全 文 ：收稿日期：２０１２－１１－２９
基金项目：信阳师范学院博士科研启动基金项目
作者简介：刘慧娟（１９７７－），女，河南平顶山人，讲师，博士，主要从事植物分子生物学研究。Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕｈｕｉｊｕａｎ７７＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ
利用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定壳斗科
植物种质资源
刘慧娟，冯志国，李先文，彭 峰，袁红雨
（信阳师范学院 生命科学学院，河南 信阳４６４０００）
摘要：通过对５个壳斗科植物盐溶蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ）分析，为壳斗科植物的种质
资源鉴定提供科学依据。以栗属（板栗、锥栗、茅栗）和栎属（麻栎）５个壳斗科植物为试验材料，分
别提取种子内盐溶蛋白，并进行ＰＡＧＥ电泳检测。结果表明，茅栗（Ｃａｓｔａｎｅａ　ｓｅｇｕｉｎｉｉ　Ｄｏｄｅ）的盐
溶蛋白种类最丰富，有１９条，而麻栎（Ｑｕｅｒｃｕｓ　ａｃｕｔｉｓｓｉｍａ　Ｃａｒｒ）最少，有１１条。对每条谱带进行相
似性比较，发现茅栗与板栗（Ｃａｓｔａｎｅａ　ｍｏｌｌｉｓｓｉｍａ　Ｂｌ）的相似程度最高，其次是锥栗［Ｃａｓｔａｎｅａ　ｈｅｎｒ－
ｙｉ（Ｓｋａｎ）Ｒｅｈｄ．ｅｔ．Ｗｉｌｓ］和麻栎，再次是茅栗与锥栗，而板栗与麻栎的差异性最大。从而推断出它
们之间进化关系：麻栎→锥栗→茅栗→板栗。表明利用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ技术可用于鉴定壳斗科植物之
间的进化关系和亲缘关系。
关键词：盐溶蛋白；十二烷基硫酸纳－聚丙烯酰胺凝胶电泳；壳斗科；进化
中图分类号：Ｑ９４９．７　　文献标志码：Ａ　　文章编号：１００４－３２６８（２０１３）０７－０１１５－０３
Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅ　ｏｆ　Ｆａｇａｃｅａｅ
Ｐｌａｎｔｓ　ｂｙ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
ＬＩＵ　Ｈｕｉ－ｊｕａｎ，ＦＥＮＧ　Ｚｈｉ－ｇｕｏ，ＬＩ　Ｘｉａｎ－ｗｅｎ，ＰＥＮＧ　Ｆｅｎｇ，ＹＵＡＮ　Ｈｏｎｇ－ｙｕ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｘｉｎｙａｎｇ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｙａｎｇ　４６４０００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ｓａｌｔ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｆｉｖｅ　ｓａｍｐｌｅ　ｓｅｅｄｓ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ｐｌｙａｅｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃ－
ｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ（ＰＡＧＥ），ｔｏ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ｂａｓｉｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｒｅｓｏｕｒｃｅ　ｏｆ
Ｆａｇａｃｅａｅ．Ｕｓｉｎｇ　ｆｉｖｅ　ｓａｍｐｌｅ　ｓｅｅｄｓ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ｆｏｕｒ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ａｎｄ　ｔｗｏ　ｇｅｎｅｒａ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｆａｇａｃｅａｅ　ｐｌａｎｔｓ）
ａｓ　ｍａｔｅｒｉａｌ，ｔｈｅ　ｓａｌｔ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ａｎｄ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ．Ｔｈｅ
ｋｉｎｄｓ　ｏｆ　ｓａｌｔ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　Ｃａｓｔａｎｅａ　ｓｅｇｕｉｎｉｉ　Ｄｏｄｅ　ｗｅｒｅ　ｍｏｓｔ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ａｎｄ　ｈａｄ　１９ｓｔｒｉｐｓ，ｂｕｔ
Ｑｕｅｒｃｕｓ　ａｃｕｔｉｓｓｉｍａ　Ｃａｒｒ　ｏｎｌｙ　ｈａｄ　１１ｓｔｒｉｐｓ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔｒｉｐｓ　ｅａｃｈ　ｏｔｈｅｒ，ｔｈｅ　ｓｉｍｉｌａｒ　ｄｅｇｒｅｅ
ｗａｓ　ｈｉｇｈｅｓｔ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｃａｓｔａｎｅａ　ｓｅｇｕｉｎｉｉ　Ｄｏｄｅ　ａｎｄ　Ｃａｓｔａｎｅａ　ｍｏｌｌｉｓｓｉｍａ　Ｂｌ，ｆｏｌｏｗｅｄ　ｂｙ　Ｃａｓｔａｎｅａ
ｈｅｎｒｙｉ（Ｓｋａｎ）Ｒｅｈｄ．ｅｔ　Ｗｉｌｓ　ａｎｄ　Ｑｕｅｒｃｕｓ　ａｃｕｔｉｓｓｉｍａ　Ｃａｒｒ，Ｃａｓｔａｎｅａ　ｓｅｇｕｉｎｉｉ　Ｄｏｄｅ　ａｎｄ　Ｃａｓｔａｎｅａ
ｈｅｎｒｙｉ（Ｓｋａｎ）Ｒｅｈｄ．ｅｔ　Ｗｉｌｓ．Ｔｈｅ　ｇｒｅａｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｆｏｕｎｄ　ｂｅｔｗｅｅｎ　Ｃａｓｔａｎｅａ　ｍｏｌｌｉｓｓｉｍａ　Ｂｌ　ａｎｄ
Ｑｕｅｒｃｕｓ　ａｃｕｔｉｓｓｉｍａ　Ｃａｒｒ．Ｔｈｉｓ　ｇａｖｅ　ｔｈｅ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｒｅｌａｔｉｏｎ：Ｑｕｅｒｃｕｓ　ａｃｕｔｉｓｓｉｍａ　Ｃａｒｒ→Ｃａｓｔａｎｅａ
ｈｅｎｒｙｉ（Ｓｋａｎ）Ｒｅｈｄ．ｅｔ　Ｗｉｌｓ →Ｃａｓｔａｎｅａ　ｓｅｇｕｉｎｉｉ　Ｄｏｄｅ→Ｃａｓｔａｎｅａ　ｍｏｌｌｉｓｓｉｍａ　Ｂｌ．Ａｌｓｏ，ｔｈｉｓ
ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ｃｏｕｌｄ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｒｅｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｒｅｌａｔｉｏｎ　ａｍｏｎｇ　ｔｈｅ
Ｆａｇａｃｅａｅ　ｐｌａｎｔｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｓａｌｔ　ｓｏｌｕｂｌｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；Ｆａｇａｃｅａｅ；ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ
　　根据蛋白质的溶解性，通常将种子贮藏蛋白质
分为水溶蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白和碱（或酸）溶蛋
白［１］４类。植物种子内盐溶蛋白的种类很丰富，植
物基因即使发生微小的变化，可以明显地表现在种
子内蛋白质的差异上，根据这一原理，利用电泳技术
检测植物蛋白质的异质性，并以此作为分类、进化和
　河南农业科学，２０１３，４２（７）：１１５－１１７
　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｎａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
DOI:10.15933/j.cnki.1004-3268.2013.07.001
遗传研究的依据，已得到较广泛的应用［２］。
目前，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ技术在亚基水平上对特定蛋
白质的分析取得了较大的进展，其形成的蛋白质谱
带具有稳定性、均匀性和可加性，故在水稻［３］、玉
米［４］、小麦［５］、烟草［６］和花生［７］等多种作物的品种鉴
定方面取得了显著成效，同时也成为研究植物亲缘
关系的有效手段，但在壳斗科植物品种鉴定方面却
鲜有报道。本研究采用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳技术，对壳
斗科植物栗属（板栗、锥栗、茅栗）和栎属（麻栎）种子
进行盐溶蛋白分析，研究其进化关系并探讨此法在
植物进化方面研究的可行性。
１　材料和方法
１．１　材料与试剂
板栗（大红袍、油光栗）从市场上购得；锥栗、茅
栗和麻栎于２０１０年秋季在信阳师范学院对面的贤
山上采集。
盐溶蛋白提取液的配制：氯化钠５．８０ｇ、蔗糖
２００．００ｇ、甲基绿０．１５ｇ，用去离子水定容到１Ｌ，在
４℃条件下保存。试剂、药品均为进口分装或国产
分析纯。
１．２　试验方法
１．２．１　样品制备　取此５个品种的种子，剥去外种
皮和内种皮，保留其黄色（或淡黄色）的果实，各种样
品均称取１ｇ，加盐溶蛋白提取液１．５ｍＬ研磨匀浆，
混合，室温过夜，用１２　０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，温度
４℃，取上清液再离心１次。将上清液在去离子水中
用玻璃纸透析２４ｈ，换水３～４次，最后用０．５ｍＬ的
盐溶蛋白提取液将蛋白质沉淀溶解，４℃保存，备用。
１．２．２　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳　分别取样品２０μＬ加等量
的样品缓冲液混合，进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（浓缩胶３％、分离
胶１２％）电泳，用甲基绿作为指示剂，用４％的磺基水杨
酸蛋白固定液固定２０ｍｉｎ，用０．２５％考马斯亮蓝Ｒ２５０
染色，对洗脱后的凝胶进行扫描。重复３次。
１．３　计算方法
１．３．１　迁移率（Ｒｆ）的计算　Ｒｆ＝凝胶中盐溶蛋白
区带的迁移距离／凝胶中指示剂的迁移距离。
１．３．２　图谱的排序　根据蛋白质条带间的相似性，
按Ｎｅｉ氏公式计算品系间的遗传相似性系数（Ｃ），
Ｃ＝２Ｗ／（Ａ＋Ｂ）×１００％，其中，Ｃ为相似系数，即相
似值；Ｗ 为Ａ 和Ｂ 两样品相同的蛋白条带数；Ａ为
Ａ 样品的总蛋白条带数，Ｂ为Ｂ 样品的总蛋白条带
数。相异值＝１００－Ｃ。
２　结果与分析
栗属（板栗、锥栗、茅栗）和栎属（麻栎）的盐溶蛋
白可分出１９条带谱，其中茅栗的盐溶蛋白谱带最为
丰富，包含了其他几个品种的所有谱带类型；２个板
栗品种（大红袍、油光栗）的盐溶蛋白谱带有１７条，
锥栗有１３条，麻栎最少，只有１１条（图１，表１）。不
同样品之间的相似条带着色深浅存在差异，可能与
种与种，属与属之间的差异有很大的关系。相同条
件下，条带越宽表明蛋白质含量越高；着色越深说明
蛋白质活力越大，这些差异较直观地反映了不同品
种间的差异。
图１　大红袍（ａ）、油光栗（ｂ）、茅栗（ｃ）、麻栎（ｄ）和
锥栗（ｅ）的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱
表１　不同样品的盐溶蛋白的迁移率
品种
条带数／条
１　 ２　 ３　 ４　 ５　 ６　 ７　 ８　 ９　 １０　 １１　 １２　 １３　 １４　 １５　 １６　 １７　 １８　 １９
大红袍 ０．０２　０．０５　０．０７　０．０９　０．１１　０．１５　０．１８　０．２３　０．３２　０．３６ － ０．４１　０．４５　０．４９　０．５４ － ０．７８　０．８４　０．９０
油光栗 ０．０２　０．０５　０．０７　０．０９　０．１０　０．１５　０．１８　０．２３　０．３２　０．３５ － － ０．４５　０．４９　０．５６　０．５９　０．７７　０．８５　０．９１
茅栗 ０．０２　０．０５　０．０７　０．０９　０．１０　０．１５　０．１９　０．２４　０．３３　０．３７　０．３９　０．４２　０．４５　０．４８　０．５６　０．６０　０．７８　０．８４　０．９２
麻栎 ０．０２　０．０５　０．０７　０．０９　０．１１　０．１５ － － － － ０．３９　０．４１ － － ０．５４　０．６０　０．７７ － －
锥栗 ０．０２　０．０５　０．０７　０．０９　０．１０　０．１５　０．１７ － － ０．３６　０．４０　０．４４　０．４６ － ０．５５ － ０．７８ － －
　　大红袍和油光栗分别与茅栗、麻栎、锥栗３种之
间的相似值均是９４．４４、６４．２８和７３．３３，而大红袍
与油光栗之间的相似值为９４．１１（表２），说明大红袍
和油光栗与茅栗、麻栎、锥栗相比较而言是同一种植
物，这与事实上大红袍和油光栗同属于板栗种相吻
合。再从种间来看，板栗与茅栗之间的相似程度最
６１１ 河南农业科学 第４２卷　
大，亲缘关系最近，其次是锥栗，最不相似的是麻栎。
若仅考虑茅栗、麻栎、锥栗三者之间的相似性，则麻
栎与锥栗的相似值最大，为８３．３３，比麻栎与茅栗的
相似值（７３．３３）大得多，而茅栗与锥栗的相似值是
８１．２５，位于二者之间。据此可以推断出其进化关
系，即麻栎是最原始的，其次是锥栗，板栗从茅栗演
化而来的。四者的进化关系如图２。
表２　不同样品间的相似值和相异值 ％
品种 大红袍 油光栗 茅栗 麻栎 锥栗
大红袍 － ９４．１１　 ９４．４４　 ６４．２８　 ７３．３３
油光栗 ５．８９ － ９４．４４　 ６４．２８　 ７３．３３
茅栗 ５．５６　 ５．５６ － ７３．３３　 ８１．２５
麻栎 ３５．７２　 ３５．７２　 ２６．６７ － ８３．３３
锥栗 ２６．６７　 ２６．６７　 １８．７５　 １６．６７ －
　注：右上侧的数据为相似值（Ｃ），左下侧的是相异值（１００－Ｃ）。
图２　板栗（大红袍、油光栗）、茅栗、锥栗、麻栎
　　　之间的进化关系
３　讨论
蛋白质亚基的构成严格受基因控制，种子蛋白
具有遗传稳定性和种质特异性［８］，蛋白质是基因表
达的产物，可作为品种鉴定的依据［９］。根据这４种
２属的壳斗科植物果实发育情况来看，由壳斗杯形
包围到壳斗球形，由单生籽粒到多个籽粒，果实的直
径由１．５～２ｃｍ到４～６．５ｃｍ等，从低级到高级，从
简单到复杂都说明了这一进化关系是正确的。研究
表明，电泳谱带法是当前植物品种鉴定中最有效的
方法［１０］，具有准确可靠、经济简便和重演性好等特
点。用这种方法进行植物进化方面的研究具有一定
的可行性，可直接从电泳后的蛋白质图谱上区分蛋
白质分子量的异同，但是这些蛋白质的类型、功能及
其所对应的基因在基因图谱上的确切位置，都需要
预先知道的标准蛋白和基因图谱作对照，才能发挥
其更大的应用潜能。
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ｓｉｔｙ　ｉｎ　ｃｏｗｐｅａ［Ｖｉｇｎａ　ｕｎｇｕｉｃｕｌａｔａ（Ｌ．）Ｗａｌｐ．］ｖａｒｉｅ－
ｔｉｅｓ　ｄｅｔｅｒ－ｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ＡＲＡ　ａｎｄ　ＲＡＰＤ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ［Ｊ］．
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７１１　第７期 刘慧娟等：利用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定壳斗科植物种质资源