全 文 ：收稿日期:2009-09-23　　修回日期:2009-12-25
基金项目:云南省自然科学基金资助项目(2006C0066M)。
作者简介:陈少瑜(1968-),女 ,广东潮州人 ,副研究员,从事林木种质资源与遗传多样性研究。
木兰科濒危植物大果木莲遗传多样性的 ISSR分析
陈少瑜 1 , 韩　燕 2 , 吴　涛 1 , 付玉嫔 1 , 司马永康 1 , 郝佳波 1
(1.云南省林业科学院 ,云南省森林植物培育与开发利用重点实验室 ,云南 昆明 650204;
2.西南林学院资源学院 ,云南昆明 650224)
摘要:采用 ISSR分子标记技术对云南省 3个大果木莲天然居群进行遗传多样性分析 。结果表明 ,在物种水平上 , 大果木莲
的多态位点百分率(PPB)为 70.71%;有效等位基因数(Ne)为 1.412 1;Nei′s基因多样性指数(H)为 0.243 3;Shannon信息
指数(I)为 0.365 1。在居群水平上 ,其 PPB为 44.1%;Ne为 1.270 4;H为 0.157 3;I为 0.234 3。通过 Nei′s遗传多样性分
析得到居群间的遗传分化系数(Gst)为 0.359 5,由遗传一致度进行了 3个居群的 UPGMA聚类。
关键词:大果木莲;濒危植物;ISSR分子标记;遗传多样性
中图分类号:Q311 文献标识码:A 文章编号:1001-389X(2010)01-0056-05
GeneticdiversityofendangeredspeciesManglietiagrandis
detectedbyinter-simplesequencerepeatmarkers
CHENShao-yu1 , HANYan2 , WUTao1 , FUYu-pin1 , SIMAYong-kang1 , HAOJia-bo1
(1.TheKeyLaboratoryofForestPlantCultivationandUtilization, YunnanAcademyofForestry, Kunming,
Yunnan650204, China;2.ResourceDepartmentofSouthwestForestryColege, Kunming, Yunnan650224, China)
Abstract:Inter-simplesequencerepeat(ISSR)techniquewasusedtodetect3 naturalpopulationsofManglietiagrandisdistributed
inYunnan.Theresultsshowedthatatspecieslevel, thevalueoftheaveragepercentageofpolymorphicbands(PPB)was70.
71%, effectivenumberofalelesperlocus(Ne)was1.412 1, Neisgenediversityindex(H)was0.243 3 andShannonsinforma-
tionindex(I)was0.365 1.Whileatpopulationlevel, thevaluesofPPB, Ne, HandIwere44.1%, 1.270 4, 0.157 3and0.
234 3 respectively.Thecoeficientofpopulationdiferentiation(Gst)amongpopulationsbasedonNeisgeneticdistancewas0.359
5.Basedongeneticidentity, dendrogramof3populationswasconstructedbyUPGMA.
Keywords:Manglietiagrandis;endangeredspecies;ISSRmarkers;geneticdiversity
ISSR(Inter-simplesequencerepeat, ISSR)即简单重复间序列标记 ,由 Zietkiewiczetal[ 1]于 1994年创
建的目前被广泛应用的一种分子标记技术 。该技术在引物设计上比 SSR技术简单 ,不需要知道 DNA序
列;用于 ISSR-PCR扩增的引物通常为 16-18个碱基序列 ,比 RAPD稳定 ,又可以揭示比 RFLP、SSR更多
的多态性。 ISSR标记具有操作简便快速 、开发成本低 、重复性好和多态性丰富等特点 ,使其在揭示植物种
质资源遗传多样性方面得以广泛应用 [ 2-4] 。
大果木莲(ManglietiagrandisHuetCheng)属木兰科(Magnoliaceae)木莲属(Manglietia),国家二级重
点保护野生植物和国家三级濒危保护物种 ,目前仅零星分布于云南东南部和广西西南部地区。按照 IUCN
地方濒危等级标准评价属于 “极危种(CR)” [ 5] 。大果木莲是木兰科中较为原始的类群 ,又属于濒危树种 ,
不仅对古植物区系及木兰科分类和演化的研究有重要学术价值 ,而且在用材及庭院观赏等方面也具有重
要的社会和经济意义 [ 6-7] 。采用 ISSR分子标记技术对分布于云南省的 3个大果木莲天然居群进行遗传
多样性分析 ,为这一濒危物种的合理保护提供理论依据 。
1　材料与方法
1.1　实验材料
1.1.1　材料来源　材料采集于云南省文山州麻栗坡县的下金厂乡 、铁厂乡和马关县的古林箐乡 3个天然
福建林学院学报　2010, 30(1):56-60 第 30卷 第 1期
JournalofFujianColegeofForestry 2010年 1月
DOI :10.13324/j.cnki.j fcf.2010.01.005
居群(表 1),共 63个样本 。采集的嫩叶装于放有硅胶的口袋中 ,置 -30℃低温冰箱 ,备用。
表 1　大果木莲居群与生境
Table1　Populationsandtheirhabitats
居群 样本数 海拔 /m 生境
麻栗坡县下金厂乡(MX) 23 1 568-1 854 林中或公路旁 ,棕壤
麻栗坡县铁厂乡(MT) 20 1 482-1 643 常绿阔叶林中或公路旁 ,棕壤
马关县古林箐乡(MG) 20 1 412-1 820 常绿阔叶林中或公路旁 , (赤)黄壤
1.1.2　主要仪器 　电子天平;BECKMAN台式超速冷冻离心机;SANYO超低温冰箱(-80 ℃);Bio-Rad
powerPac电泳系统;GeneGeniusBio凝胶成像系统;PE9700 PCR扩增仪等 。
1.2　实验方法
1.2.1　基因组 DNA的提取与检测　采用高盐沉淀法 [ 8-9]提取基因组 DNA,对其质量和浓度用 1%琼脂糖
凝胶电泳检测。通过紫外凝胶成像系统检测 DNA质量 ,同 λ-DNA进行对比 ,粗略估计 DNA浓度 ,并调整
DNA浓度为 50ng· uL-1左右 。
1.2.2　ISSR-PCR反应体系的优化　参照同属其它种相关研究的反应体系和扩增程序[ 10] ,选取 3个 DNA
样品进行 Mg2+浓度(0.5-3.0mM)、dNTPs浓度(0.05-0.3 mM)、Taq酶用量(0.25-1.25 U)(购自上海
申能博彩生物科技有限公司)、引物浓度(0.2-1.2uM)和模板 DNA用量(20-100 ng)等 5个因素的单因
素梯度实验 ,确定大果木莲 ISSR-PCR反应体系。扩增程序中根据引物的 Tm值进行相应的退火温度实
验 ,其他程序不变 。
1.2.3　引物筛选与 PCR扩增　从 100条 BritishColumbia大学公布的序列设计 ISSR引物(上海生物工程
有限公司合成)中选取扩展条带清晰 、重复性好的引物。用筛选出的引物对所有样品进行 PCR扩增 ,扩增
产物在 1.0%的琼脂糖凝胶(含 0.5μg· uL-1 EB)中电泳 ,以 DL2 000 bpDNAMarker(大连宝生物有限公
司)做为标记 。凝胶成像分析系统观察记录电泳结果。
1.2.4　数据统计与分析　根据 DNAMarker判读图谱中扩增条带的有无及分子量的大小 ,同一位点上 ,有
带记为 1 ,无带记为 0,采用 Excel软件对胶板样本条带进行转化 ,构建 0 /1数据矩阵 。以 Excel软件的数
据记录为基础 ,利用 DCFA1.1软件将 ISSR谱带统计结果转换为 POPGENE软件适用文件 ,应用 POPGENE
1.31软件[ 11]计算遗传多样性指标:多态位点百分率(percentageofpolymorphicbands, PPB);等位基因数
(obersevednumberofalelesperlocus, Na);平均每个位点的有效等位基因数(efectivenumberofaleles
perlocus, Ne);Nei′s基因多样指数(Nei′sgenediversityindex, H);Shannon′s多样性信息指数(Shannon′s
informationindex, I);总的基因多样性(totalgenediversity, Ht);居群内的基因多样性(genediversitywithin
populations, Hs);居群间的遗传分化系数(coeficientofpopulationdiferentiation, Gst, Gst=1-Hs/Ht);Nei′s
遗传距离(geneticdistancce, D);遗传相似度(geneticidentity, I);基因流(estimateofgeneflowfromGst,
Nm)等。根据 POPGENE计算得到 Nei′s遗传距离和遗传一致度 ,运用 NTSYSpc2.10软件进行 UPGMA聚
1-8为样品基因组DNA;20-50ng为 4个浓度梯度的 λ-DNA。
图 1　大果木莲基因组 DNA与浓度比较
Figure1　DNAabstractedandassessment
类 ,构建表明各居群间遗传关系的树系图 。　　
2　结果与分析
2.1　基因组 DNA提取 、反应体系确定及引物筛选
　　经电泳检测 , 高盐沉淀法提取的基因组
DNA效果较好(图 1)。反应体系 5个因子的单
因素梯度实验确定大果木莲 ISSR-PCR反应体
系为 20 μL反应体系中 ,含 0.5 UTaqDNA聚合
酶 , 0.2 mmol· L-1dNTP, 0.8 μmol· L-1引物 ,
2.0 mmol· L-1Mg2+ , 2μL10×PCRbufer, 40ng
DNA模板 , 13.3 μLddH2O。反应程序为 94 ℃
预变性 5 min, 94 ℃变性 1 min, 52 -60 ℃退火
·57·　第 1期 陈少瑜等:木兰科濒危植物大果木莲遗传多样性的 ISSR分析
45 s(退火温度由引物定), 72 ℃延伸 2 min, 40个循环 , 72℃延伸 7 min。
从 100条引物中 ,筛选出条带清晰 、多态性强 、重复性好的引物 9条 ,碱基序列与实际退火温度见表 2。
表 2　ISSR引物序列与退火温度 1)
Table2　ISSRprimersusedintheexperimentsequencesandannealingtempreture
引物标号 碱基序列 退火温度 /℃ 引物标号 碱基序列 退火温度 /℃
808 (AG)8C 60 864 (ATG)6 52
812 (GA)8A 52 868 (GAA)6 52
815 (CT)8G 55 880 (GGAGA)3 52
825 (AC)8T 60 ISSR19 GGA(GTG)4 52
857 (AC)8YG 60
　　1)Y=(C, T)。
2.2　居群的遗传多样性
用筛选出的 9条引物对大果木莲 63个个体进行扩增 ,共检测到 99个位点 ,其中多态位点 70个 。物
种水平上 ,大果木莲的 PPB为 70.71%, Ne为 1.412 1 , H为 0.243 3, I为 0.365 1。居群水平上 ,大果木莲
的 PPB为 44.1%, Ne为 1.270 4, H为 0.157 3 , I为 0.234 3(表 3)。
表 3　3个大果木莲居群的遗传多样性
Table3　Geneticdiversityof3M.grandispopulations
居群 样本数 PPB/% Na Ne H I
MX 23 42.42 1.424 2±0.496 7 1.253 6±0.367 9 0.145 4±0.197 8 0.216 2±0.283 1
MT 20 42.42 1.424 2±0.496 7 1.266 0±0.362 9 0.154 5±0.197 9 0.229 8±0.285 6
MG 20 47.47 1.474 7±0.501 9 1.291 6±0.359 7 0.172 0±0.197 5 0.257 0±0.286 2
平均 21 44.10 1.441 0±0.498 4 1.270 4±0.363 5 0.157 3±0.197 7 0.234 3±0.282 0
物种水平 63 70.71 1.707 1±0.457 4 1.412 1±0.363 2 0.243 3±0.193 2 0.365 1±0.273 6
2.3　居群的遗传分化
采用 POPGENE软件计算出大果木莲各居群的遗传分化情况 ,包括 Ht、Hs、Gst和 Nm等指标(表 4)。
由表 4可见 ,大果木莲 3个居群 Ht为 0.245 6, Hs为 0.157 3, Gst为 0.359 5 , Nm为 0.890 8。结果表明 ,总
的遗传变异中有 35.95%存于居群间 , 64.05%存于居群内。居群间每代个体的 Nm为 0.890 8。
表 4　大果木莲居群的遗传分化与遗传结构
Table4　Geneticstructureof3M.grandispopulations
Ht Hs Gst Nm
平均　 0.245 6 0.157 3 0.359 5 0.890 8
标准差 0.037 8 0.024 5
2.4　居群间的遗传距离与遗传一致度
由 POPGENE计算得到居群间的 Nei′s遗传一致度为 0.935 2-0.783 6,遗传距离为 0.067 0-0.212 4
(表 5)。根据遗传一致度进行 UPGMA聚类得到 3个居群的聚类图(图 2)。结果表明 , MX和 MT居群的
遗传一致度最高(I=0.935 2), MT与 MG居群的遗传一致度最低(I=0.783 6), MX与 MT居群的遗传距
离较近 ,而与 MG居群的遗传距离较远 。由聚类图可以看出 3个居群间的遗传距离关系 ,与它们的地理距
离成正相关 。
3　结论与讨论
3.1　大果木莲的遗传多样性
遗传多样性是物种长期进化的结果 ,是种群生存和发展的前提 。许多研究认为濒危 、特有植物具有较
低的遗传多样性 [ 12] ,但也有研究表明 ,有些稀有和濒危植物同样具有较高的遗传多样性 [ 13-14] 。在物种水
平上 ,大果木莲 PPB(70.71%)、H(0.243 3)和 I(0.365 1)与同科其它几个濒危种相比属于较高的一类;其
PPB远远高于同科的濒危物种华木莲(Manglietiadecidua)和天目木兰(Magnoliaamoena),稍低于乐昌含
笑(Micheliachapensis)和观光木 (Tsoogiodendronodorum), 低于同科的广布种乳源木莲 (Manglietia
yuyuanensis)(表 6)。结果显示大果木莲具有较高的遗传多样性 。
·58· 福　建　林　学　院　学　报 第 30卷　
表 5　大果木莲居群的遗传一致度与遗传距离 1)
Table5　Geneticidentityandgeneticdistanceof
3M.grandispopulations
居群 MX MT MG
MX 0.935 2 0.808 6
MT 0.067 0 0.783 6
MG 0.212 4 0.243 8
　　1)对角线上方为遗传一致度;对角线下方为遗传距离。
图 2　大果木莲基于 Nei′s遗传距离的 UPGMA聚类图
Figure2　Dendrogramof3M.grandispopulationsbased
onNei′sgeneticdistance
表 6　木兰科其它几个种的遗传多样性比较 1)
Table6　GeneticdiversityforM.grandisandotherspeciesinMagnoliaceae
特性 物种 标记方法 PPB/% H I 出处
濒危 大果木莲 ISSR 70.71 0.243 3 0.365 1 本研究结果
华木莲 ISSR 17.28 0.063 7 0.064 9 廖文芳等 [ 17]
巴东木莲 Isozyme 66.70 0.192 0 何敬胜等 [ 18]
乐昌含笑 RAPD 81.98 0.325 5 0.475 1 姜景民等 [ 19]
天目木兰 RAPD 24.40 刘登仪等 [ 20]
观光木 RAPD 78.13 0.356 5 黄久香等 [ 21]
广布 乳源木莲 ISSR 86.11 0.282 7 0.435 3 李因刚等 [ 22]
　　1)巴东木莲(Manglietiapatungensis)。
Hamricketal[ 15-16]指出一个物种遗传多样性的高低与它的生活史特征和生态特征分不开 ,认为稀有
种或特有种以及分布范围狭窄的物种 ,遗传多样性水平较低 ,广布 、异交 、动物传播种子都会使物种具有较
高的遗传多样性 。尽管大果木莲分布范围狭窄 ,现存居群数量少 ,但却有较高的遗传多样性 ,可能与其生
物学特性 、生活史及生境特点等有关 。首先 ,从木兰科植物的传粉特性来看 ,该科植物花大 、色彩鲜艳 、味
香 ,具有显著的虫媒传粉的特征 ,进行了大果木莲的传粉观察 ,访花昆虫观测记录以及套袋实验 ,结果显示
大果木莲以异交为主(另文发表),这样的传粉和繁育方式有利于维持其较高的遗传多样性;其次 ,大果木
莲为多年生长寿命树种 ,世代重叠 ,在长期自然选择作用下 ,适应其生存的基因被不断地积累和保留下来 ,
因此形成广泛的遗传基础 ,而遗传分析所采样品为年龄相近的成年大树 ,且单株间隔尽可能在 50m以上 ,
在达到样品数量下客观地反映其遗传多样性状况 ,另外 ,尽管大果木莲结实率不高 ,再生能力也较弱 ,但据
野外观察和实验大果木莲没有分蘖 、无融合生殖等无性繁殖方式 ,有性繁殖有利于保持其遗传多样性 。
3.2　大果木莲的遗传分化
大果木莲天然居群在自然分布上出现了片段化 ,其遗传分析的结果也显示了 3个居群间较高的遗传
分化(Gst=0.359 5),其遗传分化高于多年生木本特有种的平均值(Gst=0.141 0)[ 23] 。尽管如此 ,仍有
64.05%的遗传变异保存于居群内 。大果木莲居群间的 Nm较低 ,为 0.890 8(Nm<1)。
Bussel[ 24]曾对 35个物种 RAPD分析结果进行了总结 ,发现其中 25个异交物种居群间遗传变异占总
遗传变异的 0.9%-41.3%(Gst=0.009-0.413), 6个近交物种的比率为 44.6% -66.9%(Gst=0.446-
0.669)。显然 ,大果木莲的遗传分化系数属于异交物种的范围 。大果木莲虫媒传粉的效率 、结实量低 、种
子传播和萌发受环境限制 、居群的孤立和片段化导致了居群间较高的遗传分化 , MG与 MX、MT居群间的
遗传距离较远 ,平均为 0.228 1,而 MX、MT居群间的遗传距离仅为 0.067。Slatkin[ 25]和 Hamricketal[ 26]认
为若 Nm>1, Nm就足以抵制遗传漂变的作用 ,同时也可以防止发生居群间的分化;若 Nm<1,则遗传漂变
可导致居群间明显的遗传分化 。若 Nm受到限制 ,在短距离内就可出现居群间的遗传分化 。大果木莲的
Nm为 0.890 8(Nm<1),说明居群间基因交流的障碍也强化了其居群间的分化。
3.3　大果木莲保护建议
遗传多样性对于物种的生存和发展具有决定性作用 ,物种保护策略的制定必须建立在对居群遗传结
构及多样性充分了解的基础上 [ 27] 。基于对大果木莲遗传多样性和遗传分化状况的分析结果 ,建议采取以
·59·　第 1期 陈少瑜等:木兰科濒危植物大果木莲遗传多样性的 ISSR分析
下的保护措施:首先 ,大果木莲具有较高的遗传多样性 ,说明其致濒的主要原因不是遗传基础 ,而是人为对
植株的砍伐和生境的破坏 。因此应积极采取就地保护的措施 ,建立自然保护区或保护点 ,避免遗传多样性
的丧失 。目前 MT、MG居群的大果木莲已分别划入自然保护区内 ,但 MX居群的大果木莲仍然没有采取
适当的保护措施 。大果木莲天然居群数量少 ,对任何现存居群的保护都非常重要 。其次 ,对大果木莲的传
粉等生物学特性进行深入研究 ,弄清其结实率低 、再生能力差的根本原因 ,为现存居群更有效的保护以及
人工繁殖幼苗的回归提供科学依据。再次 ,建立大果木莲的迁地保育基地 ,因其大部分的遗传变异存于居
群内 ,尽可能收集各天然居群一定数量的单株材料 ,以最大限度地保持大果木莲的遗传多样性 。最后 ,建
立组织培养或扦插 、嫁接等无性繁殖技术和人工林培育技术体系 ,通过人工林的建立缓解人们对自然资源
的压力 ,达到保护的目的。
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(责任编辑:江　英)　　
·60· 福　建　林　学　院　学　报 第 30卷