全 文 ：第 30卷 第 4期
2009年 10月 　　　　　　　　　　
华南农业大学学报
JournalofSouthChinaAgriculturalUniversity　　 　　　　　　　　
Vol.30, No.4
Oct.2009
　收稿日期:2008-10-16
　作者简介:佘小漫(1981—), 女 ,硕士;通讯作者:何自福(1966—), 男 ,研究员 , 博士 , E-mail:hezf@gdppri.com
　基金项目:广东省自然科学基金(07006209);广东省科技计划项目(2006B20301036);广州市科技计划项目(2007J1-C0071)
广东茄科雷尔氏菌 16SrDNA序列分析
佘小漫1, 2 , 何自福 1 , 虞　皓1 , 李华平 2
(1广东省农业科学院 植物保护研究所 ,广东 广州 510640;2华南农业大学 资源环境学院 ,广东 广州 510642)
摘要:应用 PCR方法 ,获得了分离自广东番茄 、茄子 、辣椒 、烟草 、空心菜 、沙姜 、姜 、马铃薯 、花生 、菊花 、桑树和藿香
共 12种作物 21个茄科雷尔氏菌菌株的 16SrDNA.序列测定及比较结果表明 , 21个广东茄科雷尔氏菌菌株 16S
rDNA近全长序列均为 1 528 bp,序列间同源率 99.2% ～ 100%;各菌株的 16SrDNA序列间只有 1 ～ 12个不等的碱
基差异 , 其中 20个菌株的 458 ～ 460位及 474位的碱基是 ACT和 T,而菌株 HZ-1则是 TTC和 A,说明广东茄科雷尔
氏菌的 16SrDNA序列十分保守.系统进化分析结果显示 , 仅菌株 HZ-1聚类于茄科雷尔氏菌 2a亚组中 ,其余 20个
菌株均聚类于茄科雷尔氏菌区组 1中.
关键词:茄科雷尔氏菌;16SrDNA;序列分析
中图分类号:Q9681　　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-411X(2009)04-0024-05
TheSequenceAnalysisof16SrDNAofRalstonia
solanacearumfromGuangdong
SHEXiao-man1, 2 , HEZi-fu1 , YUHao1 , LIHua-ping2
(1 InstituteofPlantProtection, GuangdongAcademyofAgriculturalSciences, Guangzhou510640, China;
2 CollegeofResourcesandEnvironment, SouthChinaAgriculturalUniversity, Guangzhou510642, China)
Abstract:16SrRNAgenesoftwenty-onestrainsofRalstoniasolanacearumwereamplifiedbyPCR,
whichwereisolatedfromLycopersicumesculentum, Solanummelongana, Nicotianatabacum, Capsicum
annuum, Ipomoeaaquatica, Kaempferiagalangal, Zingiberoficinale, Solanumtuberosum, Arachishy-
pogaea, Dendranthemamorifolium, MorusalbaandHerbaagastaches, respectively.Alofthenearly
complete16SrRNAgenesequencesofthestrainsweredeterminedtobe1 528bp, andsequenceidentity
ofthe16SrDNArangedfrom99.2% to100%.Thenumberofdiferentbase-pairrangedfrom1to12
bpamong16SrDNA.Thespecificnucleotidesatpositions458-460 and474 of16SrDNAwereACT
andTrespectively, exceptthattheisolateHZ-1 wereTTCandA.Theresultsindicatedthatthe16S
rDNAsequencesofR.solanacearumfromGuangdongwerehighlyconserved.Phylogeneticanalysisof
16SrDNAsequencesshowedthatHZ-1clusteredtosubdivision2a, whileother20 isolatesclusteredto
division1.
Keywords:Ralstoniasolanacearum;16SrDNA;sequenceanalysis
　　茄科雷尔氏菌 Ralstoniasolanacearum是世界上
最重要的植物病原细菌之一 ,广泛分布于热带 、亚热
带及温带地区.该病原细菌的寄主范围很广 ,可侵染
55科数百种植物 [ 1] .我国目前已报道有番茄 、辣椒 、
茄子 、马铃薯 、烟草 、花生 、生姜 、沙姜 、桑 、空心菜和
桉树等 10余种作物受到该病原细菌的为害.
该病原细菌种内存在明显的分化.根据对不同
寄主植物种类的致病性不同 ,将该病原细菌划分为 5
个生理小种(Race)[ 2-4] ;而根据不同菌株对 3种二糖
和 3种己醇氧化能力的差异 ,可以将其划分为 6个
生化变种(Biovar)[ 3, 5-6] .另外 ,一些研究者还依据菌
株致病性差异 ,将其划分为不同致病型[ 7-8] .近年来 ,
一些学者应用不同的分子生物学方法进一步研究了
茄科雷尔氏菌 ,结果显示该病原细菌明显区分为 3
个地理组 ,即亚洲组 (Asiaticum)、美洲组(America-
num)和非洲亚组(Africansubdivision)[ 9-11] .因此 ,目
前分类意义上的茄科雷尔氏菌明显是一个复合种.
现代原核生物系统发育研究是基于 16SrRNA
序列分析 ,通过对茄科雷尔氏菌 16SrDNA的比较分
析 ,有可能了解该病原细菌种内系统进化.Li等[ 12]
通过对 16SrDNA序列分析发现 ,茄科雷尔氏菌可分
为 2个簇(或亚种),与 Cook等 [ 9]先前应用 RFLP方
法将茄科雷尔氏菌分为 2个区组(Division)相对应.
Taghavi等 [ 10]根据对 19个不同寄主和地理来源的茄
科雷尔氏菌菌株 16SrDNA序列分析 ,将区组 2分为
2a和 2b2个亚组;Pousier等 [ 11]通过对 31个菌株
16SrDNA序列分析 ,进一步将区组 2分为 2a、2b和
2c3个亚组.Vila等[ 13]将 68个菌株也聚类为与菌
株生化变种相关的 4个簇群 ,并分别对应于上述的
区组 1、2b、2a和 2c.本文通过对来源于 12种寄主植
物的茄科雷尔氏菌代表菌株 16SrDNA分析 ,探讨了
这些不同寄主来源菌株分子水平的异同 ,为进一步
认识该病原细菌提供参考.
1　材料与方法
1.1　供试菌株
供试菌株共 21株 ,分别分离自广东各地不同寄
主植物(表 1).所有菌株均在含 2, 3 , 5-氯化三苯基
四氮唑(TTC)平板培养基上 28 ℃培养 3 d.选取白
边宽中间粉红色的单菌落用于试验.
1.2　菌株基因组 DNA的提取
按 Boucher等 [ 14]方法提取各菌株基因组 DNA.
1.3　PCR引物
16SrDNA的 PCR扩 增 引 物 为:27f(5′-
AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和 1541r(5′-AAG-
GAGGTGATCCAGCCGCA-3′).上述引物均由上海生
工生物技术工程服务有限公司合成.
1.4　PCR扩增体系
以提取的基因组 DNA为模板进行扩增.PCR反
应体系(25μL)含如下成分:DNA模板约 20 ～ 25ng,
10×PCRbufer2.5 μL, dNTPs200 μmol/L, 2个引物
各 0.4μmol/L和 3UTaq酶(TaKaRa).PCR扩增条
件为:94 ℃预变性 4 min, 之后 94 ℃变性 1 min、
48 ℃退火 1 min、72 ℃延伸 2 min, 30个循环 , 72 ℃
最终延伸 10 min.PCR反应结束后 ,取 6 μL扩增产
物在 8g/L琼脂糖凝胶上电泳 ,用全自动凝胶成像系
统(SYNGENE)观察电泳结果.
表 1　供试的 21个茄科雷尔氏菌菌株 1)
Tab.1　Twenty-oneRalstoniasolanacearumstrainsusedin
thisstudy
菌株 采样地点 寄主　
生化
变种
基因库
登陆号
ZCZ-2 广州 番茄 Lycopersicumesculentum Ⅲ EF585132
SSF-4 佛山 番茄 Lycopersicumesculentum Ⅳ EF585133
DG-2 东莞 茄子 Solanummelongana Ⅳ EF585134
LZ-3 连州 茄子 Solanummelongana Ⅲ EF585135
GY-1 高要 辣椒 Capsicumannuum Ⅲ EF585136
GY-2 高要 辣椒 Capsicumannuum Ⅲ EF585137
RR-1 广州 花生 Arachishypogaea Ⅲ EF585138
RR-2 广州 花生 Arachishypogaea Ⅳ EF585139
NX-1 南雄 烟草 Nicotianatabacum Ⅲ EF585140
NX-5 南雄 烟草 Nicotianatabacum Ⅲ EF585141
PY-10 广州 空心菜 Ipomoeaaquatica Ⅳ EF585142
GY0501 高要 空心菜 Ipomoeaaquatica Ⅳ EF585143
HZ-1 惠州 马铃薯 Solanumtuberosum Ⅱ EF585144
HZ-2 惠州 马铃薯 Solanumtuberosum Ⅲ EF585145
FC-1-1 广州 菊花Dendranthemamorifolium Ⅳ EF585146
CW-1 阳春 姜 Zingiberoficinale Ⅳ EF585147
CW-10 阳春 姜 Zingiberoficinale Ⅳ EF585149
YC-5 阳春 沙姜 Kaempferiagalangal Ⅳ EF585150
YC-33 阳春 沙姜 Kaempferiagalangal Ⅲ EF585151
PC 阳春 藿香 Herbaagastaches Ⅲ EF585152
MA 阳春 桑树 Morusalba Ⅲ EF585153
　 1)21个菌株生化变种的确定参考文献 [ 15]
1.5　序列分析
对 PCR扩增获得的茄科雷尔氏菌各株菌 16S
rDNA进行双向测序 , 并将测定的 21个菌株 16S
rDNA序列 ,与已登陆 GenBank的茄科雷尔氏菌 38个
菌株 、与茄科雷尔氏菌密切相关的 Blooddiseasebac-
terium(BDB)4个菌株和皮氏假单胞菌(Pseudomonas
syzygi)2个菌株的 16SrDNA序列进行比较分析 ,应
用 DNAstar5.0软件构建系统发育树.
2　结果与分析
2.1　PCR扩增 16SrDNA结果
应用原核生物 16SrDNA通用引物 27f和 1541r
分别对 21个茄科雷尔氏菌菌株进行 PCR扩增 ,其产
物电泳结果显示 ,从 21个菌株基因组 DNA中均能
成功地扩增出约 1 530 bp特异片段 ,与预期片段大
小一致(图 1).
25　第 4期 　　　　　佘小漫等:广东茄科雷尔氏菌 16SrDNA序列分析 　　　
1:100bpLaddermarker, 2:SSF-4, 3:ZCZ-2, 4:LZ-3, 5:DG-2, 6:GY-1, 7:GY-2, 8:HZ-1, 9:HZ-2, 10:NX-1, 11:NX-5, 12:RR-1, 13:RR-2, 14:
GY0501, 15:PY10, 16:YC-5, 17:YC-33, 18:CW-1, 19:CW-10, 20:FC-1-1, 21:MA, 22:PC, 23:阴性对照
图 1　21个菌株 16SrDNAPCR扩增结果
Fig.1　Theamplificationresultsof16SrDNAgenesofRalstoniasolanaceaurm21 strainsbyPCR
2.2　茄科雷尔氏菌 16SrDNA序列测定结果
序列测定结果表明 , 21个菌株 16SrDNA近全长
序列均为 1 528bp,菌株间 16SrDNA同源率最高为
100%,最低为 99.2%(表 2),其中菌株 SSF-4、LZ-3、
GY-1、GY-2、NX-1、RR-1、RR-2、PY-10、YC-5、YC-33、
CW-1、FC-1-1、MA和 PC的 16SrDNA序列完全相
同 ,而其余菌株间 16SrDNA序列仅存在 1 ～ 12个碱
基差异;这些菌株与 R.solanacearumGMI1000的 16S
rDNA序列同源率也均大于 99.2%.
2.3　茄科雷尔氏菌 16SrDNA序列系统进化分析
结果
　　根据测定的 21个菌株 16SrDNA序列以及来源
于 GenBank的 46个菌株(包括 P.picketi和 R.eutro-
pha这 2个外围菌株)16SrDNA序列 ,利用 DNAstar
软件构建系统发育树.结果(图 2)显示 , 59个茄科雷
尔氏菌株 、4个 BDB菌株和 2个 P.syzygi菌株共 65
个菌株可聚类为 4个分支 ,其中第 1分支包含了生
化变种 Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ的菌株 ,对应于区组 1;第 2分支包
含了生化变种 N2及 BDB各菌株 ,对应于 2b亚组;
第 3分支包含了生化变种 Ⅰ 、Ⅱ和 N2的菌株 ,对应
于 2a亚组;第 4分支包含生化变种 Ⅰ中起源于非
洲的菌株 ,对应于 2c亚组.本研究的 21个菌株中
的 20个菌株聚类在区组 1 ,只有菌株 HZ-1聚类在
2a亚组.
表 2　21个茄科雷尔氏菌及菌株 GMI1000间 16SrDNA序列的同源率比较
Tab.2　Percentagesof16SrDNAsequencesidentitiesofRalstoniasolanacearum 21 strainsandstrainGMI1000 %
菌株 SSF-4ZCZ-2 DG-2 LZ-3 GY-1 GY-2 HZ-1 HZ-2 NX-1 NX-5 RR-1 RR-2 PY-10 GY0501 YC-5 YC-33 CW-1CW-10　FC-1-1 MA PC GMI1000
SSF-4 99.8 99.9 100 100 100 99.3 99.9 100 99.8 100 100 100 99.9 100 100 100 99.9 100 100 100 100
ZCZ-2 99.7 99.8 99.8 99.8 99.2 99.9 99.8 99.9 99.8 99.8 99.8 99.7 99.8 99.8 99.8 99.7 99.8 99.8 99.8 99.8
DG-2 99.9 99.9 99.9 99.2 99.9 99.9 99.7 99.9 99.9 99.9 100 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9
LZ-3 100 100 99.3 99.9 100 99.8 100 100 100 99.9 100 100 100 99.9 100 100 100 100
GY-1 100 99.3 99.9 100 99.8 100 100 100 99.9 100 100 100 99.9 100 100 100 100
GY-2 99.3 99.9 100 99.8 100 100 100 99.9 100 100 100 99.9 100 100 100 100
HZ-1 99.3 99.3 99.2 99.3 99.3 99.3 99.2 99.3 99.3 99.3 99.2 99.3 99.3 99.3 99.3
HZ-2 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9
NX-1 99.8 100 100 100 99.9 100 100 100 99.9 100 100 100 100
NX-5 99.8 99.8 99.8 99.7 99.8 99.8 99.8 99.7 99.8 99.8 99.8 99.8
RR-1 100 100 99.9 100 100 100 99.9 100 100 100 100
RR-2 100 99.9 100 100 100 99.9 100 100 100 100
PY-10 99.9 100 100 100 99.9 100 100 100 100
GY0501 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9
YC-5 100 100 99.9 100 100 100 100
YC-33 100 99.9 100 100 100 100
CW-1 99.9 100 100 100 100
CW-10 99.9 99.9 99.9 99.9
FC-1-1 100 100 100
MA 100 100
PC 100
GMI1000
26 　　 华　南　农　业　大　学　学　报　　　 第 30卷　
图 2　茄科雷尔氏菌及相关菌株的 16SrDNA系统发育树
Fig.2　Phylogenetictreeofthetested21strainsandother38strainsofRalstoniasolanacearum, 4 strainsofBDBand2strainsofPseudo-
monassyzygi, basedon16SrDNAsequencecomparisons
3　讨论与结论
16SrDNA在细菌种内相当保守 ,而种间某些区域
在一级结构水平上有显著差异 [ 15] .16SrDNA已作为
十分重要的分子指标 ,广泛地应用于细菌遗传特征 、鉴
定与分类等研究 [ 16-17] .茄科雷尔氏菌 16SrDNA全长
为 1 534 bp(GenBank登录号:NC003295)[ 18] ,虽然该
病原细菌是一个复合种 ,其种内不同寄主或不同地理
来源的株系间存在明显分化 ,但目前的研究结果显示
其 16SrDNA十分保守 [ 10, 12] .
Li等[ 12]和 Taghavi等 [ 10]等先后利用 PCR扩增获
得该病原细菌不同菌株 16SrDNA的部分序列 ,比较
结果表明其序列同源率在 99.1%以上;而 16SrDNA
序列的 458 ～ 460位点以及 474位点上的碱基可以作
为茄科雷尔氏菌 2个区组分类的依据 ,即区组 1在这
几个位点上的碱基是 ACT和 T,而区组 2为 TTC和
A;但区组 1中 ACH0732这个非典型菌株例外 ,其碱基
为 TCT和 G[ 10-11] .本研究也应用 PCR方法获得 12种
寄主植物来源的 21株茄科雷尔氏菌 16SrDNA近全长
序列(1 528 bp),除 HZ-1菌株外 ,其余 20个菌株间
16SrDNA序列间同源率为 99.7% ～ 100%(菌株间序
列变异碱基不超过 3个),而 HZ-1与其他菌株间 16S
rDNA序列间同源率为 99.2% ～ 99.3%(该菌株与其
他菌株间变异碱基 10 ～ 12个);可见 ,不同寄主来源的
茄科雷尔氏菌菌株的 16SrDNA序列高度保守.进一
步序列比较结果表明 ,除 HZ-1外 ,其余 20个菌株(均
27　第 4期 　　　　　佘小漫等:广东茄科雷尔氏菌 16SrDNA序列分析 　　　
聚类于区组 1)在 458 ～ 460位点的碱基为 ACT, 474位
点的碱基为 T;而菌株 HZ-1(聚类于区组 2)在相应位
点的碱基分别为 TTC和 A.因此 ,本研究结果进一步
支持了前人的结论[ 10-11] .
基于 16SrDNA的茄科雷尔氏菌系统发育树可将
茄科雷尔氏菌划分为区组 1(或亚洲组)和区组 2(或
美洲组),区组 2还可以再分为 2a、2b和 2c3个亚组 ,
且上述区组与菌株的生化变种相关 ,即区组 1主要包
括生化变种Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ, 2a亚组由生化变种Ⅰ(起源于美
洲的)、Ⅱ和 N2组成 , 2b亚组由生化变种 N2及 BDB菌
株组成 , 2c亚组由来源于非洲南部的生化变种Ⅰ组成;
但 ACH0732(生化变种Ⅱ)和 MAFF211266(生化变种Ⅰ)
这 2个非典型菌株例外 ,二者均属于区组 1[ 10-11] .本研
究 21个菌株中 ,仅菌株 HZ-1属生化变种Ⅱ,并聚类在
区组 2a中 ,而其余 20个菌株分别属生化变种Ⅲ和Ⅳ,
且均聚类在区组 1中 ,可见 ,在菌株生化变种与区组相
关性方面 ,本研究结果与前人[ 11]是一致的.但由于目
前分离的广东茄科雷尔氏菌主要是生化变种Ⅲ和Ⅳ,
关于其他生化变种及其遗传特征等还需要作更进一
步的研究.
对于分离自广东惠州马铃薯上的 HZ-1菌株 ,生
理生化特性(结果待发表)、16SrDNA序列比较及系
统发育分析均表明该菌株与其他菌株存在明显差异 ,
推测该菌株与其他 20个菌株的起源不同.由于广东马
铃薯种薯均是从北方调运来的 ,因此关于该菌株的真
正起源及与其他菌株间致病性差异等还有待于深入
研究.
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【责任编辑　周志红】
28 　　 华　南　农　业　大　学　学　报　　　 第 30卷