全 文 ：收稿日期:2014-07-14
基金项目:2010 年度中国科学院“西部之光”人才培养计划项目(Y229151211，Y129331211) ;国家自然科学基金(31070208) ;中国科学院
重点创新计划( (KSCX2-EW-J-26)
作者简介:雷天翔(1990-) ，男，在读硕士研究生，专业方向:生态学;E-mail:m15297090302@ 163. com。
* 通讯作者:周党卫，E-mail:dangweizhou@ sina. com。
三种茄科植物种子无菌苗繁殖体系的初建
雷天翔1，2，3，蔡晓剑4，周党卫1，2，3* ，李松龄4，王 环1，沈建伟1
(1. 中国科学院西北高原生物研究所，青海 西宁 810001;2. 中国科学院高原生物适应与进化重点实验室，
青海 西宁 810001;3. 中国科学院研究生院，北京 100049;4. 青海大学土壤肥料研究所，青海 西宁
810016)
摘要 目的:以马尿泡、山莨菪、天仙子的野生种子为材料，建立这三种茄科植物种子无菌苗繁殖体系，为开展
生物实验研究及其野生种质资源的保存提供了技术参考。方法:将野生种子经过不同因子(预处理赤霉素浓度、消
毒试剂、消毒时间、培养温度)的组合处理后点播在MS培养基上，以种子发芽率、污染率和成苗率为观测指标，探讨
不同因子对建立 3 种植物种子无菌苗繁殖体系的影响。结果:将野生种子用 400 ppm 赤霉素预处理 24 h 后，75%
酒精消毒 1 min，50%NaClO消毒 20 min，22 ℃暗培养待种子发芽后转入光照培养箱培养，能够有效地获得马尿泡、
山莨菪、天仙子的种子无菌苗。结论:初步建立马尿泡、山莨菪、天仙子种子无菌苗繁殖体系。
关键词 马尿泡;山莨菪;天仙子;种子无菌苗
中图分类号:Ｒ282. 2 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2015)03-0447-04
DOI:10. 13863 / j. issn1001-4454. 2015. 03. 005
马尿泡 Przewalskia tangutica Maxim. 、山莨菪
Anisodus tanguticus(Maxim. )Pasch. 、天仙子 Hyoscya-
mus niger L. 是生长在青藏高原海拔 3 200 ～ 5 000
m 的茄科天仙子亚族的不同属(马尿泡属、山莨菪
属、天仙子属)植物，这三种植物在孢粉学、胚胎学、
花器官发生、种子微形态方面具有一些相似的特征，
关系较近〔1-3〕。同时，这三种植物体内都含有东莨菪
碱(Scopolamine)、山莨菪碱(Anisodamine)、阿托品
(Atropine)等托烷类生物碱〔4，5〕。托烷类生物碱是
作用在反副交感神经系统的一类药物，具有解痉止
痛、消肿的功效，可用于治疗胃痛、胆绞痛、急慢性胃
肠炎、无名肿痛，也对中枢神经系统、心血管系统起
作用，外用可以治疗皮肤病，有很大的开发前景〔6〕。
目前，对于托烷类生物碱的生产方式主要包括化学
合成和从野生植物内提取，选用化学合成的方法存
在生产周期长、合成有效成分的产量较低，因此不能
作为一种十分经济的手段，而从野生植物中提取的
方法既破坏生态环境又造成植物资源的大量浪费而
濒临灭绝，更加不能满足日益增长的市场需求〔7〕。
目前，大量的研究多集中在通过对野生资源的驯化
种植和生物技术手段来生产生物碱。由于地域、气
候条件的限制，驯化种植野生资源的困难较大，而建
立在无菌基础上的细胞培养技术和发根培养技术相
比具有明显优势。
本研究以 3 种茄科植物马尿泡、山莨菪、天仙子
野生种子为材料，通过测定不同因子(预处理赤霉
素浓度、消毒试剂、消毒时间、培养温度)对建立无
菌苗繁殖体系的影响，以期探索出此三种植物的无
菌苗繁殖体系最佳组合，一方面可以与组织培养技
术相互配合来有效的保存种质资源;另一方面，可以
为通过生物技术手段(如细胞培养技术和发根培养
技术)提高生物碱产量的研究提供材料基础。
1 材料与方法
1. 1 材料 马尿泡种子(2013 年 9 月 16 日采自青
海省果洛州，海拔 4 200 m)、天仙子种子(2013 年 9
月 17 日采自青海省海北州海晏县，海拔 3 000 m)、
山莨菪种子(2013 年 9 月 8 日采自青海省海北藏族
自治州门源回族自治县，海拔 4 000 m)。
1. 2 方法 马尿泡无菌苗的获得:将不同因子设计
为 4因素 4水平的正交试验，见表 1。取马尿泡种子，
用自来水冲洗 3 次，弃用漂浮种子，然后按照正交表
对马尿泡种子做预处理后与 75%酒精配合消毒。将
处理好的种子点播在装有 30 mL MS 固体培养基的
150 mL三角瓶内，每瓶点播 5粒种子，重复 6次。
表 1 L16(4
5)正交试验因子水平表
水平
因素
A. 赤霉素
浓度 /ppm
B. KMnO4
浓度 /%
C．消毒时间
/min
D．培养温度
/℃
1 300 0. 05 5 18
2 400 0. 10 10 22
3 500 0. 15 15 26
4 600 0. 20 20 30
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最适消毒组合的筛选选择 3 种常用消毒试剂
(0. 1% HgCl2、20% NaClO、50% NaClO) ，分别按照
0. 1% HgCl2消毒 1、2、3、4、5 min，20% NaClO 消毒
20、25、30 min，50% NaClO 消毒 10、15、20 min 进行
完全随机组合，共计 11 个处理。将 400 ppm赤霉素
预处理的马尿泡种子用 75%酒精消毒 1 min后按照
实验设计进行消毒，然后点播在装有 30 mL MS 固
体培养基的 150 mL三角瓶内，每瓶点播 5 粒种子，
重复 6 次。
山莨菪、天仙子种子无菌苗的获得:分别将经过
400 ppm赤霉素处理 24 h 的山莨菪、天仙子种子用
75%酒精消毒 1 min，50% NaClO 消毒 10、15、20
min，无菌水冲洗 6 次，每次 3 min，然后点播在装有
30 mL MS 固体培养基的 150 mL 三角瓶内，每瓶点
播 5 粒种子，重复 6 次。
1. 3 培养条件 黑暗条件:温度为(22 ± 2)℃恒温
培养箱培养。光照条件:温度为(22 ± 2)℃，光照强
度为 3 000 Lx，12 h /d光照条件下培养。
1. 4 数据分析 发芽率 =发芽种子个数 /接种种
子总数 × 100%;污染率 =污染种子个数 /接种种子
总数 × 100%;成苗率 =发芽率 × X(注:当瓶内种子
有污染时，X =0;当瓶内种子无污染时，X =1)。
正交试验方差分析选用 DPS 3. 01 专业版进行
分析。
2 结果与分析
2. 1 不同因子对马尿泡种子发芽率的影响 无菌
条件下对种子发芽率的主要影响因子包括激素、消
毒种类、消毒时间以及培养温度。李华赐等〔8〕研究
表 2 不同因子对马尿泡种子发芽率的影响
处理
A. 赤霉素
浓度 /ppm
B. KMnO4
浓度 /%
C. 消毒时间
/min
D. 培养温度
/℃
发芽率 /%
重复一 重复二 重复三
平均
发芽率 /%
1 300 0. 05 5 18 70. 0 50. 0 70. 0 63. 33
2 300 0. 10 10 22 63. 6 63. 6 60. 9 62. 70
3 300 0. 15 15 26 70. 0 72. 7 63. 6 68. 77
4 300 0. 20 20 30 45. 5 41. 7 41. 7 42. 97
5 400 0. 05 10 26 48. 2 57. 3 88. 3 64. 60
6 400 0. 10 5 30 84. 6 70. 0 50. 0 68. 20
7 400 0. 15 20 18 70. 0 100. 0 54. 5 74. 83
8 400 0. 20 15 22 60. 0 70. 0 70. 0 66. 67
9 500 0. 05 15 30 78. 3 78. 3 62. 9 73. 17
10 500 0. 10 20 26 81. 8 66. 7 50. 0 66. 17
11 500 0. 15 5 22 55. 5 54. 5 56. 4 54. 47
12 500 0. 20 10 18 36. 4 18. 2 41. 7 32. 10
13 600 0. 05 20 22 76. 2 72. 9 78. 6 75. 90
14 600 0. 10 15 18 77. 8 72. 7 45. 5 65. 33
15 600 0. 15 10 30 50. 0 60. 0 60. 0 56. 67
16 600 0. 20 5 26 54. 5 60. 0 60. 0 58. 17
T1 713. 3 822. 9 680. 7 768. 2
T2 831. 0 787. 2 767. 2 599. 7
T3 735. 5 648. 2 821. 8 799. 6
T4 706. 8 782. 2 773. 1 723. 0
Ｒ 11. 85 19. 28 14. 47 6. 28
最优水平 A2 B1 C3 D2
表 3 不同因子对马尿泡种子发芽率影响的方差分析
变异来源 平方和 自由度 均方 F值 显著水平
A 978. 2939 3 326. 0979 2. 2561
B 2564. 6056 3 854. 8685 5. 9146 ＊＊
C 1379. 1156 3 459. 7052 3. 1805 *
D 342. 5156 3 114. 1718 0. 7899
误差 4625. 1333 32 144. 5354
注:F0. 05(3，32)= 2. 9，F0. 01(3，32)= 4. 46;* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01
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报道，马尿泡在自然条件下发芽率极低，仅为
1. 3%，赤霉素浸泡能够提高马尿泡和山莨菪种子在
自然条件下的发芽率，可分别提高至 80%、86%。
KMnO4是一种常见的消毒试剂，常用于花卉组织培
养的消毒。培养温度是影响种子萌发的条件之一，
如天仙子种子在 25 ℃条件下培养，发芽率最高，为
57. 6%〔9〕。通过对 4 种因素(赤霉素预处理浓度、
KMnO4浓度、消毒时间、培养温度)组合对马尿泡种
子发芽率的影响来初步确定主要因子，试验结果统
计见表 2。
正交试验方差分析结果如表 3 所示，KMnO4的
浓度对种子的发芽率有显著影响。当 KMnO4的浓
度为 0. 05%时，种子的发芽率最高，平均发芽率为
69. 25%。赤霉素处理有提高马尿泡种子发芽率的
作用，但 300 ～ 600 ppm 差异不显著，这与李华赐
等〔8〕的研究结果一致。由于预处理赤霉素浓度、消
毒时间、培养温度对马尿泡种子的发芽率影响不显
著，所以选用平均发芽率最高的水平作为最优水平，
形成的最优组合为 A2B1 C3 D2。本实验确定了预处
理赤霉素的最佳浓度为 400 ppm，培养温度为 22
℃，为后续实验提供了基础。
2. 2 不同消毒试剂、消毒时间对马尿泡种子无菌
苗繁殖的影响 实验发现，消毒剂不仅影响马尿泡
种子的萌发，更加影响种子的污染率。当 KMnO4 的
浓度为 0. 05% ～ 0. 20%时，马尿泡种子的污染率为
100%，不能形成无菌苗。因此，KMnO4 不是最适合
的消毒试剂，需重新对消毒试剂和消毒时间进行选
择。以 3 种常用消毒试剂(0. 1% HgCl2、20% Na-
ClO、50%NaClO)进行完全随机组合试验，测定马尿
泡种子发芽率以及成苗率，结果见图 1。
实验结果表明，选用 0. 1% HgCl2作为消毒试剂
对种子的发芽影响较大，随消毒时间的延长种子的
发芽率降低，消毒 5 min，种子的发芽率最低，平均发
芽率为0。NaClO对种子的发芽影响较小，种子的
图 1 不同消毒试剂、消毒时间对马尿泡
种子无菌苗繁殖的影响
发芽率基本保持在 85%以上，但是低浓度次氯酸钠
(20%NaClO)消毒不彻底，大量种子被污染，成苗率
为 0。只有高浓度次氯酸钠(50% NaClO)消毒 20
min时，种子的发芽率为 93. 33%，污染率为 0，成苗
率为 93. 33%，能够有效获得大量种子无菌苗。经
过多次重复试验，此方法获得马尿泡种子无菌苗的
成苗率都保持在 90%以上。
2. 3 50%NaClO消毒不同时间对山莨菪、天仙子、
马尿泡种子无菌苗繁殖的影响 消毒处理是获取无
菌苗的必需条件，但消毒的同时对植物体存在一定
的伤害。为了进一步摸清 NaClO 消毒时间对无菌
苗的影响，将 50%NaClO按消毒 10、15、20 min 处理
进行试验，统计试验结果见图 2。综合考虑，当消毒
时间为 20 min时，山莨菪种子的成苗率为 90%，天
仙子的种子成苗率为 83. 3%，马尿泡种子的成苗率
为 93. 3%，都达到了较高水平。但是，3 种植物种子
的萌发时间存在差异，天仙子种子的萌发时间最早，
在接种后的第 3 天萌发，而且发芽比较整齐。马尿
泡次之，种子萌发在接种后的 6 ～ 8 d，种子萌发持续
时间长。山莨菪种子的萌发时间较晚，接种后的第
6 天开始有种子萌发露白，但大量种子萌发在接种
后的第9 ～ 10天。实验中山莨菪和马尿泡种子的
图 2 50%NaClO消毒不同时间对山莨菪、天仙子、马尿泡种子无菌苗繁殖的影响
A. 发芽率 B. 污染率 C. 成苗率
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发芽时间较之李华赐等〔8〕报道在自然条件下种子
的萌发时间分别提前了 10 d和 13 d，种子的发芽率
也提高了 10%左右，由此可见，消除种子表面杂菌，
在组培条件下有利于种子发芽，这也可能为这 3 种
植物的大田种植提供了一种催芽手段，相关研究还
有待进一步进行。
3 讨论
3. 1 以上实验结果表明，马尿泡、山莨菪、天仙子
最适合的消毒剂是 50% NaClO，最适合的消毒时间
为 20 min。最终建立的 3 种植物种子无菌苗繁殖体
系为:取 3 种植物种子蒸馏水冲洗 3 次，遗弃漂浮种
子，400 ppm 赤霉素预处理 24 h，75%酒精消毒 1
min，无菌水冲洗 3 次，50%NaClO消毒 20 min，无菌
水冲洗 6 次，点播在 MS 固体培养基上，每瓶 5 粒，
22 ℃暗培养，种子发芽后转入光照培养箱培养，能
够获得 3 种植物种子无菌苗。
3. 2 马尿泡、山莨菪、天仙子是重要药用植物资
源。1980 年，肖培根等〔10〕对这几种植物的有效成
分的含量进行了测定，结果表明 3 种植物体内均含
有生物碱，其中马尿泡体内生物碱的含量最高，达
1. 2% ～2. 8%。随着生物碱合成途径的不断解析，
控制合成途径关键酶基因不断被克隆，利用植物反
应器和转基因技术高效生产生物碱取得了一定的发
展，而这些技术都是以各种植物的无菌苗为材
料〔11，12〕。
本实验建立了马尿泡、山莨菪、天仙子种子无菌
苗的繁殖体系，获得了生长健壮、长势一致的 3 种植
物的种子无菌苗，为马尿泡、山莨菪、天仙子通过生
物技术手段探索高效生产生物碱的新途径的研究提
供了材料基础，有效解决了这三种植物受地域、气候
生长条件限制而不能随时获得不同生长阶段材料进
行研究的问题，也有可能为这三种植物的种质资源
保存和利用提供新的繁殖途径。
参 考 文 献
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