全 文 ：第 30卷　第 3期 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) Vol. 30 No. 3
2002年 6月 Jour. of No rthw est Sci-Tech Univ . o f Ag ri. a nd Fo r. ( Na t. Sci. Ed. ) June 2002
河南省豆科植物根瘤菌表型多样性研究
韦革宏 1 ,刘虎岐2 ,孙科技 1 ,郝鲜俊 1 ,陈文新 3
( 1西北农林科技大学资源环境学院 ; 2生命科学学院 ,陕西 杨陵 712100; 3中国农业大学生物学院 ,北京 100094)
　　 [摘　要 ]　在河南省根瘤菌资源调查的基础上 ,选取 29株快生根瘤菌和 34株参比菌株 ,进行了 102项表型性
状测定和聚类分析。 结果表明: 不同地理来源、甚至同一地理来源或同种寄主的不同菌株在碳氮源利用、抗生素抗
性、耐逆性等方面存在着较大的多样性。有 7株菌对链霉素、青霉素和白霉素有较强的耐受性 ;有 23株和 25株菌可
分别耐受 2. 0 g /L的香酚兰和中性红 ;有 2株菌可在含 50 g /L NaCl的 YM A培养基上生长 ;有 6株菌在 p H值 11
条件下能够生长。 在 84%的相似性水平上未知菌株构成了 2个独立的表观群 ,其中 Cluste r 1有 7株菌 ,中心菌株
为 H038; Cluster 2有 3株菌 ,中心菌株为 H026。
[关键词 ]　豆科植物 ;根瘤菌 ;表型性状 ;表型多样性 ;河南省
[中图分类号 ]　 Q939. 11+ 4. 09　　　　 [文献标识码 ]　 A [文章编号 ]1000-2782( 2002) 03-0071-05
　　河南省位于东经 110°21′～ 116°39′,北纬
31°23′～ 36°32′。 地势西高东低 ,北、西、南三面山地
环抱 ,东部为辽阔平原 ,属暖温带和北亚热带大陆性
季风气侯 ,冬季寒冷少雨 ,春季干旱 ,风沙多 ,夏季多
雨且丰沛 ,秋季晴和日照长 ,生物资源丰富。据估计 ,
全世界豆科植物有近 2万种 ,而对其根瘤进行详细
研究的不过 5% 。目前 ,对该省根瘤菌资源的系统调
查和分类研究尚未见报到。 本试验在广泛调查根瘤
菌资源的基础上 ,选用经分离纯化、回接原寄主的
29株快生根瘤菌和 34株模式参比菌株 ,进行生理
生化表型性状测定及数值分析 ,研究根瘤菌的表型
多样性 ,为根瘤菌的自然选种或选育固氮竞争能力
强的菌株提供了宝贵的种质资源及依据。
1　材料和方法
1. 1　菌　种
　　选用新分离纯化并经回接原寄主的快生根瘤菌
29株和模式参比菌株 34株。其中未知菌株编号、来
源及寄主名称等见表 1,模式参比菌株的选取参照
文献 [1]。
1. 2　性状测定
性状测定项目及方法按文献 [2 ]进行 , 63株菌
株测定了包括惟一碳源利用、惟一氮源利用、抗生素
敏感性、对染料和化学药物的耐受性、耐盐及酸碱
性、生长温度范围、石蕊牛奶反应等共 102个项目。
其中碳、氮源按 1. 0 g /L的终质量浓度加入。测试性
状名称: D-果糖、 D-密三糖、鼠李糖、棉籽糖、赤丝草
醇、糖源、甜醇、肌醇、半乳糖、 D-木糖、 D-阿拉伯糖、
D-核糖、树胶醛糖、密二糖、二硫苏糖、葡萄糖、阿冬
糖醇、山梨醇、山梨糖、马尿酸钠、麦芽糖、乳糖、蔗
糖、 L-半胱氨酸、 L-酪氨酸、 L-正白氨酸、 L-精氨酸、
L-白氨酸、 3, 5-二溴酪氨酸、 L-赖氨酸、 2-鸟氨酸、甘
氨酸、 L-谷氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、红霉素 5, 50,
100和 300 mg /L,链霉素 5, 50, 100和 300 mg /L,
青霉素 5, 50, 100和 300 mg /L ,白霉素 5, 50, 100和
300 mg /L ,新霉素 5, 50, 100和 300 mg /L,卡那霉
素 5, 50, 100和 300 mg /L,庆大霉素 5, 50, 100和
300 mg /L ,洁霉素 5, 50, 100和 300 mg /L,香酚兰
1. 0和 2. 0 g /L,孔雀石绿 1. 0和 2. 0 g /L ,孟加拉红
1. 0和 2. 0 g /L,亚甲基兰 1. 0和 2. 0 g /L ,甲苯胺兰
1. 0和 2. 0 g /L,去氧胆酸钠 1. 0和 2. 0 g /L,刚果红
1. 0和 2. 0 g /L,中性红 1. 0和 2. 0 g /L ,氯化钠 10,
20, 30, 40和 50 g /L ,亚硝酸钠 1. 0和 2. 0 g /L, pH
4, 5, 9, 10和 11,温度 4和 40℃ ,石蕊牛奶产酸 ,石
蕊牛奶产碱 ,石蕊牛奶胨化 ,石蕊牛奶酸凝 ,石蕊牛
奶还原。
[收稿日期 ]　 2001-07-03
[基金项目 ]　国家自然科学基金重点资助项目 ( 39730010) ;国家自然科学基金资助项目 (30000005)
[作者简介 ]　韦革宏 ( 1969- ) ,男 ,甘肃兰州人 ,副教授 ,博士 ,主要从事根瘤菌遗传多样性及其生态环境的研究。
DOI : 10. 13207 /j . cnki . jnwaf u. 2002. 03. 018
1. 3　聚类方法
采用平均连锁法 ( U PGMA) ,用中国科学院生
物所的 M IN TS软件包在 586微机上完成 ,聚类结
果以树状图谱的方式表示 [3 ]。
表 1　未知供试菌株一览表
Table 1　 List o f tested unknow n strains
菌株
St rains
寄主中文名
Chinese name of h ost s
寄主学名
Name of h ost s
采样地点
Point of collect
海拔 /m
Elevation
生境
Envi ronmen t of g row th
H002 达呼里胡枝子 Lespedeza davurica 卢氏 ( Lushi ) 1 000 山坡 ( Hi llside)
H003 刺槐 Robin ia pseudoacacia 卢氏 ( Lushi ) 1 000 山坡 ( Hi llside)
H005 截叶铁扫帚 L . cara ganae 卢氏 ( Lushi ) 900 山坡 ( Hi llside)
H006 狭叶米口袋 Amblytropis stenophyl la 卢氏 ( Lushi ) 900 山坡 ( Hi llside)
H007 鸡眼草 Kummerowia str iata 卢氏 ( Lushi ) 900 山坡 ( Hi llside)
H009 确山野豌豆 Vicia kioshanica 卢氏 ( Lushi ) 1 200 山坡 ( Hi llside)
H010 紫穗槐 Amorpha f ruticosa 卢氏 ( Lushi ) 1 200 山坡 ( Hi llside)
H011 大豆 Glycine max 卢氏 ( Lushi ) 600 山坡 ( Hi llside)
H012 天蓝苜蓿 Med icago lupu lina 卢氏 ( Lushi ) 700 山坡 ( Hi llside)
H013 多花胡枝子 Lespedeza f lor ibun da 卢氏 ( Lushi ) 800 山坡 ( Hi llside)
H014 苦参 Sophora f lavescens 卢氏 ( Lushi ) 1 000 山坡 ( Hi llside)
H015 吉氏木兰 In digofera kirilowi i 老君山 ( Laojun mountain) 1 200 山坡 ( Hi llside)
H017 歪头菜 Vicia unijuga 老君山 ( Laojun mountain) 800 山坡 ( Hi llside)
H018 刺槐 Robin ia pseudoacacia 老君山 ( Laojun mountain) 800 山坡 ( Hi llside)
H020 山合欢 Aibizz ia kalkora 老君山 ( Laojun mountain) 800 山坡 ( Hi llside)
H022 茫芒香豌豆 Lathyrus David ii 老君山 ( Laojun mountain) 1 000 山坡 ( Hi llside)
H026 美丽胡枝子 Lespedeza formosa 老君山 ( Laojun mountain) 1 000 山坡 ( Hi llside)
H031 野大豆 Glycine soja sieb 老君山 ( Laojun mountain) 1 200 山坡 ( Hi llside)
H038 长萼鸡眼草 Kummerowia stipulacea 蒿山 ( Song mountain ) 800 山坡 ( Hi llside)
H043 尖叶铁扫帚 Lespedeza hedysa roides 嵩山 ( Song mountain ) 800 山坡 ( Hi llside)
H046 绿豆 Phaseolus m ungo 嵩山 ( Song mountain ) 900 田地 ( Cropland)
H049 细梗胡枝子 Lespedeza virga ta 嵩山 ( Song mountain ) 1 000 山坡 ( Hi llside)
H051 刺槐 Robin ia pseudoacacia 嵩山 ( Song mountain ) 1 000 山坡 ( Hi llside)
H052 黄花草木犀 Mel ilotus suaveolens 嵩山 ( Song mountain ) 800 山坡 ( Hi llside)
H053 毛叶米口袋 Gueldenstaedt ia pau cif lora 嵩山 ( Song mountain ) 600 山坡 ( Hi llside)
H057 大豆 Glycine max 新乡 (Xinxiang) 100 路边 ( Roadside)
H058 黄花草木犀 Mel ilotus suaveolens 新乡 (Xinxiang) 100 山坡 ( Hi llside)
H061 山合欢 Aibizz ia kalkora 新乡 (Xinxiang) 300 山坡 ( Hi llside)
H063 尖叶铁扫帚 Lespedeza hedysa roides 新乡 (Xinxiang) 200 山坡 ( Hi llside)
2　结果与讨论
2. 1　生理生化性状测定结果
　　未知菌株生理生化性状测定结果表明: 29株
菌均不能利用糖源作为惟一碳源 ; 97%的菌株不能
利用二硫苏糖醇 ,只有 H011可以利用。 另外 ,只有
H051可利用山梨糖作为惟一碳源 ,其余菌株均不能
利用。马尿酸钠的利用率只有 4. 8% ,仅有 H011,
H022和 H049 3株菌尚可利用。 在所有供试菌株
中 , H011除了不能利用赤丝草醇、糖源、山梨糖这 3
种碳源外 ,其余 20种碳源均能利用 ,利用率最高为
87%。表明 H011的糖酵解途径较宽。惟一碳源利用
反应了细菌能否产生代谢这种化合物的有关酶 ,说
明不同菌株产生的酶有所差异。
H003, H010, H011, H012, H013, H038和 H046
7株菌均能利用全部供试的 12种氨基酸作为惟一
氮源 ,而 H002, H009, H049和 H061 4株菌都不能
利用 ,其余菌株有不同程度的利用。
在抗生素敏感性试验中 ,供试的 8种抗生素各
分为 4个质量浓度梯度。在低质量浓度试验中 ,大部
分菌株都可以保持生长 ,但随质量浓度的升高 ,能够
生长的菌株呈递减趋势。 其中在红霉素、新霉素、卡
那霉素、庆大霉素和洁霉素 300 mg /L下 ,没有 1株
菌能够生长 ; 但在 链霉素、青霉素和白 霉素
300 mg /L下 , H006, H007, H011, H012, H046, H052
和 H063均可以生长 ,说明这 7株菌对链霉素、青霉
素和白霉素有较强的耐受性。
供试菌株对香酚兰和中性红的耐受性较强 ,在
72 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 30卷
2. 0 g /L质量浓度下分别有 23株和 25株菌可以正
常生长。但大部分菌株对孔雀石绿、孟加拉红和亚甲
基兰这 3种染料的耐受性不强 ,只有 H011和 H007
较为特殊 , 其中 H011可耐受 1. 0 g /L的孔雀石绿
和孟加拉红 , H007仅耐受 1. 0 g /L的孔雀石绿。
供试菌株中有几株菌的耐盐性较强 ,其中
H003, H007, H011, H038和 H058 5株菌在含
40 g /L NaCl的 YM A培养基上生长 ; H026和
H043能耐受 50 g /L的 NaCl。
供试菌株耐碱性较强 ,耐酸性较弱。在 pH 4和
5时所有菌株都不生长。在 pH 10时 ,有 9株菌可生
长 ;在 pH 11时 ,有 6株菌可生长。
在 4℃条件下进行培养 ,所有供试菌株都停止
生长 ,说明它们不耐低温。在 40℃时 ,有部分菌株仍
可以生长 ,分别是 H006, H026, H038, H043和
H063。
在石蕊牛奶反应中 ,所有的供试菌株都未发生
还原现象 ,而石蕊牛奶产酸的有 10株菌 ,产碱的有
10株菌 ,胨化的有 1株菌 ,酸凝的有 8株菌。
从上述分析可见 ,供试菌株中存在着一些特殊
菌株 ,如分离自卢氏的大豆根瘤菌 H011在碳氮源
的利用、抗生素的抗性以及对化学药物的耐受性等
方面都具有较强的特异性 ,有待进一步研究。
2. 2　聚类分析结果
根据生理生化性状测定结果 ,以 U PGM A法进
行聚类分析 ,其结果见图 1。全部菌株在 61%的相似
水平上归在一起。 在 84%的相似水平上将 34株模
式参比菌株能够按种的不同彼此很好的分开。 从上
至下依次为:华癸根瘤菌 (M. huakuii )、 R. sp.、菜豆
根瘤菌 ( R. etl i )、杨凌根瘤菌 ( R. yanglingense )、
R. gal licum、海南根瘤菌 ( R. hainanense )、 S. medi-
ca、 S. arboris、热带根瘤菌 ( R. tropici )、 R. giardinii、
R. sp.、R .huaut lense、R .mongolense、M . lot i、天山根
瘤菌 (M. tianshanesnse )、新疆中华根瘤菌 ( S. x in-
j iangerse )、地中海根瘤菌 ( M. mediteraneum )、
M. plarifarium、 鹰 嘴 豆 根 瘤 菌 ( M . ciceri )、
M. amorphae、多寄主中华根瘤菌 ( S. terangae )、萨
赫尔根瘤菌 ( S. sahel i )、 S. sp.、豌豆根瘤菌 ( R. legu-
minosarum )、苜蓿根瘤菌 ( S. melilot i )、弗氏中华根
瘤菌 ( S. f redii )、 S. kost iense、 A. undicola和山羊豆
根瘤菌 (R . galegae )。同一种的两个不同菌株具有较
高的相似程度 ,如 CCBU 2609和 A106同属于华癸
根瘤菌 ,其相似性水平达 90% ; I66与 H14同属于
海南根瘤菌 ,其相似性水平达 94% 。这些结果与现
行的分类结果相一致 ,说明本试验在生理生化性状
测定及数值分析方面的可靠性。
根据参比菌株的聚类情况 ,并按照 Snea th等 [4 ]
的建议 ,相似性在 80%以上者可归入同一种。 H002
与 CFN42的表型相似性水平达 88% ,可初步认为
H002应归入 CFN42所在的菜豆根瘤菌 ( R. etl i ) ;
H063与 USDA1037的相似性为 87% ,可初步归入
S. medica; H061, H002与 U SDA3306的相似性大
于 89% ,应属于天山根瘤菌 (M. tianshanesnse)。
未知菌株在 84%的相似性水平上构成了 2个
独立的表观群 ,与已知参比菌株具有明显的差异。第
一亚群 ( Cluster 1)有 7个菌株 ,分别为 H003, H007,
H038, H011, H012, H046和 H052,寄主分别为刺
槐、鸡眼草、长萼鸡眼草、大豆、天蓝苜蓿、绿豆和黄
花草木犀 ,中心菌株为 H038。 第二亚群 ( Cluster2)
有 3个菌株 ,分别为 H006, H026和 H058,分别来自
狭叶米口袋、美丽胡枝子和黄花草木犀 ,中心菌株为
H026。这两个亚群具体的分类地位需要通过遗传学
分析进一步确定。除上述两个亚群外 , H005和 H053
两菌株的相似性为 87% ,其余菌株在 84%的相似水
平上未聚合在一起 ,各自独立。
在分析中可以看到 ,来自同一寄主的不同菌株
在表型特征上也会有较大差异 ,其分类地位与寄主
来源没有必然的联系。如采集于嵩山的 H052与新
乡的 H058, 寄 主均 为黄 花草木 犀。 H052 属
Cluster1,而 H058属 Cluster 2。
与豆科植物结瘤固氮的根瘤菌一般分为快生型
和慢生型两大类 , 多年来 ,陆续发现在某些属 、种
的豆科植物上既有快生型 ,也有慢生型根瘤菌与之
共生 [5 ]。在对河南省 29株豆科植物根瘤菌生理生化
表型性状测定及数值分析中可以看出 ,绝大多数菌
株之间存在着较大的差异 ,说明河南省根瘤菌具有
表型多样性这一特征。
73第 3期 韦革宏等: 河南省豆科植物根瘤菌表型多样性研究
图 1　数值分类树状图
Fig . 1　 Dendrog r am of numerica l ta xonomy of rhizobial strains
74 西北农林科技大学学报 (自然科学版 ) 第 30卷
[参考文献 ]
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Pheno typic feature div ersities of rhi zobia isolated
from pulses in Henan Province
WEI Ge-hong1 , LIU Hu-qi2 , SUN Ke- ji1 ,HAO Xian- jun1 , CHEN Wen-xin3
( 1 Col lege of Resources and Environment ,Northwest Sci-Tech Universit y of Agriculture and Forest ry ;
2 Col lege of L if e Sciences,N orthwest Sci-Tech Universit y of Agriculture and Forest ry , Y angl ing , Shaanxi 712100,China;
3 College of Biological Sciences,China Agricultural University ,Beijing 100094)
Abstract: Based on the investiga tion of rhizobial resources o f Henan province, 29 fast-g rowing rhizobia
st rains and 34 reference strains w ere analy zed w ith 102 pheno typic features and numerically classi fied. The
resul t show ed that there w as huge div ersi ty among st rains isola ted f rom dif ferent places, even the same ge-
og raphic resources and th e same hosts, in carbon and nit rog en nutrient uti li zation, resistance to antibio tics,
endurance to salt , alka li and chemical dye. 7 st rains had properties resistant to streptomycin, penicillin and
baimycin wi th the higher consistency. 23 st rains and 25 st rains can endure 2. 0 g /L Bromo thymol Blue and
Neutral Red respectiv ely. 2 strains can g row in YMA medium with 50 g /L NaCl. 6 st rains grow in medium
w ith pH 11. Unknown strains w ere clustered into tw o new subg roups di fferent from known species at the
simi lari ty of 84% . Cluster 1 had seven st rains, H038 w as the central strain. Cluster 2 had tree st rains, H026
w as the central strain.
Key words: pulses; rhizobia; pheotypic feature; pheo typic div ersi ty; Henan prov ince
75第 3期 韦革宏等: 河南省豆科植物根瘤菌表型多样性研究