in terms of disease control and growth promotion.
Key words Plant growth promoting Bacillus, B96-Ⅱ-gfp, Green fluorescent protein, Colonization, Bacillus subtilis, Disease
control and growth promotion
(Received Aug. 7, 2009; accepted Nov. 13, 2009)
植物促生菌 (Plant growth promoting bacteria,
PGPB)是一类自由生活在土壤及植物根际、根表、
叶际, 对植物生长有利的细菌的统称[1]。PGPB能够
通过固氮、溶磷、溶铁, 并产生植物激素, 如生长素、
862 中国生态农业学报 2010 第 18卷


赤霉素、细胞分裂素和乙烯等植物所短缺的物质来
直接影响植物的代谢; 也可通过产生特定种类的抑
菌物限制病原菌的生长, 间接促进植物生长, 其在
农业生产中促进植物生长、防治植物病害以及环境
保护方面具有十分重要的意义[2]。在 PGPB 的推广
应用过程中 , 与植物根际促生细菌 (Plant growth
promoting rhizobacteria, PGPR)一样存在田间效果不
稳定的问题[3]。国内外大量研究结果表明, 影响细菌
在植物和土壤中定殖能力的因素主要有细菌的生理
学特征[4−6]、细菌细胞表面性质[7]、植物对根部定殖
的影响[8]、土壤结构[9]、土壤温度[10−11]和土壤 pH[12−13]
等, 这些因素的综合作用决定了细菌在根部定殖能
力的强弱, 从而也决定着生物防治的成功与失败。
因此, PGPB在引入环境的定殖微生态研究成为近年
来人们关注的重点。现代标记基因技术的建立与发
展, 为细菌定殖的微生态学研究提供了有效手段。
LacZ、gus、xylE以及 lux等标记基因已被广泛应用
于微生物的环境示踪 [14−15]。其中绿色荧光蛋白
(Green fluorescent protein, GFP)标记系统由于荧光
性能稳定、检测方便、灵敏度高以及表达不受种属
限制等特性, 而越来越为人们重视, 并被成功地用
于研究细菌在植物根部的定殖[16−17]及工程菌向环境
的释放[18]等, 然而大多定殖研究时间不足半年[17,19],
不能充分了解细菌在土壤中的长期存活状况, 周年
定殖动态研究更是鲜有报道。
山西省农药重点实验室经过 10多年的研究, 筛
选出了具有广谱防病促生功能的一批拮抗菌 , 如
BC98-I, B96-Ⅱ等 , 这些拮抗菌可以通过产生几丁
质酶和拮抗蛋白等抑菌物以及诱导植物体内的抗性
酶等方式防治黄瓜枯萎病、西瓜枯萎病、青椒枯萎
病、芦笋茎枯病等多种土传病害[20−23]。本研究采用
GFP 标记技术, 通过对土壤中和植株上标记菌的定
期回收检测, 探明植物促生菌 B96-Ⅱ在土壤中的周
年定殖动态及在黄瓜根、茎和叶上的定殖分布, 以
期为植物促生菌的生产应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
广谱拮抗菌 B96-Ⅱ是山西省农药重点实验室从
沤肥浸渍液中分离筛选到的 1 株对多种植物病原菌
具有较强拮抗作用的枯草芽孢杆菌, B96-Ⅱ-gfp 是
携带有绿色荧光蛋白基因和氯霉素抗性基因的
B96-Ⅱ标记菌株[24]。供试土壤为山西省农业科学院
蔬菜研究所实验菜园土壤 ,经山西省土壤环境与养
分资源重点试验室测定 , 土壤有机质含量 12.4
g·kg−1、全氮 0.6 g·kg−1、有效磷 8.70 mg·kg−1、
速效钾 112.5 mg·kg−1、Fe 7.91 mg·kg−1、Mn 3.54
mg·kg−1、Cu 0.90 mg·kg−1、Zn 2.23 mg·kg−1、
Ca 0.13 mg·kg−1、Mg 343.4 mg·kg−1, pH 8.80。供
试黄瓜品种为“春秋王”。
1.2 试验方法
1.2.1 菌液和黄瓜种子的准备
拮抗菌菌液的准备: 将 B96-Ⅱ和 B96-Ⅱ-gfp分
别接种于 LB(胰蛋白胨 10 g·L−1, 酵母粉 5 g·L−1,
氯化钠 10 g·L−1, pH 7.0)液体培养基中, 37 ℃、150
r·min−1振荡培养 24 h, 通过血球计数法调整两菌液
浓度均为 9.0×107 cfu·mL−1。黄瓜枯萎病病原菌
[Fusarium oxysporum (Schl.) f. sp. cucumerinum
Owen]菌液的准备: 接种新鲜培养的黄瓜枯萎病病
原菌于 PDA(马铃薯 200 g·L−1, 葡萄糖 10 g·L−1)
液体培养基中, 28 ℃、150 r·min−1振荡培养, 待孢
子大量形成时用双层灭菌纱布过滤培养液, 用无菌
水稀释成孢子含量为 8.0×104 cfu·mL−1的病原菌孢
子悬浮液。黄瓜种子表面消毒、清水漂洗后 28 ℃
催芽待用。
1.2.2 盆栽试验
盆栽用土的准备: 将土壤过 40目筛后分为 2份,
其中 1 份加入自来水制成自然土, 另 1 份加入等体
积病原菌孢子悬浮液制成带病土, 再将自然土和病
土分别平分为 3 份, 第 1 份加自来水, 第 2 份加
B96-Ⅱ培养液, 第 3 份加 B96-Ⅱ-gfp 培养液, 共 6
个处理, 装钵, 每个处理 5钵。将催芽的种子播入不
同处理中, 每钵 10 穴, 每穴 3 粒。种子出苗后常规
管理。
1.2.3 B96-Ⅱ-gfp在土壤中的定殖动态
分别于盆栽试验开始后的 0 d、1 d、7 d、10 d、
14 d、18 d、28 d、77 d、90 d、120 d、150 d、180 d、
210 d、240 d、270 d、300 d、330 d、360 d, 取 5~10
cm 层土样 , 用无菌水系列倍比稀释后 , 分别吸取
100 µL悬浮液涂布 LB氯霉素抗性平板, 37 ℃培养
24~48 h, 根据抗性平板上生长的菌落形态和荧光显微
镜下发出的荧光信号鉴定并计数 B96-Ⅱ-gfp的数量。
1.2.4 B96-Ⅱ-gfp在土壤中的垂直空间定殖
分别在黄瓜植株生长的苗期(10 d)和成株期(35
d)取盆中表层(0~4 cm)、中层(4~8 cm)和底层(8~12
cm)土样, 用无菌水系列倍比稀释后, 分别吸取 100
µL 悬浮液涂布 LB 氯霉素抗性平板 , 37 ℃培养
24~48 h, 根据抗性平板上生长的菌落形态和荧光
显微镜下发出的荧光信号鉴定并计数 B96-Ⅱ-gfp 的
数量。
1.2.5 B96-Ⅱ-gfp在黄瓜植株上的定殖
分别取各处理成株期(37 d)黄瓜的根、茎和叶,
第 4期 郝变青等: GFP标记的植物促生菌 B96-Ⅱ-gfp的定殖能力研究 863


用无菌水清洗组织表面, 洗涤液经 8 000 r·min−1、
4 ℃离心 10 min, 去上清液, 用一定体积的生理盐
水充分悬浮沉淀。分别吸取 100 µL悬浮液涂布 LB
氯霉素抗性平板, 37 ℃培养 24~48 h, 根据抗性平板
上生长的菌落形态和荧光显微镜下发出的荧光信号
鉴定并计数 B96-Ⅱ-gfp 的数量 , 以确定组织表面
B96-Ⅱ-gfp 的数量。再将不同部位的组织在 70%的
酒精中浸泡 10 s, 然后用 100 mL 无菌水冲洗 3 次,
进行表面消毒, 在无菌条件下研碎, 用无菌水系列
倍比稀释后, 分别吸取 100 µL悬浮液涂布 LB氯霉
素抗性平板, 37 ℃培养 24~48 h, 根据抗性平板上生
长的菌落形态和荧光显微镜下发出的荧光信号鉴定
并计数 B96-Ⅱ-gfp 的数量 , 以确定植株体内
B96-Ⅱ-gfp的数量。
1.2.6 B96-Ⅱ-gfp 对土壤中 3 大可培养微生物类群
的影响
土壤中细菌、真菌和放线菌分别用 LB、马丁氏
培养基(葡萄糖 10 g·L−1, 蛋白胨 5 g·L−1, 磷酸二
氢钾 1 g·L−1, 七水合硫酸镁 0.5 g·L−1, 1/300孟加
拉红 10 mL, 琼脂 18 g·L−1, 链霉素 0.03 g·L−1)和
高氏一号合成培养基(可溶性淀粉 20 g·L−1, 硝酸钾
1 g·L−1, 氯化钠 0.5 g·L−1, 磷酸氢二钾 0.5 g·L−1,
硫酸镁 0.5 g·L−1, 硫酸亚铁 0.01 g·L−1, 琼脂 18
g·L−1, pH 7.2~7.4)培养。分别在播种后的 0 d、14 d
和 28 d打孔挖取 5~10 cm的各处理盆栽土壤, 用无
菌水系列倍比稀释后, 吸取 100 µL悬浮液涂布 3种
平板, 28 ℃培养, 观察并计数平板上的菌落数。
1.2.7 B96-Ⅱ-gfp对黄瓜植株生长的影响
分别在黄瓜植株生长的苗期(16 d)和成株期(35 d)
调查盆钵中黄瓜苗的株高、鲜重、干重和枯死株数。
1.3 数据统计分析方法
数据采用 Excel 2003和 SPSS 10.0软件分析。
2 结果与分析
2.1 B96-Ⅱ-gfp在土壤中的时间定殖规律
通过对土壤中标记菌的定期回收检测, 探明了
B96-Ⅱ-gfp在土壤中的长期定殖规律(图 1)。接种 1 d
时, B96-Ⅱ-gfp 在自然土壤中定殖的数量为 3 486.6
cfu·g−1(干土), 定殖率为 0 d时的 0.38%, 存活数量
显著下降。此后 B96-Ⅱ-gfp 在土壤中定殖的数量呈
波浪状趋势变化。经对 1 d、7 d、10 d、⋯、360 d
等 17组自然土壤中定殖的B96-Ⅱ-gfp数据的多重分
析比较, 与 1 d时土壤中的数量相比, 1~10 d、14~28
d和 120~180 d时土壤中B96-Ⅱ-gfp的数量呈显著上
升趋势, 180 d 时自然土 B96-Ⅱ-gfp 数量为 2.7×104

图 1 B96-Ⅱ-gfp在土壤中的时间定殖动态
Fig. 1 Temporal dynamics of B96-II-gfp colonization in soil

cfu·g−1(干土); 300~360 d时土壤中 B96-Ⅱ-gfp的数
量则显著减少, 其余时间 B96-Ⅱ-gfp 的数量呈下降
趋势, 但与 1 d时的数量无显著差异。B96-Ⅱ-gfp在
黄瓜枯萎菌病土中的定殖动态与在自然土中的定殖
规律类似。对自然土和病土中定殖的 B96-Ⅱ-gfp 数
量的独立样本 t-测验表明, 在 0~360 d 的 18 组 t-
测验中, 除 14 组差异不显著外, 还有 4 组差异显著
(7 d、77 d、90 d和 180 d), 可见土壤中病原菌的存
在对 B96-Ⅱ-gfp的定殖还是有一定的影响。
2.2 B96-Ⅱ-gfp在土壤中定殖的垂直空间规律
分别在盆栽黄瓜植株生长的苗期(10 d)和成株
期(35 d)取表层、中层和底层土样进行回收检测。结
果表明: 在盆钵的表层、中层和底层土壤均可检测
到 B96-Ⅱ-gfp的存在; 10 d时表层、中层和底层土壤
中检测到的 B96-Ⅱ-gfp 数量的比例为 1︰1.8︰2.7,
35 d时土壤中 B96-Ⅱ-gfp的数量比 10 d时显著减少,
但底层 B96-Ⅱ-gfp 的数量与表层数量的比例却显著
增加, 表层、中层和底层土壤中 B96-Ⅱ-gfp 数量的
比例变为 1︰2.4︰4.3(图 2)。这表明在盆栽植株生长
过程中, B96-Ⅱ-gfp 在不同深度土层的定殖数量随
土壤深度增加而增加。


图 2 B96-Ⅱ-gfp在不同深度土壤的定殖规律
Fig. 2 Colonization of B96-II-gfp in different depths of soil
864 中国生态农业学报 2010 第 18卷


2.3 B96-Ⅱ-gfp在植株中的定殖状况
黄瓜成株期(37 d)的检测结果表明 , 标记菌株
B96-Ⅱ-gfp 在黄瓜的根、茎和叶上均能定殖。
B96-Ⅱ-gfp 在自然土中种植的黄瓜根部的定殖数量
(7.2×104 cfu·g−1)最多, 其次为茎部(143.3 cfu·g−1),
叶部定殖的数量最少 (6.6 cfu·g−1); 体内定殖的
B96-Ⅱ-gfp 的数量多于体表定殖的数量, 在根内定
殖的 B96-Ⅱ-gfp 数量(7.0×104 cfu·g−1)远大于根表
(2.3×103 cfu·g−1), 茎内部定殖的 B96-Ⅱ-gfp 数量
(93.3 cfu·g−1)是茎表面 B96-Ⅱ-gfp数量的 2倍, 而
在叶部的内外定殖 B96-Ⅱ-gfp 数则相近。在接种黄
瓜枯萎病病原菌的土壤中, 黄瓜根、茎和叶部的标
记菌数量分别为 1.5×105 cfu·g−1、686 cfu·g−1和 74
cfu·g−1, 显著高于自然土中生长的黄瓜同一部位标
记菌数量。其中，根内定殖的 B96-Ⅱ-gfp 数量
(1.0×105 cfu·g−1)是根表面 B96-Ⅱ-gfp的 2倍(5 333
cfu·g−1), 茎内部定殖的 B96-Ⅱ-gfp数量(566 cfu·g−1)
是茎表面的 4.7 倍(120 cfu·g−1), 而在叶内定殖的
B96-Ⅱ-gfp数量(67 cfu·g−1 )远大于叶表(6.7 cfu·g−1)
的定殖数量。
2.4 B96-Ⅱ-gfp对土壤中 3大微生物类群的影响
0 d时由于 B96-Ⅱ-gfp的添加, B96-Ⅱ-gfp处理
的土壤中细菌数量显著大于对照, 但在随后的 14 d
和 28 d时, 处理与对照土壤中细菌数量无显著差异
(图 3a)。
土壤中真菌数量随培养时间推移呈逐渐上升趋
势, 28 d时对照土壤中真菌数量比 0 d时增加 3.0倍,
而 B96-Ⅱ-gfp 处理土壤中真菌生物量只增加 1.4 倍,
表明 B96-Ⅱ-gfp抑制了土壤中真菌的生长(图 3b)。
土壤中放线菌数量随培养时间推移也呈总体上
升趋势, 但 3 次取样检测均表明, B96-Ⅱ-gfp 处理与
对照土壤中放线菌数量差异不显著, 说明 B96-Ⅱ-gfp
的加入未对土壤放线菌数量产生显著影响(图 3c)。
2.5 B96-Ⅱ-gfp对黄瓜植株生长的影响
研究表明(表 1), 在人工加入黄瓜枯萎菌孢子悬
浮液后, 对照及标记菌 B96-Ⅱ-gfp 处理的盆栽黄瓜
均发病明显, 但标记菌 B96-Ⅱ-gfp 处理的盆土中黄
瓜植株的发病率显著低于未加标记菌 B96-Ⅱ-gfp 的
对照, 防治效果为 57.1%; 且标记菌B96-Ⅱ-gfp处理
的黄瓜株高、鲜重和干重与对照相比均有不同程度
地增加, 特别是成株期(35 d), 黄瓜株高、鲜重和干
重分别增加 18.8%、55.2%和 46.2%。另外, 标记菌
对黄瓜的防病促生作用与未经标记的出发菌 B96-Ⅱ
相比无显著差异。
3 讨论
本研究表明, B96-Ⅱ-gfp 可在盆栽土壤中长期
稳定定殖。与自然土壤相比, 病土中黄瓜枯萎菌的
引入对标记菌 B96-Ⅱ-gfp 的定殖产生了一定影响。
定殖前期, 病土中 B96-Ⅱ-gfp 数量等于或少于自然
土中的数量, 但经过较长时间的定殖后, 病土中标
记菌数量反而等于或多于自然土中的数量, 这暗示
黄瓜枯萎菌与标记菌 B96-Ⅱ-gfp 之间可能存在某种
特殊感应。有报道表明病原真菌和潜在的生防细菌


图 3 B96-Ⅱ-gfp对土壤可培养微生物数量的影响(a: 细菌; b: 真菌; c: 放线菌)
Fig. 3 Effects of B96-Ⅱ-gfp on the amount of cultured microorganism in soil (a: bacteria; b: fungi; c: antinomyces)

表 1 B96-Ⅱ-gfp对黄瓜植株生长的影响及其防治黄瓜枯萎菌的效果
Tab. 1 Effects of B96-Ⅱ-gfp on growth of cucumber and its control effects on cucumber Fusarium wilt
处理
Treatment
时间
Time
(d)
株高
Plant height
(cm)
鲜重
Fresh weight
(g·plant −1 )
干重
Dry weight
(g·plant−1)
发病率
Incidence of disease
(%)
防治效果
Control effi-
ciency (%)
对照 Control 12.3±0.3a 0.90±0.04a 0.041±0.003a 28±2a —
B96-Ⅱ 14.2±0.3b 1.08±0.09ab 0.046±0.005a 11±0b 60.7
B96-Ⅱ-gfp
16
13.6±0.4b 1.14±0.03b 0.048±0.001a 12±1b 57.1
对照 Control 14.9±0.4a 1.16±0.08a 0.117±0.006a 31±3a —
B96-Ⅱ 18.5±0.3b 1.68±0.08b 0.154±0.009b 13±1b 58.1
B96-Ⅱ-gfp
35
17.7±0.2b 1.80±0.05b 0.171±0.005b 16±1b 48.4
第 4期 郝变青等: GFP标记的植物促生菌 B96-Ⅱ-gfp的定殖能力研究 865


间有信号传输, 德巴利腐霉(Pythium debaryanum)产
生的海藻糖是其生防菌荧光假单胞菌 ATTC17400
的正调节因子 [25]; 但甜菜根围的终极腐霉(P. ulti-
mum)对其生防菌株荧光假单胞菌 F113 的 5 个基因
片段有负调节作用[26]。由此可推断黄瓜枯萎菌也可
能产生某种特殊信号, 对其生防菌 B96-Ⅱ-gfp 进行
调控, 但这还需进一步证实和研究。
防治土传病害的理想拮抗菌不仅要求拮抗能力
强, 而且要求生活力强, 能在寄主植株根部和土壤
中成功定殖。本试验表明, 拮抗菌株 B96-Ⅱ-gfp 在
土壤及黄瓜植株中具有较强的持久定殖能力, 这对
病害的防治有积极作用。同时研究还发现, 在定殖
的冬季 12~2 月(90~150 d), 白天最高土壤温度都在
0 ℃以下, 但 B96-Ⅱ-gfp的数量与 1 d(9月 12日)时
相比并未显著减少, 反而随时间推移当土壤温度逐
步升高时(第 2 年 2~9 月), 其数量却呈逐渐下降趋
势。Loper等[11]的研究表明, Pseudomonas的两个株
系在马铃薯根围定殖最佳温度为 12 ℃或 18 ℃, 但
这两个株系生长的最适温度是 28 ℃或 30 ℃。
Gutterson 等[10]发现 P. fluorescence 的菌株 Hv37 在
16 ℃或 20 ℃时能有效地在棉花根围定殖, 但如
果温度升到 24 ℃, 它的根围种群密度会下降 100
倍。这些现象即引入微生物在土壤的定殖数量随土
壤温度的升高而减少, 可能的原因是较低温度下土
著微生物的活动受到影响, 从而有利于引入微生物
的定殖。由此表明拮抗菌在环境中的定殖能力与温
度有密切关系, 这对于指导生防菌的田间应用具有
重要意义。
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