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九种蔷薇科植物叶片的傅里叶红外光谱与亲缘关系分析



全 文 :第3 4卷,第2期             光 谱 学 与 光 谱 分 析 Vol.34,No.2,pp344-349
2 0 1 4年2月             Spectroscopy and Spectral Analysis  February,2014  
九种蔷薇科植物叶片的傅里叶红外光谱与亲缘关系分析
邱 璐1,李晓勇1,刘 鹏2,范树国1,谢美华1,刘仁明3,周林宗4,王 静5
1.楚雄师范学院化学与生命科学系,云南 楚雄 675000
2.楚雄师范学院数学系,云南 楚雄 675000
3.楚雄师范学院电子与物理科学系,云南 楚雄 675000
4.楚雄师范学院地理系,云南 楚雄 675000
5.楚雄师范学院图书馆,云南 楚雄 675000
摘 要 以蔷薇科三个亚科九种植物的叶为材料,利用傅里叶变换红外光谱法对九种植物进行亲缘关系分
析和品种鉴定。叶中主要含有大量的碳水化合物、蛋白质、脂类、核酸等物质。糖类物质的峰主要在1 440~
775cm-1之间,1 440~1 337cm-1为纤维素、木质素的振动峰,1 000~775cm-1为核糖的伸缩振动。蛋白质
的峰主要在1 620~1 235cm-1之间,1 620cm-1为蛋白质酰胺Ⅰ带的 C O 伸缩振动,1 523cm-1为蛋白
质酰胺Ⅱ带N—H和C—N吸收峰。脂类物质的峰主要出现在2 930~1 380cm-1之间,2 922cm-1为脂肪
CH2 的伸缩振动,1 732cm-1是脂肪酸 C O 的伸缩振动。核酸的标志峰出现在1 250~1 000cm-1,1 068
cm-1是磷酸基团的对称伸缩振动,1 246cm-1是磷酸基团的不对称伸缩振动。研究结果表明:FTIR光谱数
据经平滑、标准化处理、二阶求导、主成分分析和系统聚类建立的聚类分析模型与传统分类结果相一致。
杏、樱桃聚为一类(李亚科),翻白叶、月季、草莓聚为第二类(蔷薇亚科),火棘、苹果、枇杷、海棠聚为第三
类(苹果亚科),亚科聚类正确率为100%,但属聚类的正确率仅为55.56%。利用该聚类模型进行物种鉴定
正确率为100%。该项研究为植物的亲缘关系分析提供了新的思路与方法。
关键词 傅里叶变换红外光谱(FTIR);蔷薇科;主成分分析;系统聚类;亲缘关系;物种鉴定
中图分类号:O657.3  文献标识码:A   DOI:10.3964/j.issn.1000-0593(2014)02-0344-06
 收稿日期:2013-06-27,修订日期:2013-10-21
 基金项目:云南省重点建设学科项目(05YJJSXK03),云南省高校科技创新团队项目(IRTSTYN),国家自然科学基金项目(11064001)资助
 作者简介:邱 璐,女,1965年生,楚雄师范学院化学与生命科学系教授  e-mail:qiulu@cxtc.edu.cn
引 言
  傅里叶变换红外光谱法(Fourier transform infrared spec-
troscopy FTIR)是一种振动吸收光谱,是由于分子中的基团
或化学键吸收能量产生振动而形成的吸收光谱。它是物质分
子定性分析与定量分析常用的一种方法。由于需要的样品量
少、操作快速简单以及灵敏度高等特点,被广泛地运用于化
学、生物学、食品科学等领域。如中药材真品与伪品的鉴
定[1],同一个物种不同品种的辨别[2],植物化学成分的鉴
定[3],植物病害的诊断[4],转基因植物与非转基因植物的区
别,同种植物不同产地的鉴别,植物性产品质量等[5]。
对于古老的形态学分类而言,新兴的化学分类对传统植
物分类进行了补充。植物化学分类是反映植物类群在分子水
平上的差异,是以分子、细胞、整体三级水平上的综合研究
来寻找符合自然的植物类群的亲缘关系,阐明植物进化历
史,建立自然的植物分类系统。植物的化学物质主要有核
酸、蛋白质、酶、碳水化合物、脂类、生物碱、植物激素等。
其中蛋白质、酶,特别是核酸可以作为鉴别植物类群及其亲
缘关系的主要依据[6]。
红外光谱法进行植物的分类,主要根据不同类群的植物
具有不同的植物化学成分,进而产生不同的红外光谱,与化
学分类学有相近之处。但是,化学分类学是以某些次生代谢
产物的有无和结构差异为指标进行分类,而红外光谱所反映
的是分子中的某些基团或化学键[7],例如甲基、亚甲基、羰
基、氰基、羟基和胺基等,其图谱的差异反映了分子组成上
的差异。红外光谱分类与直接以某些次生代谢产物进行的分
类,存在一定差别。
应用FTIR来探讨不同分类群间的亲缘关系已有很多报
道,涉及的类群众多,主要有被子植物,蕨类植物、苔藓植
物等[8]。有人使用植物的叶作为FTIR的实验材料,还有人
用植物的种子作为实验材料,有人用花瓣、根、茎、木质
部[9]等作为实验材料。
蔷薇科植物分类明确,具有重要的经济价值,是重要的
观赏花卉与果树类植物。采用傅里叶变换红外光谱(FTIR)
结合主成分分析对蔷薇科不同亚科及属的九种植物的鉴别分
类未见报道。
1 实验部分
1.1 材料
实验材料均采自云南省楚雄市西山公园,经邱璐教授鉴
定。精选生长环境、生理状态高度一致的植物枝条中部叶片
作为实验材料。
九种植物隶属于蔷薇科三个亚科的8个属,包括苹果亚
科苹果属的垂丝海棠(Malus hallianna Koehne),苹果属的
苹果(Malus pumila Mil.),苹果亚科枇杷属的枇杷(Erio-
botrya bengalensis Hook.f.),苹果亚科火棘属的火棘(Pyra-
cantha fortuneana Li.);蔷 薇 亚 科 月 季 属 的 月 季 (Rosa
chinensis Jacd.),蔷薇亚科草莓属的草莓(Fragaria ananassa
Duchesne var.ananassa Duchesne),蔷薇亚科委陵菜属的翻
白叶 (Potentilla fulgens Wal.);李亚科樱桃属的樱桃
(Prunus seudocerasus Lindl.),李亚科杏属的杏(Prunus ar-
meniaca L.)。
1.2 方法
1.2.1 叶片干粉的制备
将叶片置于40℃下烘48h,充分去除水分后,研磨成粉
末待测。
1.2.2 傅里叶红外光谱的测定
使用BIO-RAD公司的TRAffinity-1型傅里叶变换红外
光谱仪,光谱范围4 000~400cm-1,分辨率4cm-1,扫描速
度10kHz,扫描次数20次。
将所测样品以0.5/50mg的比例用玛瑙研钵研磨均匀,
采用KBr压片法进行傅里叶红外光谱测定。同一种植物测定
4个样品,其中3个用于计算平均光谱,进行聚类模型建模。
另一个作为待测样,用于鉴定。
1.2.3 数据的预处理
光谱数据进行FFT Filte平滑5点处理,以消除机器噪
音。对平滑后的光谱数据进行Divided by SD标准化处理,然
后进行二阶求导,以消除样品浓度及基线的影响。提取主成
分,利用主成分建立聚类标准模型。
使用 Origin 8.0软件作图,Mathworks Matlab R2010a
提取主成分,PASW Statistics 18.0建立聚类标准模型。
2 结果与讨论
2.1 九种蔷薇科植物叶片FTIR光谱图的定性分析
蔷薇科不同亚科的九种植物叶的傅里叶红外光谱(图1)
较为相似,在峰位1 620,1 064,615cm-1均有三个明显的透
过峰,另外,在1 732,1 523,1 444,1 317,1 246,615cm-1
也有峰。但九种植物的叶片的红外光谱2 000~400cm-1(图
2)区域有明显的差异,有的植物波峰蓝移(如1 620cm-1),
有的红移(如1 645cm-1);有的峰明显(如1 620cm-1),有
的峰不明显(如1 444cm-1)。
Fig.1 Fourier infrared spectra of the leaves of nine kinds
of plants from Rosaceae(4 000~400cm-1)
1:Pipa;2:Pingguo;3:Huoji;4:Caomei;5:Fanbaiye;
6:Haitang;7:Yingtao;8:Yueji;9:Xing
Fig.2 Fourier infrared spectra(2 000~400cm-1)
1:Pipa;2:Pingguo;3:Huoji;4:Caomei;5:Fanbaiye;
6:Haitang;7:Yingtao;8:Yueji;9:Xing
2.2 叶片FTIR光谱数据主成分分析(PCA)
单因素的差异显著性分析,结果显示,Sig.=0.027<
0.05,可知,九种植物叶片的FTIR光谱数据差异显著(图
3)。
主成分分析能有效地对光谱数据进行降维,从而简便计
算。以第一主成分(PC1)、第二主成分(PC2)、第三主成分
(PC3)为X、Y、Z轴,建立了主成分3D散点图(图3)。3D散
点图可以把九种植物大致归为三大类,第一类包含4个样
品,第二类包含三个样品,第三类包含两个样品(图4)。
543第2期                    光谱学与光谱分析
Fig.3 Mean plot of leaves FTIR data of nine
kinds of plants from Rosaceae
Fig.4 3Dscatter plot of principal component
of nine plants from Rosaceae
2.3 叶片FTIR光谱数据聚类分析模型的建立
  聚类分析又称集群分析,聚类分析可将一些观察对象依
据某些特征加以归类,它是研究“物以类聚”的一种数理统计
方法,在生物学和医学分类中有着广泛的应用[17]。
红外光谱记录了9个样品在4 000~400cm-1区域内的
透过曲线,从图中可看出,九种植物在4 000~2 000cm-1区
域的响应模式基本上是相同的,但在2 000~400cm-1区域
有明显不同,正是这些不同才使聚类分析成为可能,此区域
以外的光谱对于表征样品的作用微小。为了减少计算量,仅
选择2 000~400cm-1区域作为以下聚类分析的数据范围。
将数据经平滑、标准化处理,二阶求导后进行系统聚
类,结果如图5所示。图中杏(2号)、樱桃(3号)被聚为一
类,与 传 统 分 类 相 比,杏、樱 桃 都 是 蔷 薇 科 李 亚 科
(Prunoideae)植物,聚类正确。
  翻白叶(1号 )、月季(7号)、草莓(4号)被聚为一类,与
传统分类相比,它们都是蔷薇科蔷薇亚科(Rosoideae)的植
物,聚类正确。
火棘(5号)、苹果(8号)、海棠(6号)、枇杷(9号)被聚
为一类,与传统分类相比,它们都是蔷薇科苹果亚科(Po-
moideae)的植物,聚类正确。二阶导数系统聚类的正确率为
100%。该结果与3D散点图、单因素方差分析结果一致。
Fig.5 Hierarchical clustering results of the second derivative
of leaves FTIR of nine kinds of plants from Rosaceae
(standard cluster analysis model)
1:Fanbaiye;2:Xing;3:Yingtao;4:Caomei;5:Huoji;
6:Haitang;7:Yueji;8:Pingguo;9:Pipa
Fig.6 Clustering result of species identification
of nine kinds of plants from Rosaceae
1:Fanbaiye;2:Xing;3:Yingtao;4:Caomei;5:Huoji;
6:Haitang;7:Yueji;8:Pingguo;9:Pipa
2.4 亲缘关系分析
根据标准聚类分析模型可知,亲缘关系最近的是杏(2
号)和樱桃(3号),它的聚类距离系数是0.001 9(表1),为模
型中的最小距离系数,这与传统分类相一致。在传统分类中
杏和樱桃不仅是同一亚科的植物,还是同一个属的植物,它
们都是蔷薇李亚科(Prunoideae)李亚属(Prunus)的植物。因
此,这二种植物在亚科级别及属的级别上聚类正确。
  翻白叶(1号)、草莓(2号)、月季(7号)被聚为一类,与
传统分类相比,它们都是蔷薇科蔷薇亚科(Rosoideae)的植
物,聚类正确。它们分属三个属。图5显示,翻白叶属(Po-
tentila)的翻白叶与草莓属的(Fragaria)草莓聚为更小的一个
小类(距离系数为0.256),而与月季属(Rosa)的月季距离更
643 光谱学与光谱分析                    第34卷
远(距离系数为5.280)。这与传统分类相一致,在传统分类
中,翻白叶属与草莓属的亲缘关系更近,与月季属的亲缘关
系略远。因此,这三种植物在亚科级上的聚类是正确的,在
属的级别聚类也正确。
Table 1 Cluster distance coefficients schedule
of nine kinds of plants from Rosaceae
Stage
Cluster combined
Cluster 1 Cluster 2
Coefficients
1  2  3  0.001
2  1  4  0.256
3  5  8  0.866
4  5  6  2.760
5  1  7  5.280
6  5  9  8.893
7  1  2  20.295
8  1  5  70.204
  火棘(5号)、苹果(8号)、海棠(6号)、枇杷(9号)被聚
为一类,与传统分类相比,它们都是蔷薇科苹果亚科(Po-
moideae)的植物,在亚科级别上聚类正确。但苹果与海棠不
仅是同一个亚科的植物,而且还是同一个属(苹果属 Malus)
的植物,它们应该聚在同一个小类,但图5却将苹果与海棠
分开(距离系数为1.894),而将苹果与另一个属的火棘(火棘
属Pyracantha)错误地聚为一个小类(距离系数为0.866)。另
外,传统分类中,火棘属与枇杷属的亲缘关系近于苹果属,
但图5的聚类结果刚好相反。因此,这四种植物在亚科级别
的聚类正确,但在属的级别聚类不完全正确。
综上所述,分属三个亚科的九种蔷薇科植物,在亚科级
别的聚类正确率为100%,在更小单位属级别的聚类正确率
为55.56%。
2.5 物种鉴定
取待测组样品,分别编号为X1,X2,X3,X4,X5,X6,
X7,X8,X9,将以上待测叶片FTIR数据经过平滑、标准化
处理、二阶求导,放入已建立的标准聚类模型(图5)中进行
聚类。图6结果显示,X1与翻白叶聚在一起,距离系数为
0.000,可以判定X1就是翻白叶;X2与杏聚在一起,距离系
数为0.000,鉴定出X2为杏;X3与樱桃聚在一起,距离系
数为0.000,可鉴定出X3为樱桃;X4与草莓聚在一起,距
离系数为0.000,可以鉴定出X4为草莓;X5与火棘聚在一
起,距离系数为0.000,可以鉴定出X5为火棘;X6与海棠
聚在一起,距离系数为0.000,可鉴定出X6为海棠;X7与
月季聚在一起,距离系数为0.000,故X7就是月季;X8与
苹果聚在一起,距离系数为0.000,X8为苹果 ;X9与枇杷
聚在一起,距离系数为0.000,故X9为枇杷。
在系统聚类中,亲缘关系近的植物之间聚类距离系数很
小,同种植物之间的聚类距离系数几乎为零。故使用植物的
傅里叶红外光谱标准聚类分析模型,可以用来鉴定待测植
物。
叶中主要含有大量的碳水化合物、蛋白质、脂类、核酸
等物质,叶FTIR的各峰主要由以上物质所致。叶片中脂类
植物的峰主要出现在2 930~1 380cm-1之间,其中2 922
cm-1被指认为脂肪CH2 的伸缩振动,1 732cm-1是脂肪酸
羰基 C O 的伸缩振动,1 624cm-1归属为酯类羰基
C O 的伸缩振动吸收,1 381cm-1是各种膜和胞壁含油脂
化合物的甲基C—H的变形振动峰[3,10,11]。
蛋白质的峰主要出现在1 620~1 235cm-1之间,其中
1 620cm-1被指认为蛋白质酰胺Ⅰ带羰基的 C O 伸缩振
动及木质素的C—O伸缩振动,1 523cm-1被指认为蛋白质
酰胺Ⅱ带N—H和C—N吸收峰,1 235cm-1,指认为蛋白
质酰胺Ⅲ带的C—O吸收[12,13]。
糖类物质的峰主要出现在1 440~775cm-1之间,其中
1 440~1 337cm-1被指认为纤维素,木质素等受氧、氮原子
影响的甲基和亚甲基对称弯曲振动及CH3 剪式振动,1 245
cm-1被指认为木质素中苯羟基中 C—O 键的伸缩振动,
1 200~1 030cm-1为碳水化合物(纤维素,半纤维素)C—O
和C—C伸缩振动,1 049cm-1是糖类物质醇、酯基、醚基或
酚类的的C—O和C—C吸收 ,930~900cm-1,以及785~
755cm-1是碳水化合物的糖环伸缩振动,其中895cm-1附近
为纤维素的环振动产生的C—H变形峰,830cm-1附近为木
质素中C—H平面弯曲振动碳水化合物吸收[5,14]。
核酸主链的标志峰主要出现在1 250~1 000cm-1,
1 068cm-1是磷酸基团的对称伸缩振动,1 246cm-1是磷酸
基团的不对称伸缩振动。见表2。
Table 2 Assignment of peaks of leaves FTIR of nine kinds of plants from Rosaceae
Wavenumber/cm-1  Assignment  Wavenumber/cm-1  Assignment
3 414 —OH,—NH2振动吸收[10-14] 2 922 脂肪CH2的伸缩振动[10-14]
2 855 亚甲基CH2的对称伸缩振动[10-14] 1 732 脂肪酸羰基的 C O 伸缩振动[10-14]
1 620
蛋白质酰胺Ⅰ带羰基的 C O 伸缩
振动及木质素的C—O伸缩振动[10-14]
1 523 蛋白质酰胺Ⅱ带N—H和C—N吸收峰[10-14]
1 440~1 337
纤维素,木质素等受氧、氮原子影响的甲基和亚
甲基对称弯曲振动及CH3剪式振动[10-14]
1 381
各种膜和胞壁含油脂化合物
的甲基C—H的变形振动峰[10-14]
1 246
磷酸基团的不对称伸缩振动及木质素中
苯羟基中C—O键的伸缩振动[10-14]
1 235 蛋白质酰胺Ⅲ带的C—O吸收[10-14]
1 200~1 030
1 046
1 049
碳水化合物(纤维素,半纤维素)、C—O和C—C伸缩振动[10-14]
磷酸基团的对称伸缩振动[10-14]
糖类物质醇、酯基、醚基或酚类的的C—O,C—C吸收[10-14]
930~900
785~755
碳水化合物的糖环伸缩振动,其中895cm-1
附近为纤维素的环振动产生的C—H变形峰,830cm-1
附近为木质素中C—H平面弯曲振动碳水化合物吸收[10-14]
743第2期                    光谱学与光谱分析
3 结 论
  应用傅里叶变换红外光谱测定蔷薇科3个亚科7个属九
种植物叶片样品的光谱图,FTIR光谱数据经平滑、标准化
处理、二阶求导、主成分分析和系统聚类建立的聚类分析模
型与传统分类结果相一致。杏、樱桃聚为一类(李亚科),翻
白叶、月季、草莓聚为第二类(蔷薇亚科),火棘、苹果、枇
杷、海棠聚为第三类(苹果亚科),亚科聚类正确率为100%,
但属聚类的正确率仅为55.56%。利用聚类模型进行品种鉴
定正确率为100%。结果说明,FTIR光谱可用物植物分类及
亲缘关系的分析、品种鉴定。
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Analysis of Leave FTIR of Nine Kinds of Plants from Rosaceae with
Genetic Relationship
QIU Lu1,LI Xiao-yong1,LIU Peng2,FAN Shu-guo1,XIE Mei-hua1,LIU Ren-ming3,ZHOU Lin-zong4,WANG Jing5
1.Department of Chemistry and Life Science,Chuxiong Normal University,Chuxiong 675000,China
2.Department of Mathematics of Chuxiong Normal University,Chuxiong 675000,China
3.Department of Physics and Electronics Science,Chuxiong Normal University,Chuxiong 675000,China
4.Department of Geography Science of Chuxiong Normal University,Chuxiong 675000,China
5.Library of Chuxiong Normal University,Chuxiong 675000,China
Abstract Leaves of nine kinds of plants from three subfamily of Rosaceae were used as materials.Genetic relationship was ana-
lyzed and species were identified through studying FTIR of nine kinds of plants.Leaves mainly contain large amounts of carbohy-
drates,proteins,lipids,nucleic acids and other substances.The peaks of carbohydrates are mainly between 1 440and 775cm-1.
The vibration peaks of the celulose and lignin are between 1 440and 1 337cm-1.The peaks between 1 000and 775cm-1 are
stretching vibration of ribose.The vibration peaks of protein are between 1 620and 1 235cm-1.The peak at 1 620cm-1 is sen-
sitive to C O stretching vibration of protein a mide Ⅰ.The peak at 1 523cm-1 is assigned to N—H and C—N stretching vi-
bration of protein amideⅡ.Peaks of lipids mainly appeared between 2 930and 1 380cm-1.The peak at 2 922cm-1 is CH2
stretching vibration of fat.The peak at 1 732cm-1 is C O stretching vibration of fatty acids.The mark peak of the nucleic
843 光谱学与光谱分析                    第34卷
acid appears in the region between 1 250and 1 000cm-1.The peak at 1 068cm-1 is due to the symmetric stretching vibration of
PO2- group of the phosphodiester-deoxyribose backbone,and the peak at 1 246cm-1 is associated to the asymmetric stretch vi-
bration of PO2-group.The results showed that the cluster model is established by smoothing,standardizing,the second deriva-
tive,principal component analysis and Hierarchical cluster analysis.It is accordant with the traditional classification.The result
of cluster shows that Prunus armeniaca L.and Prunus seudocerasus Lindl.were clustered into one(Prunoideae).Potentilla
fulgens Wal.Rosa chinensis Jacd and Fragaria ananassa Duchesne var.were clustered into the second(Rosoideae).Pyracan-
tha fortuneana Li,Malus pumila Mil.Eriobotrya bengalensis Hook.f.and Malus hallianna Koehne were clustered into the
third(Pomoideae).The correct rate of cluster at subfamily is 100%.The correct rate of cluster at genus is 55.56%.The cor-
rect rate of identification is 100% when unknown species waiting for determined were laid into the model of Hierarchical cluster
to identify.This study provides a new thought and method for genetic relationship analysis of planst.
Keywords Fourier transform infrared spectroscopy(FTIR);Rosaceae;Principal component analysis(PCA);Hierarchical clus-
ter analysis(HCA);Genetic relationship;Identification
(Received Jun.27,2013;accepted Oct.21,2013)  
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《光谱学与光谱分析》2 0 1 4年征订启事
国内邮发代码:82-68     国外发行代码:M905
《光谱学与光谱分析》1981年创刊,国内统一刊号:CN 11-2200/O4,国际标准刊号:ISSN 1000-
0593,CODEN码:GYGFED,国内外公开发行,大16开本,292页,月刊;是中国科协主管,中国光学
学会主办,钢铁研究总院、中国科学院物理研究所、北京大学、清华大学共同承办的学术性刊物。北京大
学出版社出版,每期售价45.00元,全年540元。刊登主要内容:激光光谱测量、红外、拉曼、紫外、可
见光谱、发射光谱、吸收光谱、X射线荧光光谱、激光显微光谱、光谱化学分析、国内外光谱化学分析领
域内的最新研究成果、开创性研究论文、学科发展前沿和最新进展、综合评述、研究简报、问题讨论、书
刊评述。
《光谱学与光谱分析》适用于冶金、地质、机械、环境保护、国防、天文、医药、农林、化学化工、商
检等各领域的科学研究单位、高等院校、制造厂家、从事光谱学与光谱分析的研究人员、高校有关专业的
师生、管理干部。
《光谱学与光谱分析》为我国首批自然科学核心期刊,中国科协优秀科技期刊,中国科协择优支持基础
性、高科技学术期刊,中国科技论文统计源刊,“中国科学引文数据库”,“中国物理文摘”,“中国学术期刊
文摘”,同时被国内外的CSCD,SCI,AA,CA,Ei,РЖ,MEDLINE,Scopus等文献机构收录。根据国
家科技部信息研究所发布信息,中国科技期刊物理类影响因子及引文量 《光谱学与光谱分析》都居前几位。
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《光谱学与光谱分析》的主编为高松院士。
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943第2期                    光谱学与光谱分析