全 文 ：第 25 卷 第 9 期 干 旱 区 资 源 与 环 境 Vol． 25 No． 9
2011 年 9 月 Journal of Arid Land Resources and Environment Sep． 2011
文章编号:1003 － 7578(2011)09 － 106 － 04
内蒙古锡林郭勒天然草原禾本科牧草根际
18株固氮细菌的初步分类鉴定
*
郑红丽1，庞保平1，靳润岁2，樊明寿1
(1．内蒙古农业大学农学院，呼和浩特 010019，2 内蒙古土左旗多种经营站，土左旗 010010)
提 要:采用 16SrDNA测序方法对从内蒙古锡林郭勒天然草原四种主要禾本科牧草根际分离获得的 18
个固氮菌株进行属水平的鉴定，结果表明:其中 7 株属于土壤杆菌属(Agrobacterium)、3 株属于产碱菌属(Alcali-
genes)、1 株属于固氮菌属(Azotobacter)、1 株属于芽孢杆菌属(Bacillus)、3 株属于假单胞菌属(Pseudomonas)、2
株属于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas) ，1 株经 16SrDNA序列分析和 Biolog试验尚未找到与之相匹配的菌株，
可能是一个新种。
关键词:禾本科牧草;根际;固氮细菌;分类鉴定;16sDNA
中图分类号:S154． 3 文献标识码:A
内蒙古锡林郭勒草原是我国北方最具代表性的草原，退化面积达 41%［1］。作为植物生长发育必需的
有效氮素是植物最容易缺乏的要素，是植物生长发育过程中经常遇到的关键限制因子之一;氮的多寡直接
影响着草地生态系统第一生产力的高低，退化草原无一例外的表现为土壤氮素严重缺乏［2］。与农田相比
天然草地施用化肥难以实现，因此氮素输入途径主要为牲蓄粪便归还和生物固定。在天然草地，牲畜粪便
绝大多数被牧民焚烧作为取暖或炊事能源;因此生物固氮成为草地生态系统获取氮素的主要途径［3 － 4］，然
而对于内蒙古天然草地固氮细菌多样性研究尚属空白。
关于细菌分类鉴定最常用的方法是传统的经典分类法，即根据细胞的形态和结构以及生理生化性状
来进行分类鉴定，此法已沿用一百多年。但近年来，随着现代分子生物学理论和技术的迅速发展，特别是
作为生物技术里程碑的聚合酶链式反应(PCR)技术的出现，使细菌的分类和鉴定有了很大的发展，分类方
法越来越科学和精细，如质粒图谱分析(PP)、限制性片段长度多态分析(RFLP)、扩增片段长度多态分析
(AFLP)、脉冲场凝胶电泳分析(PFGE)、随机扩增 DNA 多态性分析(RAPD)和 16SrDNA 序列分析等。特
别是 16SrRNA序列分析的出现，使细菌进化可以通过试验研究来证实［5］。大量研究表明 16SrDNA 的同
源性分析最适用于属及属以上的亲缘关系［6］。因此，文中采用 16SrDNA测序的方法对分离获得的固氮活
性较高 18 个菌株进行属水平的鉴定。
1 材料与方法
1． 1 菌株来源
2005 － 2006 年以内蒙古锡林郭勒天然草原苏尼特右旗、阿巴嘎旗、锡林浩特、西乌珠穆沁 4 个旗市为
取样区，取羊草(Leymus chinensis)、冰草(Agropyrom cristatum)、大针茅(Stipa grandis)、及糙隐子草根际土
壤，采用稀释平板法进行固氮细菌的分离，通过对获得菌株形态学特征的观察及固氮酶活性的测定，筛选
出固氮活性较高且形态各异的菌株 18 株，分别命名 Yc1、Yc2……Yc7(羊草根际) ;Bc1、Bc2……Bc4(冰草
根际) ;Dzm1、Dzm2、Dzm3 和 Dzm4(大针茅根际) ;Cyz1、Cyz2 和 Cyz3(糙隐子草根际)。
* 收稿日期:2010 － 8 － 4。
基金项目:内蒙古自然科学基金(2009MS0303) ;国家自然科学基金(30560031) ;内蒙古农业大学博士基金项目(BJ07 － 12)资助。
作者简介:郑红丽(1966 －) ，女，博士，副教授，研究方向为农业微生物。
通讯作者:樊明寿 Email:fmswh@ yahoo． com． cn
DOI:10.13448/j.cnki.jalre.2011.09.018
1． 2 固氮菌 16S rDNA序列比对
1． 2． 1 小量 DNA提取的方法 － CTAB［7］
在 LB培养基上活化菌株，挑取单菌落接种于 20ml LB 培养液的三角瓶中，28℃振荡培养 36h。用 1．
5ml eppendorf管收集菌体。用 CTAB法提取菌株基因组 DNA。取 7 l DNA 样品，在 1%琼脂糖凝胶上低
压电泳，确定样品的浓度和纯度后，贮存于 4℃冰箱用于 PCR扩增。
1． 2． 2 16S rDNA 扩增所用的引物
根据 16SrDNA 两端的保守序列，设计一对细菌的通用引物，广州拓普基因技术有限公司提供。正向
引物 25f (5 － AAC TGA AGA GTT TGA TCC TGG CTC － 3) ，反向引物 1492r (5 － TAC CGT CTT AGG
ACT T －3)。
反应体系:10 × PCR Buffer(带 Mg2 +)5μl;50μM引物各 0． 5μl;10mM dNTP，1μl;Template，1μl;5U /μl
Taq polymerase，1μl;加水到，50μl。
以上试剂购于广州威佳科技有限公司。
PCR体系的反应条件:97℃预变性 5min，97℃变性 50s，56℃退火 45s，72℃延伸 80s，总共进行 35 个
循环，72℃延伸 5min。
测序所用引物为 35fc(5 － CTK AAG AGT TTG ATC MTG GCT CAG ATT GAA CG －3) ，342fc －(5 －
CTC CTA CGG GAG GCA －3)和 930fc(5 － GGT TAA AAC TYA AAK GAA TTG ACG GGG －3)。
1． 2． 3 检测
反应终止后，取 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并进行扫描拍照［8］。
1． 2． 4 序列测定
以提取的 DNA为模板扩增出 16S rDNA，经纯化后交广州拓普基因技术有限公司测序。通过 Internet
网(http:/ /www． ncbi． nlm． nih gov /blast． cgi) ，将所测序列与 GenBank 数据库中已报到的序列进行同源性
比较，找到最大相似性的菌株。
图 1 固氮菌 16SrDNA扩增电泳图
Fig． 1 Electrophoresis pattern of 16SrDNA ISR amplification
of azotobacter strains
M:Makers;1 － 7 泳道代表 Yc1，Yc2，……Yc7;8 － 11 泳道代表 Bc1，Bc2，……
Bc4;12 － 15 泳道代表 Dzm1，Dzm2，…… Dzm4;16 － 18 泳道代表 Cyz1，Cyz2 和
Cyz3．
M:Makers;Path 1 － 7stand for Yc1，Yc2……Yc7 respectively，Path 8 － 11are for
Bc1，Bc2，…… Bc4，Path 12 － 15 are for Dzm1，Dzm2，…… Dzm4，and path 16 － 18
are for Cyz1，Cyz2and Cyz3．
1． 3 Biolog试验
1． 3． 1 BUG + M 培养基的制备
称取 57 g BUG琼脂培养基、900 ml蒸
馏水，煮沸溶解，冷却后调整 pH值至 7． 3
+ 0． 1 (25℃) ，121℃灭菌 15 分钟，冷却
至 45 － 50℃，加 10mL已灭菌的 25%麦芽
糖倒平板。
1． 3． 2 GN /GP － IF 溶液的制备(用于鉴
定时配制菌悬液)
加 0． 2g Gellan Gum 至 1 升水中;煮
沸并持续搅拌，直至 Gellan Gum 完全溶
解;停止加热，加 4 g 0． 40%NaCl和 0． 3 g
0． 03%聚醚 F － 68，，搅拌至完全溶解后分
装到 20 x 150mm 的试管中，每管装 19mL
左右，在 121℃下灭菌 30 分钟。
1． 3． 3 步骤
菌株 Cyz1 在 BUG + M 培养基上活
化 16 － 24h。按照操作标准，将菌株 Cyz1
用 GN /GP － IF 接种液制成浓度为 28%，
静置 5min，接种在 Biolog 板上，接种时间
不能超过 20min，放在 30℃培养箱中培
养，在 24 小时内读结果，软件为 BiOLOG
MicroStation 4． 20。
以上材料均购于美国 Biolog公司。
·701·第 9 期 郑红丽等 内蒙古锡林郭勒天然草原禾本科牧草根际 18 株固氮细菌的初步分类鉴定
2 结果与分析
2． 1 固氮菌 DNA提取及 16SrDNA的 PCR扩增
用 1． 0%的琼脂糖凝胶对 18 株固
氮菌的 16S rDNA PCR 扩增产物做电泳
检测，所有菌株在 1500bp附近均有扩增
条带出现，并且亮度较大。固氮菌 16S
rDNA扩增产物回收纯化后的电泳图谱
(图 1)。
2． 2 固氮菌 16SrDNA的序列分析
PCR 产物经广州拓普基因技术有
限公司测序，测出的 18 个菌株的
16SrDNA基因序列对比结果(表 1)。
通过 Internet 网(http:/ /www． ncbi．
nlm． nih． gov /blast． cgi) ，用 Blast 软件将
18 个菌株的 16S rDNA 序列与 Genbank
中已知序列进行比较。结果表明，锡林
郭勒天然草地羊草根际土壤的固氮菌主
要分属于产碱菌属(Alcaligenes)、土壤杆
菌属(Agrobacterium)、固氮菌属(Azoto-
bacter)、芽孢杆菌属(bacillus)和假单胞
菌属(Pseudomonas)五个属，冰草根际土
表 1 18 株固氮细菌 16SrDNA序列相似性的比对
Tab． 1 Similarity of the 18 strains N fixing bacteria
序号 菌株 相关菌
相似度
(%)
1 Yc1 Alcaligenes faecalis (粪产碱菌) 99
2 Yc2 Agrobacterium radiobacter(放射性土壤杆菌) 100
3 Yc3 Agrobacterium tumefaciens(根癌土壤杆菌) 100
4 Yc4 Alcaligenes faecalis (粪产碱菌) 99
5 Yc5 Pseudomonas stutzeri(施氏假单胞菌) 99
6 Yc6 Azotobacter phaspali (雀稗固氮菌) 98
7 Yc7 Baclllus polymyxa(多粘芽孢杆菌) 99
8 Bc1 Pseudomonas stutzeri (施氏假单胞菌) 99
9 Bc2 Sphingomonas paucimobilis(少动鞘氨醇假单胞菌) 100
10 Bc3 Agrobacterium tumefaciens(根癌土壤杆菌) 99
11 Bc4 Agrobacterium tumefaciens (根癌土壤杆菌) 98
12 Dzm1 Pseudomonas stutzeri (施氏假单胞菌) 99
13 Dzm2 Agrobacterium tumefaciens(根癌土壤杆菌) 100
14 Dzm3 Agrobacterium tumefaciens(根癌土壤杆菌) 99
15 Dzm4 Alcaligenes faecalis (粪产碱菌) 98
16 Cyz1 Bacillus litoralis (沿海或耐热芽孢杆菌) 97
17 Cyz2 Sphingomonas paucimobilis(少动鞘胺醇假单孢菌) 99
18 Cyz3 Agrobacterium tumefaciens(根癌土壤杆菌) 98
图 2 株菌 Cyz1 的 Biolog试验结果
Fig． 2 The Biolog result of strain Cyz1
A4:糊精 (Dextrin) ;A10:N － 乙酰基 － D 半乳糖胺(N － Acetyl － D －
Galactosamine) ;B1:L －树胶醛糖(L － Arabinose) ;B3:熊果苷(Arbutin) ;
B4:D －纤维二糖(D － Cellobiose) ;B5:D －果糖(D － Fructose) ;B7:D －
半乳糖(D － Galactose) ;B10:D －葡萄糖酸(D － Gluconic Acid) ;C2:乳果
糖(Lactulose) ;C3:麦芽糖(Maltose) ;C4:麦芽三糖(Maltotriose) ;C6:D －
甘露糖(D － Mannose) ;C7:D －松三糖(D － Melezitose) ;C8:D － 蜜二糖
(D － Melibiose) ;D4:D －洛酮糖(D － Psicos) ;D7:D －核糖(D － Ribose) ;
D10:D －山梨醇(D － Sorbitol) ;D11:水苏糖(Stachyose) ;E4:木糖醇
(Xylitol) ;E6:醋酸(Acetic Acid) ;E11:α － 酮戊二酸(α － Ketoglutaric
Acid)F9:丙酮酸(Pyruvic Acid) ;G11:2，3 －丁二醇(2，3 － Butanediol)
注:图像的 96 个孔，代表阳性反应，○为阴性反应，代表边缘反应。
代表 biolog数据库中与所测菌株最相近的菌株该孔的反应为阳性。
壤存在鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、产碱菌
属(Alcaligenes)、土壤杆菌属(Agrobacterium)3 个
属的固氮菌，大针茅根际的固氮菌为产碱菌属
(Alcaligenes)、土壤杆菌属(Agrobacterium)和假单
胞菌属(Pseudomonas)的细菌，糙隐子草根际存
在鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和土壤杆菌
属(Agrobacterium)2 个属的固氮菌(表 1)。另外
从糙隐子草根际分离到的一株菌(Cyz1) ，其 16S
rDNA与已知菌沿海芽孢杆菌(Bacillus litoralis)
的同源性只有 97%，需做进一步的 biolog 试验和
其他检验［9 － 10］。
2． 3 固氮菌株 Cyz1 的 Biolog分析
将菌株 Cyz1 培养活化后，接种 Biolog板，培
养 24h 读数(图 2) ，结果表明 Cyz1 还没有已知
菌匹配，因此可能是一个新的菌株。
3 结论与讨论
采用 16S rDNA序列测定的方法与 Genbank
已知的菌株进行了比较，可以初步断定内蒙古锡
林郭勒天然草地 4 种禾本科牧草根际土壤的固
氮细菌主要分属于产碱菌属(Alcaligenes)、土壤
杆菌属(Agrobacterium)、固氮菌属(Azotobacter)、
芽孢杆菌属(bacillus)、假单胞菌属(Pseudo-
monas)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)六个
·801· 干 旱 区 资 源 与 环 境 第 25 卷
不同属。根据 16S rDNA序列和 Biolog试验结果目前还不能鉴定从糙隐子草根际分离到的菌株 Cyz1，这
一菌株可能是新种，有待进一步鉴定。
从 4 种禾本科牧草根际分离到的 18 株菌株中，7 株属于土壤杆菌属，说明该属中的固氮细菌广泛存
在于内蒙古天然草地，而且所研究的羊草、冰草、大针茅、糙隐子草根际均有土壤杆菌属的固氮细菌，因
此可以推断该属的固氮细菌与植物没有严格的选择性，或其生态适应性较强，这意味着筛选到固氮能力较
高的菌株，可以考虑在各种禾本科牧草上接种应用。
《伯杰细菌鉴定手册》第八版根据土壤杆菌不能固定空气中的游离氮而将土壤杆菌和根瘤菌分别列
为两个属。1990 年英国的 Sastry小组报道根癌土壤杆菌 B6 和 C58 具有自身固氮活性，文中的研究发现 4
种禾本科牧草根际普遍存在能够固氮的土壤杆菌，这进一步证实了 Sastry等的发现。
参考文献
［1］汪诗平，李永宏． 内蒙古典型草原退化机理的研究［J］． 应用生态学报，1999，10(4) :437 － 441．
［2］龙章富，刘世贵，葛绍荣，等． 退化草地土壤生化活性研究［J］． 草地学报，1994，2(2) :58 － 65．
［3］白可喻，韩建国，王培，等． 放牧强度对新麦草土壤氮素分配及季节动态的影响［J］． 草地学报，1999，7(4) :308 － 318．
［4］李香真，陈佐忠． 放牧草地生态系统中氮素的损失和管理气候与环境研究［J］． 草地学报，1997，5(3) :241 － 250．
［5］焦振泉，刘秀梅． 16SrRNA序列同源性分析与细菌系统分类鉴定［J］． 国外医学卫生学分册，1998，25(1) :12 － 16．
［6］东秀珠． 常见细菌鉴定手册［M］． 北京:科学出版社，2001．
［7］奥斯伯，R．布伦特编．精编分子生物学实验指南［M］．颜子颖，王海林，译．北京:科学出版社，1998:39 － 42．
［8］程光胜，朱厚础．分析微生物学专辑［M］．北京:科学出版社，1988:1 ～ 20．
［9］刘志恒，主编．现代微生物学［M］．北京:高等教育出版社，2000:19 ～ 69．
［10］傅君芬． 16 ～ 23s rDNA区间序列 －一种分类及鉴别细菌的新方法［J］．国外医学，1998，25(6) :245 ～ 249．
Primary identification of nitrogen fixation bacteria isolated from rhizosphere of
4 species of grasses in Xilingol Grassland of Inner Mongolia
ZHENG Hongli1，PANG Baoping1，JIN Runsui2，FAN Mingshou1
(1． College of Agronomy，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010019，P． R． China;
2． Multi Economy Management Station of Tuzuo county Inner Mongolia 010010，P． R． China)
Abstract:Eighteen strains of N Fixation bacteria were identified by using 16sDNA sequence analysis at species
level，which were isolated from rhizosphere of 4 species of gramineous grasses in Xilingol Grassland of Inner Mon-
golia． The results showed that 7strains of them belong to Agrobacterium，and there were 3 strains in Alcaligenes，3
strains in Pseudomonas，2 strains in Sphingomonas，1 strain each in Azotobacter and stran in Bacillus． One strain
of N fixation bacterium was not identified because there was not similiar16sDNA sequence in 16sDNA bank which
could fit it． Futher biolog analysis for the strain suggested it might be new species which need to test by using
whole DNA sequence．
Key words:gramineous grass;rhizosphere;N fixation bacteria;identification;16sDNA
·901·第 9 期 郑红丽等 内蒙古锡林郭勒天然草原禾本科牧草根际 18 株固氮细菌的初步分类鉴定