全 文 ：收稿日期:2006-05-10
基金项目:北京市科技新星计划项目资助(H01361003011)
作者简介:田兆丰(1966-),女 ,山西榆社人 ,副研究员 ,在读博士 ,主要从事植物病毒及其生物防治的研究。
藜科植物 S.L多糖抗病毒作用机理初步研究
田兆丰1 ,裘季燕1 ,刘伟成1 ,李永丹2 ,魏　荣3 ,曾燕舞4
(1.北京市农林科学院植保环保所 ,北京　100097;2.中国农业大学植物保护系 ,北京　100094;
3.中国林业大学 生物学院 ,北京　100094;4.北京市农林科学院农业科学技术信息所 ,北京　100097)
　　摘要:对从藜科植物中提取的 、具有诱导抗病毒作用的S.L多糖的作用机理做了初步的研究。首先将S.L多糖抽
提液喷施烟草 ,探究 S.L多糖诱导烟草对烟草花叶病毒(TMV)产生抗性的最佳时间。结果表明 ,用 S.L多糖诱导植株
产生的抗性在 5 d左右达到最大 , 5 d 之后抗病性随着时间的推移而减弱。在接种病毒前用 S.L多糖对烟草幼苗进行
喷施 , 然后于接种当天及接种后不同时间对各处理的同位等量叶片测定在总蛋白含量 、过氧化物酶活性及同工酶图
谱上的差异。研究发现 ,各处理的总蛋白含量均有所增加 , 且高于对照 , 并都于接种后的第 9 d 达到最大值。各处理
的过氧化物酶活性在接种病毒初期均高于对照 ,但 5 d后对照的酶活性超过处理 , 高峰较处理提前到来 , 且峰值略大
于处理。在同工酶谱上 ,病毒接种后 5 d ,处理的酶带比对照浓且多了 1 条。 5 d 之后 , 二者的酶谱变得基本相同。到
接种后 10 d测定 ,结果相反 , 对照比处理的酶带浓。
关键词:S.L多糖;TMV;诱导抗性
中图分类号:S476　　文献标识码:A　　文章编号:1000-7091(2006)05-0108-05
Preliminary Study on the Mechanism of Plant Resistance Inducement
Against TMV by the Chenopodiaceae Polysaccharide Extract
TIAN Zhao_feng1 , QIU Ji_yan1 , LIU Wei_cheng1 , LI Yong_dan2 , WEI Rong3 , ZENG Yan_wu4
(1.Institute of Plant and Environment Protection , Beijing Academy of Agriculture and Forestry
Sciences , Beijing　100097 , China;2.Department of Plant Protection , China Agriculture University ,
Beijing　100094 , China;3.Department of Biology , China Forestry University , Beijing　100094 , China
4.Institute of Information on Science and Technology of Agriculture ,Beijing Academy of Agriculture and Forestry
Sciences ,Beijing　100097 ,China)
Abstract:S.L belongs to Chenopodiaceae , its polysaccharide extract can induce the resistance of plant against to-
bacco mosaic virus(TMV).A preliminary research was made on the mechanism about the S.L_induced resistance to viral
infection in tobacco.It was investigated that how long the S.L_induced resistance will take in the plant which were treat-
ed by the polysaccharide extract at different time before inoculation.It is showed that the disease incidence index of the
plant treated by S.L extract was much lower than the control , and the disease incidence was reduced by 4.31% to 45.
75%.The best inducing effect was in 5 days later after the tobacco was treated by the polysaccharide.So , it can be in-
ferred that S.L_induced resistance reaches to the top in about 5 days.5 days later after the treatment , the resistance in-
duced by S.L polysaccharide becomes lower as time goes by.In further experiment , there were four groups of tobacco.
Three of the groups are treated by the extract respectively 5 , 3 ,1 days before inoculation , while the control was sprayed
just with water.Then , the total protein content , peroxidase activity and isoenzyme genealogy was compared between the
different treatments.The results showed there was no much difference among all groups of tobacco about the total protein
content.But the peroxidase of the three treated groups and the control went to a peak in different time after virus inocula-
华北农学报·2006 , 21(5):108-112
tion.The peroxidase of all the treated groups peaked 9 days later after inoculation , and the peak a little later and lower
than the control.Another , the isoenzyme genealogies analysis of different treatments indicated that S.L polysaccharide
can induce more isoenzyme expression much more earlier than the control.
Key words:Tobacco mosaic virus;Induce resistance;Protein content;Peroxidase;Isoenzyme
　　植物病毒病素有“植物癌症”之称。为了有效地
控制植物病毒 ,人们采用了各种措施 ,包括轮作 、种
子脱毒 、病毒间的弱毒株系交叉保护 、抗病品种的选
用 、传毒介体的控制及化学农药的使用等 。近年来
转基因植物抗病研究也有了新的进展。但这些措施
还不能有效克服病毒的为害 ,而且转基因植物对生
态及人类安全与否尚无定论。随着科学技术的发展
及人体和动物疫苗研究的巨大成功 ,一些研究者对
植物能否通过接种“疫苗”来实现对某些病害的免疫
产生极大兴趣 ,迅速发展起来的诱导抗性技术给植
物病害防治提供了一条新途径 ,这对于生产上缺乏
抗病品种的病害来说尤其重要 。近年来多糖研究异
军突起 ,学术界视多糖的研究为生命科学的前沿领
域 ,甚至提出 21世纪是多糖的世纪。多糖类物质是
所有生命有机体的重要组成部分 ,广泛存在于动物 、
植物和微生物细胞壁中 ,是生物体内除核酸和蛋白
质以外的又一类重要的生物分子 ,而且是一类重要
的信息分子。科学研究已经确认多糖类物质具有许
多生物活性 ,包括抗肿瘤 、免疫 、抗病毒[ 1～ 5]等 ,且无
毒副作用 。现在国际上多糖研究以日本 、美国 、德国
等国处于领先地位 ,我国多糖的研究起步较晚 ,且较
多集中在药用植物多糖和真菌多糖 ,而对于田间广
泛存在的杂草多糖却很少注意。S.L 多糖是由一种
田间广泛存在的藜科杂草 S.L 中筛选提取的抗病诱
导剂 ,它能激活植物的防卫系统 ,试验表明 ,其对烟
草花叶病毒有很强的钝化作用及诱导抗病作用 ,同
时作为一种糖类物质 ,完全能在自然界中降解 ,不污
染生态环境 ,外加其材料来源广泛 ,所以具有很好的
开发价值和应用前景 。另外 ,对高效无公害多糖类
农药抗病机理的研究 ,可以促进植物抗病表达机理
及诱导抗病理论的发展 ,具有重要的理论意义 。
1　材料和方法
1.1　材料
供试毒源:烟草花叶病毒粗提液 ,北京市农林科
学院植保环保研究所实验室保存。
供试植物:普通烟草 NC_83。
供试药剂:0.3%S.L多糖粉剂溶于 200倍的水
中备用。
所用仪器:分光光度计(UV_120_02型),离心机
(LD5_2A型),电泳仪(DYY_Ⅲ_11型三恒电泳仪)。
1.2　方法
1.2.1　抽提液喷施时间对防效的影响　选长势一
致 、苗龄 3 ～ 4片叶的普通烟草 105株 , 3次重复 ,每
个重复有 6个处理和 1个对照。分别对各处理在接
种前 16 ,11 ,8 ,5 ,2 , 1 d喷施 200倍的 S.L 粉剂。在
某处理喷施期间 ,其余处理喷清水 。采用常规的叶
液摩擦法接种 TMV ,接种后 20 d按病毒病害分级标
准进行病害调查 ,并计算防治效果 。
1.2.2　处理后烟草体内生理变化的研究　选长势
一致 、苗龄 2 ～ 3片叶的普通烟草 40株 ,设 3个处理
和 1个对照 ,每处理及对照各 10株 。在接种病毒前
5 ,3 ,1 d(分别称为处理 1 、处理 2 、处理 3)对各处理
以S.L 200倍抽提液喷施 ,对照喷清水 。以接种当
天为 0 d ,分别取接种病毒后 0 ,1 ,3 ,5 ,7 ,9 ,11 d时的
各处理同位等量叶片 0.5 g 进行测定。其中 0 d 的
样品为未接种病毒的样品。各不同处理的样品加入
3 mL Tris_HCl缓冲液(pH=6.0)快速在冰浴中碾磨 ,
然后 4 000 r/min离心 20 min ,上清液即为总蛋白及
过氧化物酶的粗提液。
1.2.2.1　抽提液处理后体内可溶性蛋白质及过氧
化物酶活性的变化 　总蛋白的测定:吸取上清液
0.05 mL ,再加入 5 mL 考马斯亮蓝 G_250 溶液 , 混
匀 ,在 595 nm下比色 ,测定吸光度 ,并通过用牛血清
白蛋白制备的标准曲线查出相应的蛋白质含量 。
酶活性的测定:在比色杯中加入 3 mL的反应液
(含 2.3 mL 0.05 mol/L 磷酸缓冲液 , 0.8 mL 2%
H2O2 ,0.8 mL愈创木酚),再吸取 0.08 mL 酶液加入
比色杯中 ,在 470 nm 波长下比色 ,每隔 30 s记录一
次吸光值 ,共记录 10次 ,然后绘制酶促反应的进程
曲线 ,并根据反应初速度计算酶的相对活性(以每分
钟内变化 0.01为一个酶活单位)。过氧化物酶活性
=■A470×VTW×VS×0.01×t (U/(g·min))。
1.2.2.2　过氧化物酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳
　过氧化物同工酶分析用吴少伯的方法[ 6]并稍加修
改 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳仅用分离胶 ,分离胶浓度
5期 田兆丰等:藜科植物 S.L多糖抗病毒作用机理初步研究 109　
8%。电泳后用抗坏血酸-联苯胺法染色 。
2　结果与分析
2.1　抽提液喷施处理后不同时间对防效的影响
　　表 1显示 , 200倍的 S.L 抽提液对烟草有一定
的诱导抗病性能 , 诱导防效范围为 14.25% ～
45.58%。其中接种前 5 d喷施药剂诱导效果最好。
推测 S.L对烟草诱导产生的抗性在喷施后 5 d左右
达到最大 。喷施 5 d后接种病毒的处理诱导所产生
的抗性随着时间的推移而减弱 ,而小于 5 d 喷施的
处理还来不及诱导到最大。
表 1　不同时间喷施处理的防效
Tab.1　Control effect of each treatment in different spray time
喷药后接种病毒的时间
Spray and inoculation time
重复
Repeat
病指
Desease index
防效(%)
Control effect
平均防效(%)
Average effect
喷施后 16 d 接种 1 8.68 15.32 14.25
Inoculation on 16th d after spray 2 6.78 11.72
3 7.03 15.71
喷施后 11 d 接种 1 8.78 14.34 16.44
Inoculation on 11th d after spray 2 6.33 17.58
3 6.89 17.39
喷施后 8 d 接种 1 8.00 21.95 21.75
Inoculation on 8th d after spray 2 5.93 22.79
3 6.63 20.50
喷施后 5 d 接种 1 5.45 46.83 45.58
Inoculation on 5th d after spray 2 4.56 40.63
3 4.23 49.28
喷施后 2 d 接种 1 8.02 21.76 21.77
Inoculation on 2th d after srpay 2 5.90 23.18
3 6.64 20.38
喷施后 1 d 接种
Inoculation on 1th d after spray
1 8.21 19.90 20.62
2 6.05 21.22
3 6.61 20.74
ck 1 10.25 - -
2 7.68 -
3 8.34 -
图 1　各个处理不同天数蛋白质含量变化
Fig.1　Total protein content of each treatment in different time
2.2　烟草用抽提液处理后体内生理变化
2.2.1　S.L 多糖对烟草总蛋白的影响　从图 1可
看出 ,接种病毒后 ,总蛋白的含量变化在各处理间没
有太大差异 ,它们都于接种后的第 9天达到了最大
值 ,其中 ,处理 1 , 2含量最大 ,对照中蛋白的含量相
对最低。
2.2.2　S.L 多糖对烟草过氧化物酶活性的影响　
由图 2可看出 ,烟草体内过氧化物酶活性随接种与
接种后的时间发生一系列变化。总体来说 ,3 个处
理变化趋势相对于对照来说较一致 ,接种前喷洒抽
提液 ,处理株的酶活性明显比对照高 。接种后 3 d ,
处理株酶活性仍然比对照高 ,5 d之后对照的酶活性
超过处理 ,并提前达到高峰 ,峰值高于处理 。这可能
与病毒在对照植株中的快速复制 、病毒浓度迅速增
大从而引起植物生理反应有关。
2.2.3　S.L 多糖对烟草过氧化物酶同工酶的影响
　图 3 是各处理在接种病毒第 2天时的过氧化物酶
同工酶谱 。过氧化物酶同工酶用联苯胺染色后 ,色
带出现的快慢及色带的浓淡与同工酶的量及活性成
正比 。由此可见 ,病毒接种后第 2天 , 3个处理比对
照浓且多一条微弱的酶带 。之后数日的测定发现 ,
接种 5 d后 ,二者的酶谱变得基本相同 ,到接种后 10
110　 华　北　农　学　报 21卷
d测定 ,出现相反结果 ,对照比处理的酶带浓但同工
酶谱带结果与图 3一致。由此可见 ,在对照中 ,病毒
浓度的迅速升高也刺激了植物的抗性反应 ,从而导
致其抗性相关酶量的升高 。
图 2　各个处理不同天数 POD活性的变化
Fig.2　POD activity of each treatment in different time
1, 2 , 3.分别为在接种病毒前 5 , 3 ,1 d以 S.L 200倍抽提液
喷施烟草;ck.喷清水处理
1 , 2 , 3.Spray tobacco in 5 ,3 or 1 d with S.L extract in 200
di lution before inoculation;ck.Spray with water
图 3　抽提液处理植株并接种病毒后烟草
过氧化物酶同工酶谱
Fig.3　The differences of eroxidase isoenzymes
among all treatments
3　讨论
从植物生理学观点来看 ,植物的抗病性是在形
态结构和生理生化等方面综合表现的结果 ,它是建
立在一系列物质代谢基础上的 ,关系到抗病性基因
通过酶蛋白的表达 ,即 ,它是通过抗病调控物质的产
生来实现的[ 7] 。从多糖抽提物处理植物后不同时间
产生不同作用效果来看 ,S.L 多糖所起的作用主要
是诱导植株产生对病毒的抗性 ,在本试验结果中 ,诱
导最佳时间为 5 d左右。诱导植物对病毒的抗性要
在病毒病发病以前适当的时间进行处理 ,诱导结果
表现为预防为主 ,治疗作用较小。
植株经抗病诱导后会产生一系列生理生化变
化。包括过氧化物酶 、多酚氧化酶 、苯丙氨酸解氨酶
等酶的活性升高[ 8] 。3个处理的酶活变化趋势相对
于对照来说较一致 ,病毒接种前喷洒抽提液后 ,处理
株的酶活性明显比对照高 ,但接种病毒后随着时间
的延长 ,对照的酶活性超过处理 ,并提前达到高峰 ,
峰值高于处理 ,这可能与病毒在对照植株中的快速
复制 、病毒浓度迅速增大从而引起植物生理反应有
关。另外 ,酶活性的高低与峰值到来的时间可能与
处理时的苗龄及试验温度有关。
同工酶蛋白是基因表达的产物 ,与细胞学形态 、
特征相比 ,数量上更丰富 ,受环境影响要小得多 ,能
更好地反映遗传多样性 ,因而被广泛应用于物种起
源和进化 、种质资源多样性及抗病性等重要性状的
标记和筛选。本试验所做的过氧化物酶的酶谱分析
旨在比较产生诱导抗性的各处理之间过氧化物同工
酶的差异情况 。诱导处理的前几日 ,各处理比对照
多一条酶带 ,之后 ,对照植物中也有同样的酶带出
现 ,浓度逐渐超过处理 ,这与过氧化物酶活的变化趋
势基本一致 ,说明对照植株中病毒浓度的迅速升高
可导致其抗性相关酶量的升高。
诱导产生抗性的另一原因是新蛋白的生成[ 9] ,
即病原相关蛋白 PRs(Pathogenesis_related proteins)。
PR蛋白在健康植物中不存在或表现微弱 ,而当植物
被病菌感染或抗病诱导后则迅速产生并积累 ,因此
PR蛋白很可能是植物对病原菌感染或相关诱导的
基本反应之一[ 10] 。PR蛋白在植物抗病中的作用目
前主要有 2种观点:①PRs的生成可能参与植物的
局部诱导抗性 ,这主要是从研究病毒感染的过程中
得出的。烟草花叶病毒(TMV)接种烟叶后 ,在起过
敏反应的抗性植株内 PR蛋白强烈增加[ 11] 。这说明
PR蛋白在过敏反应中起某种作用 。 ②PR蛋白参
与植物的系统诱导抗性 。Ross首先提出植物获得性
系统抗性 ,这种抗性在再次感染时 ,不仅对与初次感
染相同的病原菌表现出抗性 ,而且往往对其他类型
的病原菌也起作用。例如 ,TMV感染后诱导的烟草
系统抗性 ,不仅对 TMV 本身有作用 ,而且对其他无
关的病原菌如对烟草枯斑病毒(TNV)也有抗性。本
试验各处理的总蛋白在病毒接种后均有明显上升 ,
也印证了以上的的观点 。
5期 田兆丰等:藜科植物 S.L多糖抗病毒作用机理初步研究 111　
目前 ,植物诱导抗病的研究方兴未艾 ,其防病原
理主要是诱发植物本身潜在的抗病机能 ,即通过诱
导植物体某些代谢途径的变化 、合成酚类或合成植
物抗病毒素等抗菌物质以及组织学上的变化 ,达到
防止病菌侵染或抑制病菌扩展的目的。这种方法能
有效地防治病害而且不会产生环境污染 ,有利于维
持生态系统的平衡 ,具有重要的理论价值和广泛的
实际意义 。
参考文献:
[ 1] 　王岳五 , 张海波 , 史玉荣 , 等.甘草多糖 GPS 对病毒
的抑制作用[ J] .南开大学学报(自然科学), 2001 , 34
(2):126-128.
[ 2] 　王长云 , 管华诗.多糖抗病毒作用研究进展[ J] .生物
工程进展 , 2000 , 20(1):17-20.
[ 3] 　王　蓉 , 吴剑波.多糖生物活性的研究进展[ J] .国外
医药抗生素分册 , 2001 , 22(3):97-100.
[ 4] 　Mizuno T , Saito H , Nishitoba T , et al.Antitumor_active
substances from mushrooms[ J] .Food Reviews International ,
1995 , (11):23-61.
[ 5] 　Li F , Shi Y , Guan X , et al.Antivirus effect of polysaccha-
rides of brewer yeast in vitro[ J] .Zhongguo Zhong Yao Za
Zhi , 1998 , 23(3):171-173.
[ 6] 　吴少伯.植物组织中蛋白质及同工酶的聚丙烯酰胺盘
状电泳[ J] .植物生理学通讯 , 1979 ,(1):30-33.
[ 7] 　张志良.植物生理学实验指导[ M] .北京:高等教育出
版社 , 1992:143-144.
[ 8] 　李　靖 , 利容千 , 袁文静.黄瓜感染霜霉病菌叶片中
一些酶活性的变化[ J] .植物病理学报 , 1991 , 21(4):
277-283.
[ 9] 　江　山 , 韩熹莱 , 郭雪柳.抗植物病毒剂对烟草和甜
菜病程相关蛋白的诱导作用 [ J] .植物病理学报 ,
1995 , 25(3):243-246.
[ 10] 　Uritani I.Protein changes in diseased plants[ J] .Ann Rev
Phytopathology , 1971 , 9:211-234.
[ 11] 　杜良成 , 王　钧.病原相关蛋白及其在植物抗病中的
作用[ J] .植物生理学通讯 , 1990 ,(4):1-6.
欢迎订阅 2007年《特种经济动植物》
本刊为中国农业部主管 、中国农科院特产研究所主办的全国唯一的特种经济动植物专业性国家级科技
类期刊 ,全国邮发报刊重点推荐杂志。月刊 , 16开 48页 ,每月 10日出版 。欢迎订阅 、欢迎刊登广告 、欢迎投
稿。办刊宗旨:为科技兴农 、振兴农村经济 、农民科技致富服务 ,成为广大读者选项的好帮手 。报道内容:特
种经济动物和毛皮动物的饲养 、加工及疾病防治 ,特种经济植物的栽培 、加工 、病虫害防治 ,介绍特产农业新
技术 、新成果 、新品种 、新经验 、新信息。订阅方法:全国各地邮局(所)均可订阅 ,邮发代号 12-183 ,每期 4.0
元 ,全年 48.0元 。可随时从邮局汇款至编辑部订阅。
地　址:吉林省吉林市左家中国农科院特产研究所编辑部
邮　编:132109
联系人:刘鹏举
电　话:(0432)6513067　6513069(传真)
E_mail:tzjjdzw@126.com
112　 华　北　农　学　报 21卷