全 文 ：禾本科作物基因枪介导遗传转化研究进展
柳展基 , 单 雷 , 徐平丽 , 李广存 , 王秀丽
(山东省农科院生物技术研究中心 , 山东济南 250100)
摘要:介绍了禾本科作物基因枪介导遗传转化原理 、转化受体 , 讨论了外源基因的整合 、遗传和表达 , 以及今后的前景 。
关键词:基因枪;禾本科作物;遗传转化
中图分类号:Q785;Q789 文献标识码:A 文章编号: 1000-1700(2001)06-0465-04
Advances in Genetic Transformation of Graminaceous Crops by Particle Bombardment
LIU Zhan-ji , SHAN Lei , XU Ping-li , et al.
(Biotechnology research center , Shandong Academy of Agricutural Sciences , Jinan 250100 , China)
Abstract:This paper summarized the principle and receptors of genetic transformation of graminaceous crops by particle bombardment ,
discussed the integration , inheritance and expression of foreign gene.The future of particle-mediated graminaceous transformation was
also prospected in this paper.
Key words:particle bombardment;graminaceous crops;transformation
自 1983年第一个转基因植物问世以来 , 植物基因工程的发展日新月异 , 硕果累累 , 一大批有价值的转
基因植物已经或即将投入到实际应用中 。经过十多年来的探索磨砺 , 基因转入技术日臻成熟 , 已形成了以农
杆菌转化和基因枪转化技术为主体的两大植物基因转化系统。基因枪转化技术是由 20世纪 80年代末期逐渐
发展起来的 , 它的最大优点是无明显的宿主限制 , 几乎适用于任何受体材料 , 另外它只需要简单的组培技
术 , 不必经过复杂的原生质体的制备和培养阶段 , 为植物基因转化工作提供了一套更为简化的手段。
1 基因枪的转化原理
基因枪法(Particle gun)的转化原理是利用火药爆炸 、 高压放电或高压气体作为驱动力加速包被有生物活
性 DNA的惰性金属粒子(微弹), 利用冲力将其射入植物受体细胞 , 并释放出外源 DNA , 使 DNA在植物细胞
中整合表达 , 从而实现植物细胞的转化 。这种方法可不依赖植物基因型导入外源基因 , 克服了农杆菌的寄主
特异性以及与组培相关的植株再生的许多困难 。基因枪法又称为粒子轰击技术(Particle bombardment)、 生物
发射技术(Biolistic process)或高速微粒子发射技术(High-velocity microprojectile)。
根据动力来源不同 , 基因枪可大体分为火药式(Gunpowder)、 放电式(Electric discharge)和气动式
(Pneumatic)3种类型。火药式基因枪是最原始的基因枪类型 , 是由美国康乃尔大学 Sanford等(1987)设计制造
的。这种枪自使用以来已先后将外源基因导入了玉米 、 小麦 、 水稻等多种植物材料中(表 1), 并获得了瞬间
或稳定表达 。气动式基因枪是 Sanford等(1991)在火药式基因枪的基础上设计的[ 1] , 它更安全清洁 , 通过调节
气体压力可有效地控制粒子的运行速度 , 金属粒子分布更加均匀 , 每枪之间的差异更少 , 且转化效率高 。
Vasil等(1993)利用此基因枪获得了小麦转基因植株。目前 , 山东农科院正在利用此种基因枪对不同玉米自交
系进行转化 。放电式基因枪以高压放电为动力 , 它可以有效地转化多种类型的器官组织 , 通过改变工作电压
可精确控制微弹速度和射入深度 , 使微弹特异地射入具有再生能力的细胞层以利于转化再生植株的获得。目
前已利用该种基因枪在水稻上获得了转基因植株 。
收稿日期:2000-10-24
作者简介;柳展基 (1974-), 男 , 山东省农科院生物技术研究中心助理研究员 , 硕士 , 从事作物转基因研究。
沈阳农业大学学报 , 2001-12 , 32(6):465-468
Journal of Shenyang Agricultural University , 2001-12 , 32(6):465-468
○文献综述 LITERATURE SUMMARY
2 转化受体
用于基因枪转化的受体材料十分广泛 , 凡是具备再生能力的细胞或组织 , 都可以作为基因枪的转化受
体 。目前 , 在禾谷类作物上 , 转化受体主要集中在胚性愈伤组织 、幼胚 、 成熟胚和悬浮细胞上 。
2.1 胚性愈伤组织
该转化受体分生能力强 、 易于接受外源基因 , 而且继代扩繁量大 , 因此可以获得较多的转化植株 , 提高
转化率 。目前水稻转化中普遍受到欢迎的是未成熟的盾片愈伤组织 , 在小麦 、 玉米上也已有许多成功的报道
(表 1)。这种转化受体是由多细胞组成的 , 从愈伤组织分化出的不定芽也常是多细胞起源 , 因此 , 嵌合体
多 , 而且随着愈伤组织继代培养的延长 , 嵌合体比例增加。
表 1 通过基因枪法获得转基因植株的禾谷类作物
Table 1 Transgenic plants of particle-mediated graminacenous crops
作物 转化受体 外源基因 基因枪类型 作者及年份
Species Receptor Foreign gene Type Author and date
小麦
Wheat
燕麦 Oat
大麦 Barley
谷子Millet
2.2 幼胚和成熟胚
幼胚和成熟胚属于器官受体系统 , 其突出的优点是再生容易(玉米成熟胚再生稍难一些), 且可大量获
得 , 耗时短。尤其在禾谷类作物上 , 许多科学家倾向于优先使用幼胚作为转化受体。Christou(1991), Weeks
(1993)和 Koziel(1993)等分别以水稻 、 小麦和玉米的幼胚为受体成功进行了基因枪转化 , 并获得了转基因植
株 [ 2 ～ 4] , Cao等(1990)利用成熟胚为受体 , 已在水稻和玉米上获得了成功 [ 5]。我国这方面工作开展得稍晚些 ,
王国英等(1995)也成功地获得了玉米幼胚的转基因植株[ 17]。这种转化受体的缺点是筛选得到的转化体中嵌合
体现象较为严重 , 筛选工作量大。
上述两种转化受体得到的转化体中嵌合现象较多的问题 , 可以通过采用逐级加压筛选的方法 , 逐步淘汰
非转化受体 , 最后得到纯的转化体。
2.3 悬浮细胞
悬浮细胞属于单细胞受体 , 由它获得的转化体嵌合现象少 , 易于筛选。Gordon-Kamm等(1990)以玉米
A188×B73的胚性悬浮系为受体进行基因枪转化 , 获得了可育再生植株 , 并在子代中检测到外源基因的表
达 [ 11]。这种转化受体的缺点是受体的获得和再生困难 , Vasil等(1991)用小麦胚性悬浮细胞作为受体进行基
因枪的转化未能获得再生植株 。
·466· 沈 阳 农 业 大 学 学 报 第 32卷
胚性愈伤组织 Embryogenic callus
盾片愈伤组织 Scutellum callus
幼胚 Immature embryo
幼胚 Immature embryo
幼胚 Immature embryo
成熟胚 Embryo
幼胚 Immature embryo
胚性悬浮细胞 Cell suspensions
胚性愈伤组织 Embryogenic callus
成熟胚 Embryo
胚性悬浮细胞 Cell suspensions
胚性愈伤组织 Embryogenic callus
幼胚 Immature embryo
胚性愈伤组织 Embryogenic callus
胚性愈伤组织 Embryogenic callus
花粉 Pollen
胚性悬浮细胞 Cell suspensions
胚性悬浮细胞 Cell suspensions
花粉 Pollen
GUS , bar
GUS
GUS , bar
GUS , bar
GUS , bar
GUS
GUS , bar , Hpt
Bar
GUS , bar
GUS
GUS
Hpt
B.t.
GUS
Bar
GUS
GUS , bar
GUS , bar
GUS
火药式 Gunpowder
火药式 Gunpowder
气动式 Pneumatic
火药式 Gunpowder
气动式 Pneumatic
火药式 Gunpowder
放电式 Electric discharge
气动式 Pneumatic
火药式 Gunpowder
火药式 Gunpowder
火药式 Gunpowder
火药式 Gunpowder
气动式 Pneumatic
气动式 Pneumatic
气动式 Pneumatic
火药式 Gunpowder
火药式 Gunpowder
气动式 Pneumatic
火药式 Gunpowder
Vasil , et al.
Perl , et al.
Perl , et al.
Weeks , et al.
Becker , et al.
Cao , et al.
Christou , et al.
Cao , et al.
Li , et al.
Cao , et al.
Fromm , et al.
Walters , et al.
Koziel , et al.
Vain , et al.
Wan , et al.
贾士荣等
Somers , et al.
Stiff , et al.
贾士荣等
(1992)[6 ]
(1992)
(1993)
(1993)[3 ]
(1994)
(1990)[5 ]
(1991)[2 ]
(1992)
(1993)
(1990)[5 ]
(1990)[7 ]
(1992)[8 ]
(1993)[4 ]
(1993)[9 ]
(1995)[10 ]
(1992)[18 ]
(1992)
(1995)
(1992)[ 18 ]
○文献综述 LITERATURE SUMMARY
2.4 其他受体
除上述介绍的常用转化受体外 , 还有很多转化受体 , 如根或茎的切段 、 叶圆片 、 分生组织 、 花粉细胞
等 。贾士荣等(1992)用国产火药式基因枪及 pBI121质粒 DNA , 对玉米和谷子花粉进行转化后人工授粉 , 获
得了转基因植株 [18]。
3 外源基因的整合 、 遗传和表达
基因枪介导的遗传转化是利用物理方法将裸露的 DNA随机地导入植物受体细胞 , 外源基因的整合位点
较多 , 可以在一条染色体上或不同染色体上进行多位点整合 , 常出现连续多拷贝现象 , 可能因为外源基因在
整合前发生互连 。目前对外源基因的整合机制和插入位点了解甚少 , 一般认为外源基因是通过在细胞分裂时
遗传物质的复制过程中随机整合到植物基因组中的 。
由于整合的外源 DNA易发生结构变化和修饰 , 如 DNA片段分离 、 丢失 、环化 、甲基化等 , 致使整合的
外源 DNA遗传特性比较复杂 , 转基因植株的表型丰富 , F1植株的分离比例也比较复杂 , 但基本符合孟德尔
遗传 。王守才等(1999)在转基因玉米后代研究中表明:外源基因在大多数转化体后代中呈简单的孟德尔遗
传 , 在 R1至 R2代 , 部分家系中的转化体比例偏低 , 有的发生基因丢失 , 但到 R3代以后均趋于正常的孟德
尔遗传方式 , 在群体中固定下来[ 16]。
目前大部分转化采用的都是选择标记基因 , 通过组织化学分析 、 酶活性测定和抗性分析证明外源基因在
转基因植株中得到表达 , 但也有少数植株表现出基因沉默现象 。多拷贝往往导致基因的不表达 , 但最近
Stoger(1998)分析了基因枪法获得的 70个小麦独立的转基因植株 , 得到了一种完全相反的结果 , 转基因的拷
贝数越多表达水平越高[ 12]。因此这方面的问题有待于更多的试验加以验证 。
4 禾本科作物基因枪介导遗传转化前景
细胞器的遗传系统同细胞核的遗传系统同样具有重要作用 , 它们相互调节 , 共同调控着细胞的生命活
动 。现已证明 , 基因枪法可将外源基因导入细胞器 , 并在酵母线粒体 、烟草的叶绿体中取得了成功 , 目前尚
未见到在禾本科作物上的成功报道。
由于基因枪可以将外源基因导入特定组织 , 因此可以利用基因枪研究基因的表达调控和表达特点。在禾
本科作物上 , 玉米应用的最为广泛。Klein等(1989)在利用玉米胚研究花色素苷生物合成基因时发现 , 整合
后外源基因的表达调控和内源基因是一致的[ 13]。Hamilton等(1992)用玉米花粉进行花粉特异性启动子片段分
析时鉴别出了表达必需区和能够扩增表达的序列[ 14] , Bansal等(1992)使用玉米叶片中的 cab-m1和 rbc-m3
启动子序列研究细胞特异和受光调控的 gus基因表达时发现:在绿叶鞘细胞的 rbc-m3的 5′区域可能控制大
部分依赖光而增加的转录物 , 而在叶肉细胞中 , 转录和转录后机制是由 rbc-m3转录物的缺失控制的 [15]。
禾本科作物基因型的限制仍然是一个难题 , 在玉米和小麦上表现尤为突出 。因此 , 在进一步探索组织培
养技术的同时 , 采用绕开愈伤组织再生的转化途径 , 值得深入研究 。基因枪的转化效率还很低 , 一般在
0.1%～ 1%之间 。Bidney等(1992)用烟草的叶片和向日葵的顶端分生组织进行了基因枪和农杆菌的协同转
化 , 大大提高了转化效率 , 在禾本科作物上 , 这方面的比较试验还很少 , 需进一步加强研究。相信随着基因
枪转化技术的不断完善和设备的不断改进 , 外源基因整合机理的日渐清晰 , 它将在禾本科作物遗传转化研究
中发挥更大的作用。
第 6期 柳展基等:禾本科作物基因枪介导遗传转化研究进展 ·467·
○文献综述 LITERATURE SUMMARY
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·468· 沈 阳 农 业 大 学 学 报 第 32卷
○文献综述 LITERATURE SUMMARY
[责任编辑 于洪飞]