全 文 ：　 - P lant Protection
收稿日期:　2009-03-08　　　修订日期:　2009-04-28基金项目:　广东省自然科学基金(07006209);省部产学研结合项目(2008B090500212);广东省国际合作项目(2007A050100005);广东省农业攻关(2006B20301036);广州市科技计划项目(2007J1-C0071)＊通信作者 Tel:020-87597476;E-mail:h ezf@gdppri.com
12种寄主来源的茄科雷尔氏菌16S-23S
rDNA间隔区序列比较
佘小漫1 , 2 , 　何自福1＊ , 　李华平2 , 　虞　皓1
(1.广东省农业科学院植物保护研究所 , 广州　510640;　2.华南农业大学资源环境学院 , 广州　510642)
摘要　应用 PC R方法 ,获得了分离自广东番茄 、茄子 、辣椒 、烟草 、空心菜 、沙姜 、姜 、马铃薯 、花生 、菊花 、桑树和藿香
等 12 种作物 21个茄科雷尔氏菌菌株的16S-23S rDNA 间隔区序列(ITS)。序列分析结果表明 , 除 HZ-1菌株外 ,其
余 20 个茄科雷尔氏菌菌株 ITS 序列长均为 503 bp , 序列间相似性 99.2%～ 100%, 序列间差异仅 1 ～ 4 bp;而 HZ-1
菌株的 ITS 序列长为 498 bp , 与其他菌株的 ITS 序列相似性为 95.4%～ 95.6%。这些结果说明 , 这 21 株来源于 12
种不同寄主的茄科雷尔氏菌菌株的 16S-23S rDNA ITS 序列比较保守。系统进化分析显示 ,仅菌株 HZ-1 聚类于茄
科雷尔氏菌区组 2 中 ,其余 20 个菌株均聚类于茄科雷尔氏菌区组 1 中。
关键词　茄科雷尔氏菌;　16S-23S rDNA ITS;　序列分析
中图分类号:S 436.3　　文献标识码:　A　　DOI:　10.3969/ j.issn.0529-1542.2010.01.007
Sequence analysis of 16S-23S rDNA intergenic spacer region of
Ralstonia solanacearum strains from 12 host plants
She Xiaoman1 , 2 , 　He Z ifu1 , 　Li Huaping2 , 　Yu Hao1
(1.I nstitute of Plant Protection , Guangdong Academy of Agricultural Sciences , Guangzhou 　510640 , China ;
2.College of Natural Resources and Environment , South China Agricultural University , Guangzhou 　510642 , China)
Abstract　The 16S-23S rDNA internal tr anscr ibed spacer sequences(ITSs)were amplified by PCR from 21 stra ins
of Ralstonia solanacearum isolated from tomato , eggplant , tobacco , capsicum , Ipomoea aquatica , Kaempferia
galangal , ginger , potato , peanut , chrysanthemum , Morus alba and patchouli in Guangdong Province.The ITSs of
20 among the 21 str ains , except the str ain HZ-1 , were de term ined to be 503 bp in length , and their sequence simi-
lar ity r anged from 99.2% to 100%.The ITS of HZ-1 was dete rmined to be 498 bp in length , and the sequence
similar ity be tween HZ-1 and the other 20 str ains r anged from 95.4% to 95.6%.These r esults indica ted th at 16S-
23S rDNA ITSs of R .solanacearu m isolated from 12 host plants were highly conse rved.Phylogenetic analysis
showed that the str ain HZ-1 was cluster ed in the division 2 of R .solanacearum , while the other 20 str ains in the
division 1 of R .solanacearu m .
Key words　Ralstonia solanacearum ;　16S-23S rDNA ITS;　sequence analysis
　 　茄 科 雷 尔 氏菌 [ Ralstonia solanacearum
(Smith)Yabuuchi et al.]是世界上最重要的植物病
原细菌之一 ,广泛分布于热带 、亚热带及温带地区。
该病原细菌的寄主范围很广 ,可侵染 55科数百种植
物[ 1] 。在我国 ,目前已报道有番茄 、辣椒 、茄子 、马铃
薯 、烟草 、花生 、生姜 、沙姜 、桑 、空心菜和桉树等 10
余种作物受到该病原细菌的危害。
茄科雷尔氏菌种内存在明显生理分化和遗传差
异 。根据对不同寄主植物种类的致病性不同 ,将该
病原细菌其划分为 5 个生理小种(race)[ 2-4] ;而根据
菌株对 3种二糖和 3种己醇氧化能力的差异 ,又可
以将其划分为 6个生化变种(bio var)[ 3 , 5-6] 。Li等[ 7]
通过对 16S rRNA基因序列分析将茄科雷尔氏菌分
为 2 个簇(或亚种),并与 Cook 等[ 8] 的 2 个区组
2010
(division)相对应 。另外 ,分子系统进化分析还可以
将该病原细菌区分为亚洲组(Asiaticum)、美洲组
(Americanum)和非洲亚组(African subdivision)等
3个地理组[ 9-11] 。因此 ,分类意义上的茄科雷尔氏菌
明显是一个复合种。
对于茄科雷尔氏菌这个复合种 ,不同来源 ,尤其
是不同寄主植物来源的菌株间系统进化在分子水平
上有无差异 ?先前的研究结果显示 ,不同地理区域
和寄主植物来源的茄科雷尔氏菌菌株存在丰富的遗
传多样性[ 12-13] ,但其 16S rDNA 十分保守[ 14] 。在茄
科雷尔氏菌的分类与系统进化研究时 , 16S-23S
rDNA ITS序列分析可以作为 16S rDN A 序列分析
的补充[ 15] 。因此 ,本文通过对来源于 12种寄主植
物的茄科雷尔氏菌代表菌株的 16S-23S rRNA 基因
间隔区序列的研究 ,进一步探讨这些不同寄主来源
菌株的分子特征 ,全面认识该病原菌的生理分化和
遗传变异 ,为控制该病原菌的危害奠定基础。
1　材料与方法
1.1　供试菌株
供试菌株共 21株 ,分别分离自广东不同寄主植
物 ,并鉴定其所属生化变种[ 16](表 1)。所有菌株均
在含 2 , 3 ,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)平板培养基
上 ,28 ℃培养 3 d。选取白边宽中间粉红色的单菌
落用于试验 。
表 1　供试的 21个茄科雷尔氏菌菌株
菌株 采集地 寄主 生化变种 基因库登录号
ZCZ-2 广州 番茄 Ⅲ FJ744123
SSF-4 佛山 番茄 Ⅳ FJ744124
DG-2 东莞 茄子 Ⅳ FJ744125
LZ-3 连州 茄子 Ⅲ FJ744126
GY-1 高要 辣椒 Ⅲ FJ744127
GY-2 高要 辣椒 Ⅲ FJ744128
RR-1 广州 花生 Ⅲ FJ744129
RR-2 广州 花生 Ⅳ FJ744145
NX-1 南雄 烟草 Ⅲ FJ744130
NX-5 南雄 烟草 Ⅲ FJ744131
PY-10 广州 空心菜 Ⅳ FJ744132
G Y0501 高要 空心菜 Ⅳ FJ744133
HZ-1 惠州 马铃薯 Ⅱ FJ744134
HZ-2 惠州 马铃薯 Ⅲ FJ744135
FC-11 广州 菊花 Ⅳ FJ744136
CW-1 阳春 姜 Ⅳ FJ744137
CW-10 阳春 姜 Ⅳ FJ744138
YC-5 阳春 沙姜 Ⅳ FJ744139
YC-33 阳春 沙姜 Ⅲ FJ744140
PC 阳春 藿香 Ⅲ FJ744141
MA 阳春 桑树 Ⅲ FJ744142
1.2　菌株基因组 DNA的提取
按 Bouche r等[ 17] 方法提取各菌株基因组 DNA 。
1.3　PCR引物
用原核生物 16S-23S rDNA ITS 通用引物[ 18] 进
行 PCR ,其序列为:1493f(5′-AG TCG TAACAAGG-
TAGCCGT-3′)和 23r (5′-GTGCCAAGGCATC-
CACC-3′)。上述引物均由上海生工生物技术工程
服务有限公司合成。
1.4　PCR扩增体系
以提取的基因组 DNA 为模板进行扩增。PCR
反应体系(25 μL)含如下成分:DNA 模板约 20 ～
25 ng ,10×PCR buf fer 2.5 μL ,dNTPs 200μmol/L ,2
个引物各 0.4μmol/ L和3 U Taq酶(TaKaRa)。PCR
扩增条件为:94 ℃预变性4 min ,之后94 ℃变性30 s ,
48 ℃退火 30 s ,72 ℃延伸 1 min , 30个循环 , 72 ℃最
终延伸 10 min。PCR反应结束后 ,取 6 μL 扩增产物
在 0.8%琼脂糖凝胶上电泳 ,用全自动凝胶成像系统
(SYNGENE 公司)观察和分析电泳结果。
1.5　序列分析
对 PCR扩增获得的茄科雷尔氏菌 21 个株菌
16S-23S rDNA ITS 进行双向测序 ,以获得各菌株全
序列 ,并将这些序列分别与 19 个茄科雷尔氏菌菌
株 、2个 blo od disease bacte rium(BDB)菌株(表 2)
的 16S-23S rDNA ITS 进行比较分析 ,应用DNAstar
5.0软件构建系统发育树。
表 2　参与分析的茄科雷尔氏菌和 BDB菌株及
其 16S-23S rDNA ITS序列1)
细菌 菌株 生化变种 基因库登录号
R.solanacearum R651 Ⅰ AJ277768
R495 Ⅰ AJ277850
R133 Ⅰ AJ277848
R283 Ⅰ AJ277777
R367 Ⅰ AJ277849
R301 Ⅰ AJ277769
R285 Ⅰ AJ277852
NCPPB1331 Ⅱ AJ277770
R309 Ⅱ AJ277767
NCPPB2505 Ⅱ AJ277853
R576 Ⅱ AJ277854
R578 Ⅱ AJ277771
R583 Ⅱ AJ277772
GMI1000 Ⅲ NC003295
R276 Ⅲ AJ277856
R304 Ⅲ AJ277773
R294 Ⅳ AJ277774
R288 Ⅴ AJ277775
R292 Ⅴ AJ277776
BDB R223 - AJ277851
R780 - AJ277855
R.p icket t ii ΜLM005 - AM501943
　1)“ -” ,表示没有。
·38·
36 卷第 1 期 佘小漫等:12 种寄主来源的茄科雷尔氏菌 16S-23S rDNA间隔区序列比较
2　结果分析
2.1　PCR扩增 16S-23S rDNA ITS序列结果
应用原核生物通用引物 23r 和 1 493f分别对
21个茄科雷尔氏菌菌株进行 PCR扩增 ,其产物电
泳结果显示 ,从 21个菌株基因组 DNA 中均能成
功地扩增出约 590 bp特异片段 ,与预期片段大小
一致(图 1)。
图 1　PCR 扩增 21 个菌株 16S-23S rDNA ITS的产物电泳结果
2.2　16S-23S rDNA ITS序列分析结果
对 21个菌株 PCR产物进行双向测序 ,将测序
结果进行拼接 ,结果表明:除菌株 HZ-1扩增的片段
长度为 586 bp(GenBank 登录号:FJ744134)外 ,其
他 20个菌株扩增的片段大小均为 591 bp(GenBank
登录号见图 2)。去除两端 16S rDNA 和 23 rDNA
序列 ,菌株 HZ-1的 I TS序列长度为 498 bp ,其他 20
个菌株的 ITS 序列全长均为 503 bp 。
序列比较结果显示 , 21个菌株之间 I TS序列相
似性最高为100%,最低为 95.4%;菌株 HZ-1与 R.
solanacearum GM I1000的 16S-23S rDN A ITS序列
相似性为 95.8%, 而其他 20 个菌株序列与 R.
solanacearum GM I1000的 16S-23S rDN A ITS序列
相似性均大于 99.2%(表 3)。进一步比对发现 ,菌
株 HZ-1与其他 20个菌株分别有33 ～ 37 bp不等的
碱基差异;在其余 20个菌株中 ,菌株 DG-2 、HZ-2 、
GY-2 、RR-1 、RR-2 、NX-1 、NX-5 、PY-10 、GY0501 和
FC-1之间 ,菌株 GY-1 、LZ-3 、YC-33 、ZCZ-2 、MA 和
PC之间 ,以及菌株 YC-5 、CW-1和 CW-10之间 ,其
I TS序列均完全一致 ,其余菌株间也仅有 1 ～ 4个不
等的碱基差异。
根据 21个菌株以及来源于 GenBank的 22个
菌株(包括 P.pickett ii外围菌株)16S-23S rDNA
ITS ,利用 DNAstar 软件构建系统发育树 ,结果显
示:40个茄科雷尔氏菌株 、2个 BDB菌株共 42个
菌株可聚类为 3 个分支 ,其中第 1 分支包含了生化
变种 Ⅲ 、Ⅳ和Ⅴ菌株 ,对应于 Li等[ 7] 的茄科雷尔氏
菌区组 1;第 2 分支包含了生化变种 Ⅰ和 Ⅱ菌株 ,
对应于 Li等[ 7] 的茄科雷尔氏菌区组 2;两个 BDB
菌株自成一个分支 。本研究的 21 个菌株中 ,只有
菌株 HZ-1聚类在区组 2 ,其余 20个菌株聚类在区
组 1(图 2)。
表 3　21 株茄科雷尔氏菌 16S-23S rDNA ITS的序列相似性比较 %
ZCZ-2SSF-4 DG-2 LZ-3 GY-1 GY-2 RR-1 RR-2 NX-1 NX-5 PY-10 GY
0501
HZ-1 HZ-2PC-1-1CW-1CW-10YC-5 YC-33 PC MA GM I
1000
ZCZ-2 99.2 99.8 100 100 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 95.4 99.8 99.8 99.6 99.6 99.6 100 100 100 99.8
SSF-4 99.4 99.2 99.2 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 95.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.4 99.2 99.2 99.2 99.4
DG-2 99.8 99.8 100 100 100 100 100 100 100 95.6 100 100 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 100
LZ-3 100 99.8 95.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 95.4 99.8 99.8 99.6 99.6 99.6 100 100 100 99.8
GY-1 99.8 95.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 95.4 99.8 99.8 99.6 99.6 99.6 100 100 100 99.8
GY-2 100 100 100 100 100 100 95.6 100 100 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 100
RR-1 100 100 100 100 100 95.6 100 100 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 100
RR-2 100 100 100 100 95.6 100 100 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 100
NX-1 100 100 100 95.6 100 100 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 100
NX-5 100 100 95.6 100 100 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 100
·39·
2010
续表 3 %
ZCZ-2SSF-4 DG-2 LZ-3 GY-1 GY-2 RR-1 RR-2 NX-1 NX-5 PY-10 GY
0501
HZ-1 HZ-2PC-1-1CW-1CW-10YC-5 YC-33 PC MA GM I
1000
P Y-10 100 95.6 100 100 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 100
GY
0501
95.6 100 100 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 100
H Z-1 95.6 95.6 95.4 95.4 95.4 95.4 95.4 95.4 95.6
H Z-2 100 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 100
FC-1-1 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 99.8 100
CW-1 100 100 99.6 99.6 99.6 99.8
CW-10 100 99.6 99.6 99.6 99.8
YC-5 99.6 99.6 99.6 99.8
YC-33 100 100 99.8
PC 100 99.8
M A 99.8
GMI
1000
图 2　茄科雷尔氏菌及相关菌株的 16S-23S rDNA ITS系统发育树
·40·
36 卷第 1 期 佘小漫等:12 种寄主来源的茄科雷尔氏菌 16S-23S rDNA间隔区序列比较
3　讨论
16S-23S rDNA ITS 序列的进化速度是 16S
rDNA的 10 倍[ 19] ,该区间经常有序列的缺失和插
入 ,造成不同种和同种不同菌株的 16S-23S rDNA
ITS在数目 、长度和序列组成上的异质性。因此 ,在
细菌分类 、系统进化和分子特征等研究中 , 16S-23S
rDNA ITS序列分析具有重要价值。
本研究分析了来源于 12种寄主植物 21 株茄科
雷尔氏菌的 16S-23S rDNA ITS 全长序列 ,除菌株
HZ-1外 ,其余 20个菌株的序列长均为 503 bp ,序列
间相似性为 99.2%～ 100%;而 HZ-1菌株的序列长
为 498 bp , 与其他 20 个菌株间的序列相似性为
95.4%～ 95.6%。所有菌株 I TS 序列所包含的
tRNAala和 tRNAile 核苷酸序列完全一样 ,高度保
守。因此 ,来源于不同寄主植物的茄科雷尔氏菌菌
株间的 16S-23S rDNA ITS序列也十分保守。
本研究 21个菌株中 ,仅 HZ-1菌株属生化变种
Ⅱ ,并与已登录 GenBank的茄科雷尔氏菌生化变种
Ⅰ 、Ⅱ菌株聚类在区组 2分支中;而其余 20个菌株
分别属生化变种 Ⅲ和Ⅳ ,且与已登录 GenBank的茄
科雷尔氏菌生化变种 Ⅲ 、Ⅳ和Ⅴ各菌株聚类在区组
1分支中 。由此可见 ,茄科雷尔氏菌的生化变种与
区组间存在对应关系 。这与对 16S rDNA 分析结果
一致[ 16] 。茄科雷尔氏菌种内以及一些关系密切的
相关菌如 blood disease bacterium(BDB)的 16S
rRNA 基因的序列高度相似 ,有时也难以区分[ 8-9] 。
但利用 I TS 序列 , BDB 菌自成一个分支 ,可以将其
与茄科雷尔氏菌分开 。
对于分离自广东惠州马铃薯上的茄科雷尔氏菌
菌株 HZ-1 ,其 16S-23S rDNA ITS 与 HZ-2及其他
茄科雷尔氏菌菌株均存在较大差异 ,推测该菌株与
其他 20个菌株的起源不同。16S-23S rDNA ITS 系
统进化分析也支持这一推测 ,即 HZ-1 菌株属于茄
科雷尔氏菌区组 2 ,而其他 20个菌株均属于茄科雷
尔氏菌区组 1。但该菌株的真正起源及与其他菌株
间致病性差异等还有待于进一步研究。
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